PENENTUAN KADAR PROTEIN TOTAL

(METODE KJELDAHL)
I.TUJUAN
1. Dapat memahami metode kjeldahl untuk penentuan kadar protein
2. Dapat mengetahui cara penentuan kadar protein secara kuantitatif
II.

TEORI DASAR
Prinsip metode kjeldahl adalah mula-mula bahan didestruksi dengan
asam sulfat pekat menggunakan katalis selenium oksiklorida atau butiran
Zn. Amonia yang terjadi ditampung dan dititrasi dengan bantuan indikator.
Metode kjeldahl pada umumnya dapat dibedakan atas dua cara,yaitu cara
makro dan semimikro.cara makro kjeldahl digunakan untuk sampel yang
sukar dihomogenisasi dan besarnya 1-3 gram, sedangkan semi-mikro
kjeldahl dirancang untuk sampel yang berukuran kecil. Yaitu kurang dari
300 mg dari bahan yang homogeny. kekurangannya adalah bahwa purin,
pirimidin, vitamin-vitamin, asam amino besar, kreatin, dan kreatinin ikut
teranalisis dan terukur sebagai nitrogen protein. Walaupun demikian, cara
ini masih digunakan hingga kini dan dianggap cukup teliti untuk
pengukuran kadar protein dalam bahan makanan, analisis protein dengan
metode mikro-kjeldahl pada dasarnya dapat dibagi menjadi tiga tahapan,
yaitu proses destruksi, proses destilasi, dan tahap titrasi. (Bintang, 2010)
1. Proses Destruksi
Pada tahap ini sampel dipanaskan dalam asam sulfat pekat sehingga
terjadi penguraian sampel menjadi unsur-unsurnya, yaitu unsur-unsur
C,H,O,N,S dan P. unsur N dalam protein ini dipakai untuk menentukan
kandungan

protein dalam suatu bahan. Sebanyak 100 mg sampel

(kedelai,tepung terigu, atau bahan lain) ditambahkan dengan katalisator

N sebanyak 0,5-1 gram yang dibungkus dengan kertas saring untuk
memudahkan memasukkannya kedalam tabung reaksi besar,sehingga
sampel dan katalisator tidak tercecer. Selain itu, kertas saring juga
berfungsi untuk menyaring filtrate yang mengandung residu.

Katalisator berfungsi untuk mempercepat proses destruksi dengan

menaikkan titik didih asam sulfat saat dilakukan penambahan H2SO4
pekat,serta untuk mempercepat kenaikan suhu asam sulfat,sehingga
destruksi berjalan lebih cepat.
Sampel

didestruksi

hingga

larutan

berwarna

jernih

yang

mengindikasikan bahwa proses destruksi telah selesai. Selama destruksi

terjadi reaksi sebagai berikut :
HgO + H2SO4HgSO4 + H2O
2 HgSO4 Hg2SO4 + SO2 + 2On
Hg2SO4 + 2 H2SO4 2 HgSO4 + 2 H2O +SO2
(CHON) + On + H2SO4 CO2 + H2O + (NH4)2SO4
2. Proses destilasi
Larutan sampel jernih yang telah dingin kemudian ditambahkan dengan
akuades untuk melarutkan sampel hasil destruksi agar hasil destruksi
dapat didestilasi dengan sempurna, serta untuk lebih memudahkan proses
analisis karena hasil destruksi mwelekat pada tabung reaksi besar.
Kemudian,larutan sampel dan blanko didestilasi dalam kjeldahl. Pada
dasarnya, tujuan destilasi adalah memisahkan zat yang diinginkan, yaitu
dengan memecah ammonium sulfat menjadi ammonia (NH3) dengan
menambahkan 20 mL NaOH-Na2S2O3 ,kemudian dipanaskan.
Prinsip destilasi adalah memisahkan cairan atau larutan berdasarkan
perbedaan titik didih. Fungsi penambahan NaOH adalah untuk
memberikan suasana basa, karena reaksi tidak dapat berlangsung dalam
keadaan asam, sedangkan fungsi penambahan Na2S2O3 adalah untuk
mencegah terjadinya ion kompleks antar ammonium sulfat dengan Hg
dari katalisator (HgO) yang membentuk merkuri ammonia sehingga
membentuk ammonium sulfat. Kompleks yang terjadi, ikatannya kuat
dan sukar diuapkan. HgO merupakan senyawa yang sukar dipecah dan
bersifat mudah meledak Na2S2O3 berfungsi untuk mengendapkan HgO,
sehingga tidak mengganggu reaksi kimia selanjutnya.
Hg + H2O + SO4 HgSO4 + H2O

