Anda di halaman 1dari 5

Pada praktikum kali ini, dilakukan pengujian absorpsi asetosal secara in vitro

dengan menggunakan metode usus terbalik. Pengujian ini bertujuan untuk


melihat pengaruh pH terhadap absorpsi obat melalui saluran pencernaan secara
in vitro. Asetosal merupakan turunan salisilat yang sering digunakan sebagai
senyawa analgesik (penahan rasa sakit atau nyeri minor), antipiretik (terhadap
demam), dan anti inflamasi (peradangan) dan juga memiliki efek antikoagulan
untuk mencegah serangan jantung dengan rumus struktur sebagai berikut :

Struktur asetosal
Konsentrasi asetosal yang digunakan adalah sebesar 0,1M. Pembuatan asetosal
0,1 M dilakukan dengan menimbang sebanyak 0,18 gram asetosal kemudian
dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml dan dilarutkan dengan menggunakan
pelarut etanol karena menurut Farmakope Indonesia, asetosal agak sukar larut
dalam air, dan mudah larut dalam etanol(95%) P. Pembuatan asetosal ini
dilakukan secara kuantitatif karena akan digunakan untuk pembuatan kurva
baku dengan menggunakan spektrofotometri UV-VIS.
Asam asetil salisilat dapat dianalisis secara kuantitatif dengan spektrofotometer
UV-Visible karena berdasarkan strukturnya asam asetil salisilat memiliki gugus
kromofor benzena cincin aromatik yang dapat mengabsorpsi radiasi
elektromagnetik yang dihasilkan oleh spektrofotometer UV-Visible.
Untuk pembuatan kurva baku, dilakukan dengan membuat larutan asetosal
dengan lima seri konsentrasi. Pertama, dibuat larutan stok asam asetil salisilat
1000 ppm dalam pelarut etanol. Pelarut etanol digunakan agar kondisi
pengukuran sampel dengan baku adalah sama. Dibuat larutan dengan
konsentrasi bertingkat dengan melakukan pengenceran terhadap larutan stok
asam asetil salisilat, yaitu 120, 140, 160, 180 dan 200 ppm. Masing-masing
konsentrasi larutan tersebut diukur absorbansinya pada spektrofotometer UV-Vis.
Pengukuran absorbansi dari asetosal dengan spektrofotometer UV-Vis dilakukan
pada panjang gelombang maksimum karena pada panjang gelombang
maksimum, kepekaannya juga maksimum karena pada panjang gelombang
maksimum tersebut, perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi
adalah yang paling besar. Di sekitar panjang gelombang maksimum juga, bentuk
kurva absorbansi datar dan pada kondisi tersebut hukum Lambert Beer
terpenuhi. Selain itu, jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang
disebabkan oleh pemasangan ulang panjang gelombang akan kecil sekali ketika
digunakan panjang gelombang maksimul (Gholib, 2007). Panjang gelombang
maksimum yang didapat dari percobaan dan digunakan untuk pengukuran
asetosal adalah 297 nm.

