Anda di halaman 1dari 21

PEMURNIAN PROTEIN

I.TUJUAN
1. Dapat memahami metode pemurnian protein
2. Dapat mengetahui ada tidaknya protein di dalam sample
3. Dapat memisahkan protein dengan metode salting out.
4. Dapat mengetahui cara pemisahan suatu protein berdasarkan perbedaan
berat molekul dengan menggunakan kromatografi gel
II.

TEORI DASAR
Protein berasal dari bahasa Yunani protos, yang berarti yang paling
utama. Protein merupakan senyawa organik kompleks berbobot molekul
tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang
dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. (Poejadi, 1994)
Protein

adalah

sekelompok

senyawa

organik

yang

hampir

keseluruhannya terdiri atas karbon, hidrogen, oksigen, dan nitrogen. Protein


biasanya suatu polimer yang tersusun atas banyak subunit (monomer) yang
dikenal sebagai asam amino. (Fried dan Hademenos, 2006).
Protein merupakan makromolekul yang paling melimpah di dalam sel
dan menyusun lebih dari setengah berat kering pada semua organisme.
Sebagai makro molekul, protein merupakan senyawa organik yang
mempunyai berat molekul tinggi dan berkisar antara beberapa ribu sampai
jutaan dan tersusun dari C, H, O dan N serta unsur lainnya seperti S yang
membentuk asam-asam amino. (Patong, dkk., 2012).
Protein banyak terkandung di dalam makanan yang sering dikonsumsi
oleh manusia. Seperti pada telur, tempe, tahu, ikan dan lain sebagainya.
Protein sangat penting bagi kehidupan organisme pada umumnya karena ia
berfungsi untuk memperbaiki sel-sel tubuh yang rusak dan suplai nutrisi
yang dibutuhkan tubuh. (Triyono, 2007)

Berdasarkan strukturnya, protein dibagi menjadi :


1. Struktur Primer
Struktur primer protein merupakan urutan asam amino penyusun
protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida (amida). Frederick
Sanger merupakan ilmuwan yang berjasa dengan temuan metode
penentuan deret asam amino pada protein, dengan penggunaan beberapa
enzim protease yang mengiris ikatan antara asam amino tertentu, menjadi
fragmen peptida yang lebih pendek untuk dipisahkan lebih lanjut dengan
bantuan kertas kromatografik. Urutan asam amino menentukan fungsi
protein, pada tahun 1957, Vernon Ingram menemukan bahwa translokasi
asam amino akan mengubah fungsi protein, dan lebih lanjut memicu
mutasi genetik. (Bintang, 2010)
Struktur primer menyatakan urutan asam-asam amino pada rantai
protein dan letak ikatan disulfida bila ada. Karena protein dapat
mengandung 100 atau lebih residu asam amino sehingga sulit
menggambarkan rumus bangunnya. Oleh karena itu digunakan singkatan
3 huruf untuk tiap asam amino. Misalnya: Glu Ala Lys Gly Tyr
Ala. Struktur primer protein bisa ditentukan dengan beberapa metode: (1)
hidrolisis protein dengan asam kuat (misalnya, 6N HCl) dan kemudian
komposisi asam amino ditentukan dengan instrumen amino acid
analyzer, (2) analisis sekuens dari ujung-N dengan menggunakan
degradasi Edman, (3) kombinasi dari digesti dengan tripsin dan
spektrometri massa, dan (4) penentuan massa molekular dengan
spektrometri massa. (Bintang, 2010)
Struktur primer protein ditentukan oleh ikatan kovalen antara residu
asam amino yang berurutan yang membentuk ikatan peptida. Urutan,
macam dan jumlah asam amino yang membentuk rantai polipeptida,
adalah struktur polimer protein. Untuk mengetahui struktur primer suatu
protein diperlukan cara penentuan bertingkat: (1) Penentuan jumlah
rantai polipeptida yang berdiri sendiri dari protein, (2) Pemutusan ikatan
antara rantai polipeptida yang satu dengan yang lain, (3) Pemisahan