Pada tahap destilasi, ammonium sulfat dipecah menjadi ammonia (NH3)

dengan penambahan NaOH sampai alkali dan dipanaskan dengan
pemanas dalam alat kjeldahl. Selain itu, sifat NaOH yang apabila
ditambah dengan akuades akan menghasilkan panas,

meskipun

energinya tidak terlalu besar jika dibandingkan pemanasan dari alat

kjeldahl, yang ikut memberikan masukan enrgi pada proses destilasi.
Panas tinggi yang dihasilkan alat kjeldahl juga berasal dari reaksi antara
NaOH dengan (NH4)2SO4 yang merupakan reaksi yang sangat eksoterm,
sehingga energinya sangat tinggi. Ammonia yang dibebaskan selanjutnya
akan ditangkap oleh larutan asam standar. Asam standar yang dipakai
dalam percobaan ini adalah asam borat 4% dalam jumlah yang berlebih.
Reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut :
(NH4)2SO4 + 2 NaOH Na2SO4 + 2 NH4OH
2 NH4OH 2 NH3 + 2 H2O
4 NH3 + 2 H3BO3 2 (NH4)2BO3 + H2
Reaksi destilasi akan berakhir bila ammonia yang telah terdestilasi tidak
bereaksi lagi.setelah destilasi selesai, larutan sampel berwarna keruh dan
terdapat endapan didasar tabung (endapan HgO), sedangkan larutan asam
dalam Erlenmeyer akan berwarna biru karena berada dalam suasana basa
akibat menangkap ammonia. Amonia yang terbentuk selama destilasi
dapat ditangkap sebagai destilat setelah diembunkan (kondensasi) oleh
pendingin balik di bagian belakang alat kjeldahl dan dialirkan ke dalam
Erlenmeyer.
3. Tahap Titrasi
Titrasi merupakan tahap akhir dari seluruh metode kjeldahl pada
penentuan kadar protein dalam bahan pangan yang dianalisis. Dengan
melakukan titrasi, dapat diketahui banyaknya asam borat yang bereaksi
dengan ammonia. Untuk tahap titrasi, destilat dititrasi dengan HCl yang
telah distandardisasi (telah disiapkan) sebelumnya. Normalitas yang
diperoleh dari hasil standardisasi adalah 0,02 N. selain destilat sampel,
destilat blanko juga dititrasi, karena selisih titrasi sampel dengan titrasi

blanko merupakan ekuivalen jumlah nitrogen. Jadi banyaknya HCl yang

diperlukan untuk menetralkan akan ekuivalen dengan banyaknya N.
Titrasi HCl dilakukan sampai titik ekuivalen yang ditandai dengan
berubahnya warna larutan dari biru menjadi merah muda karena adanya
HCl berlebih yang menyebabkan suasana asam (indicator BCG-MR
berwarna merah muda pada suasana asam ) melalui titrasi ini, dapat
diketahui kandungan N dalam bentuk NH4, sehingga kandungan N
dalam protein pada sampel dapat diketahui.
Kadar nitrogen (%N) dapat ditentukan dengan rumus berikut ini:
(tstb)
%N mg sampel

N HCl 14,0008 100 N

ts : Volume titrasi sampel

tb : Volume titrasi blanko
dengan demikian % protein adalah sebagai berikut:
% Protein = %N fk
f k : Faktor konversi atau perkalian = 6,25
III.

IV.

ALAT DAN BAHAN

ALAT
Labu kjeldahl

BAHAN
Sampel

Alat destilasi
Pipet tetes
Erlenmeyer
Gelas ukur
Waterbath
Gelas kimia
Termometer
Alat pemanas (heater)

Kalium sulfat
Asam sulfat pekat
Lempeng Zn
Aquadest
Air es
Natrium hidroksida 0,1 N
Asam klorida 0,1 N
Indikator Phenolftalein

PROSEDUR KERJA
Ditimbang 1 gram sampel yang telah dihaluskan kemudian
dimasukkan ke dalam labu kjeldahl. Setelah itu ditambahkan 7,5 gram
kalium sulfat dan 0,35 gram raksa (II) oksida dan 15 ml asam sulfat pekat.
Semua bahan dipanaskan dalam labu kjeldahl dalam lemari asam sampai

