Jelajahi eBook
Kategori
Jelajahi Buku audio
Kategori
Jelajahi Majalah
Kategori
Jelajahi Dokumen
Kategori
TUJUAN
1. Merancang dan menganalisis probe yang akan digunakan dalam Southern Blot
dengan menggunakan Biofarmatics data base ( NCBI )
2. Mengetahui dan memahami cara mendeteksi terjadinya ekspresi gen dengan teknik
II.
5(Yuwono,2005).
3, sedangkan
Di alam ada 20 macam asam amino yang umum terdapat di dalam struktur
polipeptida jasad hidup. Masing- mising asam amino mempunyai kodon yang spesifik
sedangkan nukleotida hanya ada 4 macam yaitu A, U, G, dan C. Jika suatu kodon hanya
terdiri atas dua nukleotida maka hanya akan ada 4(=16) asam amino, tetapi apabila
kodon disusun oleh nukleotida,maka akan diperoleh 4(=64) asam amino, sedangkan
jumlah asam amino yang umum diketahui ada pada jasad hidup hanya 20 macam.
Beberapa kodon diketahui mengkode asam amino yang sama. Fenomena ini dikenal
sebagai genetic code redundancy(degeneracy). Oleh karena ada beberapa kodon yang
berbeda umtuk satu asam amino yang sama, maka dikenal ada 64 macam kodon, tiga
diantaranya yaitu TAA(UAA pada mRNA), TAG (UAG pada RNA) dan TGA (UGA pada
RNA) tidak mengkode asam amino apapun karena ketiga kodon ini merupakan kodon
untuk mengakhiri (terminasi) proses translasi.Ada bebarapa aspek yang perlu diketahui
mengenai kode genetik, yaitu :
1. Kode genetik bersifat tidak saling tumpang tindih (non-overlapping), kecuali pada
kasus tertentu, misalnya pada bakteriofag OX174 yang mempunyai kodon tumpang
tindih.
2. Tidak ada sela (gap) diantara kodon satu dengan kodon yang lain.
3. Tidak ada koma diantara kodon.
4. Kodon bersifat degenerate, artinya ada bebeapa asam amino yang mempunyai lebih
dari satu kodon.
5. Secara umum kodon bersifat hampir universal karena pada beberapa organel jasad
tinggi ada beberapa kodon yang berbeda dari kodon yang digunakan pada
sitoplasma(Yuwono,2005).
Reaksi hibridisasi adalah proses dimana singgle stand asam nukleat yang
komplementer dapat dengan mudah membentuk double stand kembali. Pada reaksi
hibridisasi rangkaian asam nukleat yang komplamenter dengan konsentrasi rendah tetap
dapat terdetekksi asalkan digunakan DNA probe sebagai indikatornya. Teknik hibridisasi
ini juga dapat di gunakan untuk mencari gen yang tidak identik namun mempunyai suatu
hubungan. Selain itu,DNA probe dapat digunakan untuk menyelidiki ekspresi gen (dalam
reaksi hibridisasi dengan RNA). Hibridisasi DNA probe dengan RNA sel memungkinkan
aktif tidaknya suatu gen. Selain itu dapat menentukan terjadinya perubahan akibat
mekanisme kendali yang bekerja terhadap transkripsi DNA,splising RNA atau translasi
molekul-molekul mRNA-nya yang sudah matang ke dalam protein jika ekspresi sebuah
gen berubah.
Probe adalah sekuens nukleotida single strand pendek (kira-kira 15-32 bp) yang
komplemen dengan DNA target yang biasa digunakan untuk mendeteksi dan menganalisa
keberadaan penyakit yang menginfeksi tubuh kita. Probe adalah agen yang dimasukkan
kedalam sebuah medium untuk mendapatkan informasi tentang struktur maupun
substansi tertentu. Probe memungkinkan kita untuk memvisualisasikan struktur DNA dan
juga mendeteksi kelainan-kelainan yang ada pada suatu DNA. Probe dapat ditempeli zat
radioaktif ataupun zat-zat fluorescence yang digunakan untuk menandai DNA target yang
diinginkan. Penggunaan probe atau oligonukleotida pendek ber-radioaktif atau ber-
fluorescence berguna dalam teknik FISH, teknik pendeteksian DNA target dengan
menempelkan probe yang komplemen dan di deteksi langsung pada sampel tersebut.
Probe dilabel baik dengan radioaktif maupun dengan molekul tertentu yang dapat
dideteksi seperti biotin atau fluoresin. Untai DNA atau RNA dapat berhibridisasi dengan
sekuens yang berkomplemen atau besesuaian dengannya. Oleh karena itu, probe dapat
melabel plaques virus, koloni bakteri maupun pita pada gel yang mengandung gen yng
menjadi minat dalam pelacaka atau deteksi. Prosedur ini dinamakan DNA hibridisasi dan
bergantung pada pembentukan pasangan basa yang stabil antara probe dengan sekuens
target.