Setelah kelima seri konsentrasi tersebut diukur absorbansinya, kemudian dibuat


kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi (sumbu y) dengan
konsentrasi (sumbu x).
Pada konsentrasi 120 ppm, absorbansi sampel rata-rata adalah 0,33067 , pada
konsentrasi 140 ppm, absorbansinya 0,3773 , pada konsentrasi 160 ppm,
absorbansi sampel 0,4626 , pada konsentrasi 180 ppm, absorbansi 0,5102 dan
pada konsentrasi 200 ppm, absorbansinya 0,5187. Dari data absorbansi dan
konsentrasi asetosal, didapatkan persamaan kurva yaitu :
y= 0,0025448 x + 0,032726
dimana y merupakan absorbansi dan x merupakan konsentrasi. Nilai r dari kurva
yaitu 0,970. Persamaan yang didapatkan dari kurva baku ini digunakan
selanjutnya dalam menghitung konsentrasi sampel.
Pada percobaan ini hewan percobaan yang digunakan adalah tikus putih jantan.
Tikus putih biasa digunakan dalam percobaan laboratorium karena mudah
dikembangbiakkan dan mudah dalam perawatannya, hewan ini juga memiliki
struktur anatomi fisiologi yang hampir sama dengan manusia. Sehingga hasil uji
yang dicobakan pada tikus putih yang menyangkut struktur fisiologi anatomi
dapat diaplikasikan pada manusia.
Sebelumnya, tikus percobaan dipuasakan dari makanan selama 20-24 jam, tapi
diberi minum air masak. Tujuan dari tikus dipuasakan agar tidak ada faktor
makanan lain yang mengganggu saat dilakukan percobaan serta untuk
mengosongkan lambung dan usus.
Lalu tikus dibunuh dengan eter. Eter biasa digunakan sebagai obat bius yang
diberikan melalui pernapasan. Kemudian dibuka perutnya di sepanjang linea
mediana (linea mediana adalah garis yang melintas tepat ditengah tubuh
dengan arah lintasan atas bawah/vertikal) dan usus dikeluarkan. Usus sepanjang
15 cm dibawah pilorus (pilorus adalah daerah atau bagian lambung bawah yang
berhubungan dengan bagian atas duodenum/usus duabelas jari) dibuang dan 20
cm dibawahnya dipotong untuk percobaan. Usus dibagi dua bagian sama
panjang, kemudian dibersihkan. Ujung dari potongan usus tersebut diikat dengan
benang, kemudian dengan menggunakan pinset kecil usus tersebut dibalik
secara perlahan agar usus tidak sobek, sehingga bagian mukosa terletak diluar.
Tujuan dari peletakan mukosa usus diluar karena ingin menyamakan
pengondisian seperti dalam tubuh manusia, dimana mukosa usus adalah bagian
yang lipofil, sehingga diharapkan nantinya akan dapat diukur seberapa besar
kadar zat aktif obat yang bersifat lipofil yang dapat diabsorpsi oleh mukosa usus.
Kanula dimasukkan ke ujung oral dari usus yang belum terikat. Usus diukur
dengan panjang efektif 7 cm yang sebelumnya diisi dengan cairan serosal 1,4 ml
yang terdiri dari larutan natrium klorida 0,9% b/v. Kantong usus yang sudah
berisi cairan serosal ini dimasukkan ke dalam tabung yang sudah berisi cairan
mukosal 75 ml (yang mengandung bahan obat yaitu asetosal) pada suhu 37C.
Kantong usus untuk kontrol dilakukan dengan cara yang sama, tetapi dengan
menggunakan cairan mukosal tanpa obat.

Selama percobaan berlangsung, seluruh bagian usus dijaga agar dapat terendam
dalam cairan mukosal dan selalu dialiri gas oksigen dengan kecepatan kira-kira
100 gelembung per menit.
Pada waktu tertentu kadar obat dalam cairan serosal ditentukan. Untuk
penentuan ini seluruh cairan serosal diambil melalui kanula dan segera dicuci
dengan larutan 0,9% b/v natrium klorida, kemudian diisi lagi dengan 1,4 ml
larutan 0,9% b/v natrium klorida.
Usus tikus yang telah didapatkan direndam dalam larutan NaCl fisiologis 0,9%
yang bersifat isotonis agar tidak kering dan rusak. Kemudian usus dipotong 20
cm dari bagian ujung dekat pilori (lambung) untuk dibuang, dan diambil 7 cm
dari sisa usus untuk dibersihkan lalu dibalik sehingga bagian dalam usus berada
diluar dan bagian luar usus berada didalam dengan pinset. Usus harus dibalik
karena percobaan ini bertujuan untuk mengetahui kadar absorpsi obat oleh filia
bagian dalam usus pada perbedaan pH yang diatur sesuai pH lambung dan pH
usus secara in vitro (menggunakan instrumen yang menyerupai bagian dalam
tubuh).
Setelah itu, salah satu ujung usus disambungkan ke pipa B pada instrument
modifikasi crane&Wilson dan diikat dengan benang agar tidak mudah lepas
sehingga instrument tersebut menjadi seperti gambar dibawah ini :