berhenti berasap dan diteruskan pemanasan sampai mendidih dan cairan

sudah menjadi jernih. Pemanasan ditambahkan kurang lebih 30 menit,
dimatikan pemanasan dan dibiarkan sampai dingin.
Selanjutnya ditambahkan 100 ml aquadest dalam labu kjeldahl yang
didinginkan dalam air es dan beberapa lempeng Zn, ditambahkan 15 ml
larutan kalium sulfat 4% (dalam air) dan akhirnya ditambahkan perlahanlahan larutan natrium hidroksida 50% sebanyak 50 ml yang telah
didinginkan dalam lemari es.
Labu kjeldahl dipasang dengan segera pada alat destilasi. Dipanaskan
labu kjeldahl perlahan-lahan sampai dua lapisan cairan tercampur, kemudian
dipanaskan dengan cepat sampai mendidih. Destilasi ditampung dalam
Erlenmeyer yang telah diisi dengan larutan baku asam klorida 0,1 N
sebanyak 50 ml dan indicator phenolptalein 0,1% b/v (dalam etanol 95%)
sebanyak 5 tetes, ujung pipa kaca destilator dipastikan masuk ke dalam
larutan asam klorida 0,1 N. Proses destilasi selesai jika destilat yang
ditampung lebih kurang 75 ml. sisa larutan asam klorida 0,1 N. titik akhir
titrasi tercapai jika terjadi perubahan warna larutan dari merah menjadi
kuning. dilakukan titrasi blanko.
V.

DATA PENGAMATAN & PERHITUNGAN

Data pengamatan
Tahap dekstruksi
Kacang hijau + Kalium sulfat +
Mercuri + Asam sulfat pekat
menghasilkan larutan berwarna
hijau keruh.
Kemudian di lakukan pemanasan
dalam lemari asam.Saat di
lakukan proses pemanasan, timbul
asap.
Setelah di lakukan pemanasan
larutan menjadi tidak berwarna.

Gambar

Tahap dekstruksi selesai.

Tahap destilasi
Kalium sulfat 0,6 gram di larutkan
kedalam 15 mL aquadest
larutan berwarna bening.
Natrium hidroksida 25 gram
dilarutkan kedalam 50 mL
aquadest

larutan berwarna

bening dan menimbulkan panas.

Asam klorida 50 mL
Zink

Lalu semua bahan dimasukkan ke

labu Kjeldahl kecuali Asam
klorida.

Setelah lebih kurang 30 menit,

warna larutan menjadi bening .
Larutan Asam klorida + indicator
phenolptalein yang menampung
destilat tetap bening.

Tahap titrasi
Hasil destilasi + Asam Klorida
(HCl) 0,1 N sebanyak 50 ml + 5
tetes indicator phenolphthalein
(dalam etanol 95%) + natrium
hidroksida 0,1N. terbentuk larutan
berwarna merah muda

Perhitungan
Larutan Asam oksalat (C2H2O4 . 2H2O)
N Asam Oksalat=

0,0958=

massa 1000
x
BE
V

massa 1000
x
63,035 100

Massa = 0,6038 gram 0,604 gram

Di peroleh, volume NaOH yang terpakai titrasi adalah 10,6 mL. Maka,
Asam Oksalat = Natrium Hidroksida
N1 x V1 = N2 x V2
0,0958 x 10 = N2 x 10,6
N2 =

0,958
10,6

N2 = 0,0903 N
Maka, di peroleh normalitas larutan NaOH adalah 0,0903 N.

Larutan Asam Klorida (volume 10 mL)

Di peroleh, volume NaOH yang terpakai titrasi adalah 11,3 mL. Maka,
Asam Klorida = Natrium Hidroksida
N1 x V1 = N2 x V2
N1 x 10 = 0,0903 x 11,3
N1 =

1,02
10

= 0,102 N

Maka, di peroleh normalitas larutan HCl adalah 0,102 N.

Larutan Asam Klorida (volume 50 mL)
Di peroleh, volume NaOH yang terpakai titrasi adalah 52,6 mL. Maka,
Asam Klorida = Natrium Hidroksida
N1 x V1 = N2 x V2
N1 x 50 = 0,0903 x 52,6
N1 =

4,75
50

N1 = 0,095 N
Maka, di peroleh normalitas larutan HCl adalah 0,095 N.
Kadar protein yang terkandung dalam sampel : Volume blanko adalah 52,6 ml ;
Volume titran adalah 41,6 ml ; Berat sampel adalah 1 gram
%N =

14 x ( mLblankomLtitran ) x N titran
berat sampel ( gram ) x 1000

%N =

14 x ( 52,6 mL41,6 mL ) x 0,0903 N

1 gram x 1000

%N =

13,9
1000

%N = 1,39 %

x 100%

x 100%

x 100%

100
16

%protein =

x %N

%protein = 6,25 x %N
%protein = 6,25 x 1, 39 %
%protein = 8,7%
Maka, di peroleh kadar protein yang terdapat dalam sampel yaitu kacang hijau
adalah 8,7%
VI.

