Anda di halaman 1dari 7

pembahasan pemantauan kolom dengan metode KLT

pembahasan
Pada praktikum kali ini dilakukan percobaan pemantauan kolom dengan
metode KLT

tujuan dilakukan pemantauan yaitu untuk menentukan jumlah

komponen dalam campuran, menentukan identitas anatara dua campuran dan


memonitor perkembangan reaksi. Dasar pemisahan pada KLT adalah perbedaan
kecepatan migrasi diantara fase diam yang berupa padatan dan fase gerak berupa
campuran solvetn atau pelarut (eluen) yang jua dikenal dengan pistilah pelarut
pengembang campur. Adapun fase diam yang digunakan pada praktikum ini
adalah menggunakan campuran butanol, asam asetat dan air dengan perbandingan
4 : 2 : 1 selain menggunakan campuran tersebut dilakukan pula elusi dengan eluen
yang berbeda menggunakan n-butanol dan etanol dengan perbandingan 3 : 1
larutan n-butanol digunakan untuk menarik senyawa yang semi polar sedangkan
etanol untuk menarik senyawa yang polar.
Tahap yang digunakan yaitu
1.
2.
3.
4.

Persiapan plat
Pembuatan eluen
Persiapan chamber
Penotolan dan pengembangan
Plat yang digunakan adalah silika gel Gf 254 lapis tipis atau penyangga
terdiri dari plat (kaca, aluminium, plastik) dan adsorben (silika gel,
alumina, selulosa, dll). Silika gel dapat membentuk ikatan hidrogen di
permukaanya karena pada permukaannya terikat gugus gidroksil. Oleh
karena itu silika gel sifatnya sangat polar. Sebelum digunakan proses KLT,

plat harus di keringkan dulu di dalam oven agar plat bebas dari molekulmolekul air yang terikat. Jumlah air yang terikat tersebut sangat
berpengaruh pada pemisahan karena air terikat sangat kuat pada adsorben
sehigga menghambat terjadinya kesetimbangan dengan molekul-molekul
analit. Selain itu plat juga tidak boleh rusak agar warna pada sampel dapat
terpisah dengan baik. Setelah plat diaktivasi di dalam oven plat di ambil
dengan menggunakan pinset dan meletakkannya di atas kaca yang
sebelumnya telah di bersihkan dengan alkohol. Alasan menggunakan
pinset karena lebih efektif dari pada menggunakan tangan langsung
karena, dikhawatirkan tangan berkeringat sehingga dapat menambahkan
jumlah air pada plat. Selanjutnya plat diberi tanda garis dan titik untuk
proses penotolan dan elusi.
Pada pemilihan eluen tergantung dari jenis analit yang akan
dipisahkan. Eluen yang menyebabakan seluruh noda yang ditotolkan pada
plat naik sampai batas atas plat (solvent Fron) tanpa mengalami pemisahan
berarti eluen terlalu polar. Sebaliknya jika noda yang ditotolkan pada palt
sama sekali tidak bergerak berarti eluen kurang polar. Semakin dekat
kepolaran antara sampel dan eluen maka sampel akan semakin terbawa
oleh fase gerak tersebut.
Sebelum dilakukan pengembangan chamber dijenuhkan terlebih
dahulu karena ketika fase gerak mulai naik ke fase diam sedapat mungkin
tidak ada penghalang atau gangguan. Jika chamber tidak jenuh maka di
dalam chamber masih terdapat udara dengan uap eluen, maka aliran eluen

akan tertahan sehingga menyebabkan pemisahan tidak berjalan dengan


baik.
parameter migrasi pada KLT adalah nilai Rf . Rf adalah waktu
tambah atau waktu yang diperlukan untuk mengelusi maksimum suatu
sampel dihitung dari titik awal penotolan. Oleh karena itu nilai Rf selalu
lebih kecil dari 1. Berdasarkan percobaan didapatkan nilai Rf 0,3 cm pada
perbandingan 7:3 , 0,9 cm pada perbandingan 8:2, 7:3, dan 6:4, serta 0,06
cm pada perbandingan 5:5. Jadi spot yang paling baik pada perbandingan
7:3 dengan eluen n-butanol dan etanol dengan nilai Rf 0,3 cm. Hal ini
disebabkan karena nilai Rf tersebut paling maksimal daya elusinya dalam
pemisahan. Daya elusi sendiri terletak antara 0,2 sampai 0,8.
Dari proses elusi tersebut tidak terlihat adanya spot secara kasat
mata sehingga perlu di deteksi di lampu UV 254 nm dan UV 366 nm.
Maka diperoleh nada yang terlihat. Pada lampu UV 254 nm noda terlihat
karena adanya daya interkasi anatara sinar uv dengan indikator flourosensi
seperti timah kadminum sulfida yang terdapat pada lempeng dimana
lempeng berflourosensi sedangkan sampel tampak gelap. Pada lampu uv
366 nm noda berflourosensi sedangkan lempeng berwarna gelap.
Penampakan noda terjadi karena adanya daya interkasi antara sinar uv
dengan gugus kromofor yang terikat oleh ausokrom yang ada pada noda
tersebut.
PEMBAHASAN KROMATOGRAFI KOLOM (KK)
Pembahasan
Pada praktikum ini dilakukan percobaan mengenai kromatgrafi
kolom fase diam yang digunakan adalah silika gel sedangkan fase

geraknya memakai n-butanol : etanol dengan beberapa perbandingan.