Kemudian, ujung usus yang lain diikat dengan benang dan dikaitkan ke
ujung pipa C, lalu larutan NaCl fisiologis dimasukkan kedalam usus sebanyak 1,4
ml melalui pipa B agar usus tetap basah dan tidak rusak, digunakan larutan NaCl
fisiologis yang isotonis karena menyerupai cairan tubuh tikus/ mamalia.
Selanjutnya, kedalam tabung instrument dimasukkan larutan dapar pH 1,2
melalui pipa A sebanyak 75 ml menggunakan syringe, larutan dibuat pada pH
1,2 agar menyerupai kondisi dalam lambung tikus/ mamalia. Instument
dipanaskan diatas water bath hingga mencapai suhu 37oC agar menyerupai
suhu didalam tubuh tikus/ mamalia. Larutan asam salisilat 0,01 M kemudian
dimasukkan sebanyak 10 ml melalui pipa A kedalam larutan dapar sehingga
bercampur dan didiamkan dengan selalu diberikan oksigen melalui pipa C.
Oksigen diberikan agar sel-sel usus tetap hidup. Setiap 5 menit, larutan NaCl
fisiologis didalam usus diambil melalui pipa B menggunakan syringe dan
dimasukkan kedalam vial yang telah diberi label, kemudian diganti dengan 1,4
ml larutan NaCl fisiologis yang baru. Hal ini dilakukan sampai 15 menit
berlangsung. Larutan NaCl fisiologis diambil dari usus setiap rentang waktu 5
menit karena akan dihitung kadar asam salisilat yang terabsorpsi melalui filia
usus dan masuk kedalam larutan untuk mengetahui absoprsi optimal dari asam
salisilat pada perbedaan pengaturan pH yang disesuaikan kondisi dalam tubuh
mamalia.

Percobaan ini juga dilakukan dengan tabung instrumen diisi larutan


dapar pH 7,4 yang disesuaikan dengan kondisi didalam usus, dengan
ditambahkan pula 10 ml larutan asam salisilat 0,01 M. Kemudian dilakukan
percobaan control negatif dengan prosedur yang sama menggunakan larutan
dapar pH 1,2 dan pH 7,4 tanpa ditambahkan obat. Setelah itu, semua vial yang
telah berisi larutan NaCl fisiologis diberi perlakuan awal untuk dianalisis
menngunakan spektrofotometer UV.
Setelah dilakukan pengambilan cuplikan dari setiap rentang waktu 5 menit(5, 10
dan 15 menit) pada masing-masing pH 1,2 dan 7,4 dari masing-masing tabung,
maka masing-masing cuplikan tersebut dianalisis menggunakan spektrofotometri
UV untuk menetapkan konsentrasi asetosal selama proses absorpsi di dalam
usus hewan percobaan. Adapun panjang gelombang maksimum yang digunakan
adalah 274 nm. Alasan memilih panjang gelombang maksimum adalah karena
panjang gelombang maksimum memiliki kepekaan maksimal karena terjadi
perubahan absorbansi yang paling besar dan pada panjang gelombang
maksimum, bentuk kurva absorbansi terhadap konsentrasi memenuhi hukum
Lambert-Beer. Sebelum dianalisis, masing-masing cuplikan dilarutkan kedalam
larutan barium hidroksida 0,3 N dan sengsulfat 5% ( 5 gram dalam 100 ml).
Fungsi barium hidroksida dan sengsulfat adalah untuk mengekstraksi asetosal
dan memisahkan asetosal dari senyawa-senyawa lain yang mungkin terikut,
sehingga hanya asetosal yang akan dianalisis menggunakan spektrofotometri
UV. Pertama-tama harus dibuat larutan barium hidroksida 0,3 N dan sengsulfat
5%. Barium hidroksida (Ba(OH)2.8H2O) ditimbang sebanyak 4,732 gram,
diperoleh dari rumus berikut:

(BM= 315,47) (FI IV, 1995 hal 1137) dan dilarutkan kedalam air panas sebanyak
100 ml. Sedangkan sengsulfat (ZnSO4. H2O) ditimbang sebanyak 5 gram dan
dilarutkan kedalam 100 ml air (BM= 179,46) (FI IV, 1995 hal 836). Barium
hidroksida agak sukar larut dalam air dingin, sehingga butuh pemanasan untuk
melarutkannya, namun pada saat percobaan, barium hidroksida masih belum
larut sempurna sekalipun dilarutkan dalam air panas sambil dipanaskan,
sedangkan sengsulfat sangat larut dalam air. Setelah itu, sebanyak 2 ml dari
larutan barium hidroksida dan 2 ml sengsulfat dicampurkan kedalam masingmasing 1 ml cuplikan, kemudian campuran larutan tersebut disentrifugasi untuk
memisahkan endapan dengan filtratnya. Dimana filtrat yang berupa cairan jernih
tersebut yang mengandung asetosal.Pada saat sentrifugasi, campuran larutan
tersebut dimasukkan kedalam tabung sentrifugasi lalu tabungnya ditempatkan
kedalam alat sentrifugasi secara berseberangan dan dengan jumlah yang sama,
setelah itu diatur kecepatan pemutarannya, yaitu 3000 RPM (Revolutions Per
Minute) (angka 30 dilayar dikali faktor pengali 100) selama 10 menit.Hasil
sentrifugasi berupa larutan jernih di bagian atas dan endapan di bagian bawah.
Bagian atas yang berupa larutan jernih diambil menggunakan pipet dan
dimasukkan kedalam kuvet. Sebelum sampel diukur, alat spektrofotometer