Untuk menganalisis RNA yang menyediakan suatu protein dengan DNA probe
terhadap RNA digunakan cara yang disebut northern Blotting.Mula-mula molekul RNA
yang masih utuh dari sel-sel suatu organ dipisah(fraksionasi)menjadi sederet pita pada gel
elektroforesis.Selanjutnya agar molekul-molekul RNA itu dapat dimasuki oleh DNA
probe perlu dibuat replika gel dengan cara memindahkan(blotting)molekul-molekul RNA
yang telah difraksionasi pada sehelai kertas nitroselulosa atau kertas kertas
nilon.Molekul-molekul RNA yang telah membentuk hybrid dengan DNA probe yang
radioaktif(karena memiliki sebagian dari rangkaian gen yang normal) kemudian
ditentukan lokasinya dengan menginkubasi kertas tersebut dengan larutan yang
mengandung
probe
dan
probe
telah
membentuk
hybrida
dideteksi
dengan
III.
4.
Modem
b. Bahan
1. Situs NCBI
2. Kode genetik
-latihan:
-tugas :
IV.
( NM_000125)
( NM_198253.2)
CARA KERJA
A. Latihan (kode gen: NM_000125)
Di buka situs NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)
Kotak pilihan all database diganti nucleotide
kotak search nucleotide fordiisi dengan nama gen (NM_000125)
dicari CDS (Coding sequens)
Dengan mengacu pada sekuens cDNA
Dibuat probe dengan memblok sekuens pada origin yang masuk dalam region CDS
sepanjang yang diinginkan
Dicopy
Dibuka lagi situs yang sama , klik menu BLAST
Diklik nucleotide blast ( blasn ).
Di paste-kan rancangan probe tersebut pada kotak QYUER untuk mencari komplemennya
Diisi kotak JOB TITLE dengan nama praktikan
Pada kotak database diklik Human genomic + transcript
Ditekan BLAST. Akan muncul halaman baru yang berisi hasil format pada new window
Dilakukan analisis lanjut probe spesifik atau tidak dengan memperhatikan banyaknya kompetitor
dan presentase komplemennya dibandingkan dengan gen target (hanya pada human bukan
organisme lain)
Dirancang 3 buah probe dan bandingkan mana yang paling baik beserta alasannya
Probe pendek: 200 bp
Probe sedang : 500 bp
Probe panjang : 900
bp
V. HASIL PENGAMATAN
CDS
: 235......2022
Probe
No Kode gen
Deskripsi
Max
% Query
Score
1
NM
001291241.1
NM
001291230.1
NM
001122742.1
NM
001122741.1
NM
001122740.1
NM 000125.3
444
100 %
444
100 %
444
100 %
444
100 %
444
100 %
444
100 %
Kompetitor:
1
NC 000006.12
444
100 %
NC 018917.2
Homosapiens
chromosome
alternate assembly CHM1 1.1
438
100 %
6,
: NM_000125
Nama Gen
CDS
: 235......2022
Probe
No
Kode gen
Deskripsi
Max
% Query
Scor
e
1
NM 000125.3
1109 100 %
NM
1109 100 %
1109 100 %
Homosapiens
1109 100 %
001122740.1
3
NM
001122741.1
NM
estrogen
receptor
001122742.1
NM
1109 100 %
1109 100 %
001291230.1
6
NM
001291241.1
Kompetitor:
NC 000006.12
Homosapiens chromosome
38.p2 Primary Assembly
6,
GRCh
826
100 %
NC 018917.2
815
100 %
Max
% Query
: NM_000125
Nama Gen
CDS
: 235......2022
Probe
No
Kode gen
Deskripsi
Scor
e
1
NM 000125.3
1663 100 %
NM
1663 100 %
1663 100 %
1663 100 %
001122740.1
3
NM
001122741.1
NM
001122742.1
NM
001291230.1
NM
001291241.1
1663 100 %
1663 100 %
Kompetitor:
NC 000006.12
Homosapiens chromosome
38.p2 Primary Assembly
6,
GRCh
464
100 %
NC 018917.2
459
100 %
Kesimpulan:
Semakin panjang probe yang digunakan semakin spesifik.