PEMBAHASAN
Prinsip kerja dari metode Kjeldahl adalah protein dan komponen
organik dalam sampel didestruksi dengan menggunakan asam sulfat dan
katalis. Hasil destruksi dinetralkan dengan menggunakan larutan alkali dan
melalui destilasi. Destilat ditampung dalam larutan asam . Selanjutnya ionion borat yang terbentuk dititrasi dengan menggunakan larutan HCl.
Pada proses destruksi, sample dipanaskan dalam H2SO4 pekat
sehingga terjadi penguraian sample menjadi unsur-unsurnya. Unsur N yang
dihasilkan akan dipakai untuk menentukan kadar protein. Untuk
mempercepat proses destruksi, perlu ditambahkan katalis. Katalis yang
digunakan terdiri dari campuran K2SO4 dan HgO yang mempercepat reaksi
dengan meningkatkan titk didih dari H2SO4 pekat, peningkatan titik didih
akan mengefektifkan reaksi antara asam sulfat dengan sampel (destruksi
berjalan efektif). Hal tersebut disebabkan oleh lamanya waktu yang
dibutuhkan oleh asam sulfat untuk menguap (semakin tinggi titik didih,
maka waktu yang dibutuhkan asam sulfat untuk menguap akan semakin
lama), selain itu H2SO4 juga dapat memutuskan ikatan pepetida dari protein
yang ada disampel, karena H2SO4 untuk bereaksi dengan Asam amino dari
sampel harus mempunyai titik didih yang tinggi sehingga menyebabkan
putusnya ikatan C dan N dan menghasilkan NH 4,Setelah pencampuran
larutan yang diperoleh kuning kecoklatan hal ini diduga adanya air yang
tersisa diawal pada saat pencucian alat sehingga air ikut tercampur, tapi
seharusnya berwarna hitam dan kemudian saat pemanasan berjalan menjadi
tidak berwarna hal ini karena adanya pelepasan gas CO2 dan H2O, dan

setelah pelepasan gas CO2 dan H2O akan menghasilkan senyawa amonium
sulfat.
Asam amino+ H2SO4

(NH4)2SO4(liq)+ H2O (g)+ CO2 (g)

Setelah tahap dekstruksi dilanjutkan dengan tahap destilasi Tujuan

dari proses destilasi adalah memisahkan zat yang akan dianalisa dengan cara
memecah ammonium sulfat menjadi ammonia (NH3), dengan penambahan
aquadest sebanyak 100 ml yang bertujuan untuk pengenceran/sebagai
pelarut, sehingga luas permukaan semakin besar dan mempermudah
berjalannya suatu reaksi kimia, dan kemudian dengan penambahan lempeng
Zn bertujuan untuk mencegah adanya letupan saat pemanasan, dan
kemudian ditambahkan NaOH 50% bertujuan agar NaOH mengikat H2SO4,
dan H2SO4, untuk mempercepat pelepasan ammonia dengan cara
menciptakan suasana basa (reaksi tidak dapat berlangsung dalam kondisi
asam). Setelah itu dilakukan distilasi dengan pemanasan sampai larutan
dalam tabung destilasi tercampur, dan destilat yang diperoleh ditampung
dalam erlenmeyer dan ujung pipa kaca destilator tepat masuk kedalam
erlenmeyer agar destilat berikatan dengan HCl dan membentuk NH4Cl.
Setelah itu dilanjutkan dengan proses titrasi dengan larutan baku
HCl 0.1 N dan indikator pp yang berfungsi untuk memepercepat reaksi.
Titrasi asam-basa digunakan untuk menentukan kadar protein dalam
sampel. Karena NH3 yang terbentuk adalah asam lemah, digunakan HCl
baku 0,1 N untuk menitrasi hasil destilasi, titik akhir di tandai dengan
perubahan warna menjadi merah muda karena adanya indicator
Phenolptalein pada kondisi sedikit basa (mendekati netral), dan titran yang
dipergunakan untuk larutan sampel sebanyak 41,6 ml dan titran untuk
larutan Blanko sebanyak 50 ml.
VII.

KESIMPULAN
1. Analisis protein dengan Metode Kjeldahl terdiri dari beberapa tahapan
yaitu: destruksi, destilasi, dan titrasi.

2. Di peroleh kadar protein yang terdapat dalam sampel yaitu Kacang hijau adalah
8,7%.

VIII.

DAFTAR PUSTAKA
1. Poedjiadi, Anna. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Penerbit UI-Press.Jakarta.
2. Lehninger. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jilid 1. Jakarta : Erlangga
3. Hamid,Abdul.2001.Biokimia Metabolisme Biomolekul. Jakarta: Penerbit
Alfabeta