terlebih dahulu di-reference kedalam panjang gelombang yang sesuai


menggunakan blanko yaitu blanko dari pH 1,2 dan 7,4 pada waktu = 0 menit.
Selanjutnya masing-masing sampel cuplikan diukur absorbansinya. Adapun
jumlah cuplikan yang diukur ada 6 buah (3 buah cuplikan (pada pengambilan 5,
10 dan 15 menit) pada pH 1,2dan 3 buah cuplikan dari pH 7,4. Absorbansi yang
diperoleh dicatat.
Berdasarkan data pengamatan, nilai absorbansi yang didapatkan tidak sesuai
dengan hukum Lambert Beer, yaitu konsentrasi yang baik itu berada di rentang
absorbansi 0,2-0,8 yang terdeteksi dengan spektro UV. Pada saat pengukuran,
nilai absorbansi yang diperoleh yaitu kebanyakan bernilai minus yaitu pada pH
1,2: -0,0096 (15 menit), sedangkan pada pH 7,4: -1,164600 (5 menit), -1,2372
(10 menit) dan -1,0886 (15 menit), artinya larutan yang dianalisis tidak terbaca
serapannya oleh alat spektrofotometer UV. Dan ada 2 nilai absorbansi yang
bernilai positif yaitu pada pH 1,2 : 0,0633 (5 menit) dan 0,1757 (10 menit)
namun nilai absorbansi ini tetap tidak memenuhi hukum Lambert Beer yaitu
rentang absorbansi yang diizinkan adalah 0,2-0,8. Hal ini terjadi karena
kemungkinan waktu yang tidak cukup bagi obat asetosal untuk terabsorpsi.
Kemungkinan asetosal akan terabsorpsi pada rentang waktu setelah 15 menit.
Hasil absorbansi dimasukkan kedalam perhitungan untuk mencari
konsentrasinya. Nilai absorbansinya dimasukkan kedalam persamaan regresi
linier dari kurva baku asetosal. Dari data pengamatan terlihat bahwa data yang
didapatkan tersebut menyimpang dari yang seharusnya, misalnya seperti, hasil
absorbansi yang dihasilkan sangat aneh, nilai absorbansinya menurun pada
pertambahan waktu. Seharusnya semakin lama, maka absorbansinya semakin
tinggi, karena seharusnya semakin banyak obat yang terabsorpsi. Namun data
nilai absorbansi yang dihasilkan pada pH 1,2 lebih tinggi dibandingkan dengan
pada pH 7,4 itu adalah benar dan sesuai dengan teori, yaitu bahwa suatu obat
yang bersifat asam akan terabsorpsi optimum di pH asam (lambung) dan obat
yang bersifat basa terabsorpsi optimum di pH basa(usus). Pada percobaan kali
ini, senyawa obat yang digunakan adalah asetosal (asam asetil salisilat), dimana
senyawa obat ini bersifat asam, sehingga obat ini akan terabsorpsi optimum di
pH asam. Setelah dilakukan perhitungan konsentrasi berdasarkan persamaan
regresi linier dari kurva baku asetosal, maka data-data absorbansi dan
konsentrasi di plotkan kedalam grafik. Di mana sumbu-x nya adalah waktu dan
sumbu y nya adalah konsentrasi. Jadi grafik yang terbentuk adalah grafik
konsentrasi terhadap waktu. Dari grafik terlihat bahwa, pada pH 1,2 konsentrasi
paling tinggi adalah pada waktu ke-10 menit, sedangkan pada pH 7,4
konsentrasi paling tinggi pada waktu ke -15 menit.