: 59.....3457
: 241-480 ( 240 bp)
Kode Gen
Deskripsi
o
1
NM
198253.2
Max
Score
Query
444
100%
reverse 444
100%
mRNA
2
NM
Homo
sapiens
telomerase
001193376.
mRNA
Kompetitor:
1
NC
018916.2
NC
000005.10
Primary Assembly
: 59.....3457
87%
87%
Probe
Kode Gen
Deskripsi
o
1
NM
198253.2
Max
Score
Query
1109
100%
reverse 1109
100%
mRNA
2
NM
Homo
sapiens
telomerase
001193376.
mRNA
Kompetitor:
1
NC
018916.2
NC
000005.10
Primary Assembly
100%
100%
N
o
Kode Gen
: 59.....3457
: 618-1517 ( 900 bp)
Deskripsi
Max
Score
Query
NM
1663
100%
198253.2
reverse 1242
100%
mRNA
2
NM
Homo
sapiens
telomerase
001193376.
mRNA
Kompetitor:
1
NC
018916.2
NC
000005.10
Primary Assembly
100%
100%
VI. PEMBAHASAN
Praktikum kali ini melakukan perancangan dan menganalisa probe. Probe merupakan
suatu indikator untuk mendeteksi ekspresi dari suatu gen pada reseptor yang dilakukan secara
komputerisasi.perancangan probe sangat bermanfaat untuk mengetahui desain probe sebelum
mensintesisnya. Desain probe yang ideal di antaranya dapat membedakan dengan baik antara
target yang diinginkan dan non target, selain itu juga dapat mendeteksi perbedaan konsentrasi
gen di bawah kondisi hibridisasi. Penerapan DNA Probe itu sendiri meliputi pemilihan
rekombinan cDNA tentang kloning.Dan Microarray DNA, dapat digunakan untuk mendeteksi
perbedaan dalam ekspresi gen tingkatan dalam populasi yang berbeda dari sel-sel pada tingkat
genome.
Pada praktikum ini kita merancang,menganalisis
menggunakan biofarmasetics database (NCBI), dilakukan dua percobaan pada gen Homo sapiens
estrogen receptor 1, transcript variant 1, mRNA dengan kode gen NM_000125 dan Homo
sapiens telomerase transcriptase (TERT) dengan kode gen NM_198253.2
Dari data NCBI diketahui kode gen NM_000125 (Homo sapiens estrogen receptor 1,
transcript variant 1, mRNA) memiliki panjang probe 6330 bp. Versi update terakhir pada tanggal
15 Maret 2015 dengan versi kode gen NM_000125.3. Gen ini merupakan gen pada manusia yang
diketahui dengan melihat organism= Homo sapiens. Dari data NCBI juga diketahui adanya
jurnal-jurnal terkait dengan gen ini. Referensi no.1 merupakan jurnal yang paling baru. CDS atau
coding sequens menunjukkan sekuens yang ditranslasi menjadi protein. Potongan DNA
merupakan gen panjang gen ini diketahui dari 1-6330 bp. Sedangkan yang menjadi protein
diketahui dari nilai yang ditunjukkan oleh CDS. Dari data NCBI kode gen memiliki CDS dari
basa 235....2022. Percobaan dilakukan dengan memblok sebagian dari CDS sebagian probe. Ada
tiga probe yang dibandingkan dengan range sebagai berikut:
Probe pendek yang diambil antara 241.....480 (240 bp)
Probe sedang yang diambil antara 241....840 (600 bp)
Probe panjang yang diambil antara1081......1980 (900 bp)
Gen ini mengkode reseptor estrogen, ligan yang aktif dari faktor transkripsi terdiri dari
beberapa domain yang penting untuk mengikat hormon, mengikat DNA, dan aktivasi transkripsi.
Protein melokalisasi ke nukleus sehingga dapat membentuk homodimer dengan reseptor estrogen
2. Estrogen dan reseptornya sangat penting untuk perkembangan seksual dan fungsi reproduksi,
akan tetapi memiliki peran dalam jaringan lain seperti tulang. Reseptor estrogen juga terlibat
dalam proses patologis seperti pada kanker payudara, kanker endometrium, dan osteoporosis.
Promotor alternatif penggunaan dan hasil splicing alternatif dalam puluhan transkrip varian,
tetapi sifat yang lengkap dari banyak varian belum dapat ditentukan.
Dalam merancang probe harus diantara region CDS yang telah ditetapkan sesuai dengan
kode gen untuk memperoleh gen yang baik. Apabila rancangan probe diambil diluar region CDS
akan menghasilkan kompetitor yang banyak, serta dapat memungkinkan basa yang bersesuaian
dengan DNA yang jumlahnya sedikit. Penentuan probe yang spesifik dilakukan dengan
membuat dan membandingkan tiga kombinasi probe yakni probe panjang, sedang, dan pendek
yang diambil dari sekuen origin yang termasuk dalam range CDS. Probe panjang ialah probe
yang mempunyai 900 pasang basa, probe sedang mempunyai 500 pasang basa, dan probe pendek
mempunyai 200 pasang basa.