Fraksi yang di gunakan adalah fraksi air dari simplisia rosella.
Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan
kolom sebagai alat untuk memisahkan komponen-komponen dalam
campuran KK merupakan kelanjutan dari KLT. Prinsipnya sama dengan
KLT, KK digunakan untuk memurnikan senyawa atau memisahkan
campuran. Fase diam yang digunakan bisa berupa padat atau cair.
Sedangkan fase gerak berupa cair atau gas.
Mekanisme pemisahan
1. Kromatografi Adsorbsi.
Komponen yang dipisahkan secara selektif teradsorpsi pada
permukaan adsorben.
2. Kromatografi Partisi
Analit mengalami partisi antara lapisan cairan fase diam (stasioner)
dan eluen sebagai fase gerak (mobile).
3. Kromatografi Siza Eksklusi
Solut dilewatkan kedalam adsorben berpori
Solut dengan ukuran kecil akan masuk ke dalam pori-pori

adsorben.
Solut dengan ukuran lebih besar dari pori-pori adsorben

akan terelusi lebih dulu.


4. Kromatografin Pertukaran Ion
Fase diam memiliki muatan tertentu, analit yang berbeda
muatannya akan tertahan dalam adsorben dan secara selektif akan
terelusi oleh fase gerak berupa dapar.
5. Kromatografi Afinitas
Banyak digunakan untuk memisahkan enzim-enzim.
Fase diam memiliki gugus khas (ligan) dengan afinitas
tinggi terhadap solut.

Solut yang bentuknya cocok dengan ligan akan tertahan di


adsorben (membentuk kompleks) dolut yang lain akan

terelusi.
Kompleks yang terbentuk antara solut dengan ligan dielusi
ulang sehingga diperoleh solut yang diinginkan.
Kedalam KK ditmbahkan glass woll, pasir, silika gel, fraksi

air yang dicampur silika gel, dan eluen. Glass woll digunakan
untuk menahan pasir dan silika gel, pasir digunakan unutuk
menjerap kotoran. Silika gel sebagai fase diam untuk menjerap
analit sedangkan eluen untuk membawa analit menuju vial yang
terletak dibawah kolom sebagai penampungan fraksi.
Di dalam kolom, aliran fase gerak akan membawa
komponen-komponen analit ke arah sepanjang kolom. Pada saat
fase gerak mengalir sepanjang kolom terjadi kesetimbangan
dinamis antara komponen yang terdapat dalam fase gerak dengan
komponen yang terdapat dalam fase diam sehingga mempengaruhi
jumlah plat teori (N). Maka makin banyak palt maka pemisahan
makin baik sehingga kolom makin efisien.
Berbagai ukuran kolom dapat digunakan dimana hal utama
yang dipertimbangkan adalah kapasitas yang memadai untuk
menerima sampel-sampel tanpa melampaui fase diamnya. Panjang
kolom

harus

sekurang-kurangnya

sepuluh

kalu

ukuran

diamterernya. Adapun diameter dan panjang kolom yang digunakan


pada praktikum ini adalah 2 cm dan 24,5 cm.
Bahan pengemasnya adalah suatu adsorben yaitu silika gel
yang kemudian dimasukkan dalam bentuk suspensi kedalam porsi

fase gerak dan dibiarkan diam didalam hamparan basah dengan


sedikit cairan dibiarkan turun sampai mencapai puncak permukaan
hamparan.
Pemilihan ukuran kolom tergantung dari
A. Jumlah sampel yang akan dipisahkan, perbandingan
adsorben cuplikan 10:1
B. Perbandingan panjang dengan diameter kolom 12:1
C. Untuk sampel yang multikomponen yang memepunyai
afinitas yang sama terhadap adsorben maka dipilih kolom
yang panjang, sedangkan untuk komponen dengan afinitas
yang berbeda terhadap adsorben maka dipilih kolom yang
pendek.
Adapun cara penyiapan kolom yang digunakan pada
praktikum ini adalah cara basah agar meminimalkan reaksi
terjadinya keretakkan fase diam akibat kekeringan atau kurang
ratanya fase gerak bila dibandingkan cara kering maupun bubur
atau lumpuran. Pada saat menuangkan fase diam ke corong maka
serbuk tersebut tidak boleh menempel pada dinding kolom dan
tidak terbentuk rongga agar pemisahan berjalan sempurna. Dari
praktikum diperoleh 10 fraksi dengan warna yang semakin encer
(tidak pekat).
Parameter kinetika pemisahan ada 4 :
1. Slektivitas ()
2. Kapasitas kolom (K1)
3. Resolusi (Rs)
4. Jumlah plat teori (N)
Slektivitas yaitu kemampuan untuk mengenali senyawasenyawa didalam campuran untuk mendapatkan slektivitas

meksimum harus dicari mekanisme pemisahan yang paling sesuai


(partisi, adsorpsi size exclusion, atau ion exchange).
Kp A
Kp B
=
atau
Kp B
Kp A
Kp = koefisien partisi, perbaningan konsentrasi analit dalam fase
diam dan fase gerak ( Cs/Cm).
Pembilang adalah Kp yang lebih besar
Nilai 1
Nilai

makin besar maka pemisahan makin baik.

Kapasitas kolom adalah ukuran interaksi suatu analit


dengan fase diam. Hal ini menunjukkan kemampuan kolom
menampung analit maka semakin lama analit berbeda dalam kolom
akan semakin besar nilai kapasitasnya.
trtm
k1 =
tm
Resolusi adalah ukuran kuantitatif yang menyatakan
kemampuan kolom dalam memisahkan komponen-komponen.
Resolusi oleh 3 faktor yaitu efisiensi (N), selektivitas () dan
retensi (K1).
2( tr 2tr 1)
Rs = (W 1+W 2)
Rs = Berarti pemisahan tidak semprna
Rs 1,5 berarti pemisahan baik.