Tiga parameter yang digunakan untuk menentukan suatu probe spesifik atau tidak yaitu
skor makin tinggi maka makin bagus, jumlah kompetitor semakin banyak maka semakin tidak
spesifik, persen coverage harus 100%, dan kompetitor nilainya harus berbeda dengan probenya,
jika nilai kompetitornya sama dengan probe maka tidak spesifik.
Pada probe I sepanjang 240 bp dihasilkan skor maksimal 444 dengan 2 kompetitor yang
satu bernilai 444 yang lain bernilai 438. Hal ini menunjukkan bahwa probe tidak spesifik karena
memiliki skor yang sama yaitu 444 dan walaupun berbeda hanya memiliki selisih 6 poin. Probe
II sepanjang 600 bp dihasilkan skor maksimal 1109 dengan 2 kompetitor yang memiliki
maksimal skor yaitu, 826 dan 815 . Hal ini menunjukkan bahwa probe spesifik karena memiliki
skor yang lebih tinggi dan selisih yang ditunjukkan lebih besar. Probe III sepanjang 900 bp
dihasilkan skor maksimal 1663 dengan 2 kompetitor masing-masing skor yaitu 464 dan 459. Hal
ini menunjukkan bahwa probe sangat spesifik karena mempunyai skor yang tinggi dan selisih
yang ditunjukkan semakin besar. Probe ke III ini merupakan probe yang hasilnya terbaik.
Percobaan kedua adalah gen Homo sapiens telomerase transcriptase
(TERT) dengan kode gen NM_198253.2 . Gen ini memiliki panjang probe 4018
bp. Kode gen NM_198253.2 merupakan versi update terakhir yaitu pada
tanggal 15 Maret 2015. Gen ini merupakan gen pada manusia yang diketahui
dengan melihat organism= Homo sapiens. Dari data NCBI juga diketahui
adanya jurnal-jurnal terkait dengan gen ini. Referensi no.1 merupakan jurnal
yang paling baru. Dari data NCBI kode gen memiliki CDS dari basa
59....3457. Percobaan dilakukan dengan memblok sebagian dari CDS
sebagian probe, ada 3 yang dibandingkan dengan range sebagai berikut:
Probe pendek yang diambil antara 241.....480 (240 bp)
Probe sedang yang diambil antara 1021......1620 (600 bp)
Probe panjang yang diambil antara 618...... 1517 (900bp)
Pada probe I sepanjang 240 bp dihasilkan skor maksimal 444 dengan 2 kompetitor
masing-masing skornya yaitu 381. Hal ini menunjukkan bahwa probe spesifik karena memiliki
skor maksimal yang berbeda dengan kompetitor. Probe II sepanjang 600 bp dihasilkan skor
maksimal 1109 dengan 2 kompetitor yang memiliki skor maksimal yang sama, hal tersebut
berarti probe tidak spesifik karena skor maksimal tidak berbeda. Probe III sepanjang 900 bp
dihasilkan skor maksimal 1663 dan 1242 dengan 2 kompetitor dengan skor maksimalnya yaitu
355. Hal ini menunjukkan bahwa probe III paling spesifik karena mempunyai skor maksimal
yang paling tinggi dan selisih antara gen target dan kompetitor sangat besar. Probe ke III ini
merupakan probe yang hasilnya terbaik.
.
VII. KESIMPULAN
1. Probe adalah indikator untuk mendeteksi ekspresi gen secara komputerisasi dengan
beberapa metode, seperti northern blot (untuk RNA), southern blot (untuk DNA), dan
western blot (untuk protein).
2. Semakin panjang probe maka semakin akurat dan spesifik data yang didapat terhadap gen
target.
3. Probe dengan kode gen NM_000125.3 probe yang paling spesifik adalah probe yang ke 3
(panjang) daripada probe ke 2 (sedang) dan probe ke 1 (pendek) , dan probe ke 2 (sedang)
lebih spesifik dari probe ke 1 (pendek).
4. probe dengan kode gen NM_198253.2 yang spesifik adalah probe yang ke 3 (panjang)
daripada probe ke 2 (sedang) dan probe ke 1 (pendek) , dan probe ke 1 (pendek) lebih
spesifik dari probe ke 2 (sedang).
LAMPIRAN
Homo sapiens estrogen receptor 1 (ESR1), transcript
variant 1, mRNA
NCBI Reference Sequence: NM_000125.3
LOCUS
2015
DEFINITION
NM_000125
6330 bp
mRNA
linear
PRI 15-MAR-
CDS
Summary:
ACCESSION
VERSION
KEYWORDS
SOURCE
ORGANISM
usage
and
alternative
splicing
result
in
dozens
of
CDS
Summary:
NM_198253
4018 bp
mRNA
linear
PRI 15-MAR-