masing-masing rantai polipeptida, dan (4) Penentuan urutan asam amino


dari masing-masing rantai polipeptida dengan metode Sanger. (Bintang,
2010)
2. Struktur Sekunder
Struktur sekunder protein adalah struktur tiga dimensi lokal dari
berbagai rangkaian asam amino pada protein yang distabilkan oleh ikatan
hidrogen. Berbagai bentuk struktur sekunder misalnya ialah sebagai
berikut :
1. alpha helix (a-helix, "puntiran-alfa"), berupa pilinan rantai asamasam amino berbentuk seperti spiral;
2. beta-sheet (-sheet, "lempeng-beta"), berupa lembaran-lembaran
lebar yang tersusun dari sejumlah rantai asam amino yang saling
terikat melalui ikatan hidrogen atau ikatan tiol (S-H);
3. beta-turn, (-turn, "lekukan-beta"); dan
4. gamma-turn, (-turn, "lekukan-gamma
Struktur

sekunder

bisa

ditentukan

dengan

menggunakan

spektroskopi circular dichroism (CD) dan Fourier Transform Infra Red


(FTIR).[6] Spektrum CD dari puntiran-alfa menunjukkan dua absorbans
negatif pada 208 dan 220 nm dan lempeng-beta menunjukkan satu
puncak negatif sekitar 210-216 nm. Estimasi dari komposisi struktur
sekunder dari protein bisa dikalkulasi dari spektrum CD. Pada spektrum
FTIR, pita amida-I dari puntiran-alfa berbeda dibandingkan dengan pita
amida-I dari lempeng-beta. Jadi, komposisi struktur sekunder dari protein
juga bisa diestimasi dari spektrum inframerah. (Bintang, 2010)
Analisis difraksi sinar-X merupakan cara yang baik untuk
mempelajari struktur sekunder protein. Struktur ini terjadi karena ikatan
hidrogen antara atom O dari gugus karbonil (C=O) dengan atom H dari
gugus amino (N-H) dalam satu rantai polipeptida, memungkinkan
terbentuknya konformasi spiral yang disebut struktur helix. Bila ikatan
hidrogen tersebut terjadi antara dua rantai polipeptida, maka masingmasing rantai tidak membentuk helix, melainkan rantai paralel dengan

bentuk berkelok-kelok yang disebut konformasi-. Rantai polipeptida


denagn konformasi- ini dihubung silangkan (cross-linked) oleh ikatan
hidrogen sehingga membentuk suatu struktur yang disebut lembaran
berlipat-lipat

(pleated

sheets).

Perenggangan

rantai

polipeptida

membentuk struktur berkelok-kelok, yang kemudian menghasilkan


konformasi lembaran berlipat-lipat diawali oleh putusnya ikatan hidrogen
yang berperan dalam pemantapan struktur a-helix yang menyebabkan
berubahnya struktur akeratin menjadi keratin yang dapat terjadi
protein serabut pada pemanasan dengan uap. (Bintang, 2010)
3. Struktur Tersier
Struktur tersier terbentuk karena adanya pelipatan membentuk
struktur yang kompleks. Pelipatan distabilkan oleh ikatan hidrogen,
ikatan disulfida, interaksi ionik, ikatan hidrofobik, ikatan hidrofilik.
Struktur tersier yang merupakan gabungan dari aneka ragam dari struktur
sekunder. Struktur tersier biasanya berupa gumpalan. Beberapa molekul
protein dapat berinteraksi secara fisik tanpa ikatan kovalen membentuk
oligomer yang stabil (misalnya dimer, trimer, atau kuartomer) dan
membentuk struktur kuartener.
Struktur tersier terbentuk karena terjadinya perlipatan (folding)
rantai a-helix, konformasi , maupun gulungan rambang suatu
polipeptida, membentuk protein globular, yang struktur tiga dimensinya
lebih rumit daripada protein serabut. Kemantapan struktur tersier suatu
molekul protein, selain disebabkan oleh ikatan kovalen seperti ikatan
peptida dan ikatan disulfida, juga oleh ikatan tak-kovalen yang
menunjangnya, yaitu yang menyebebkan terjadinya perlipatan terebut.
Ikatan tak-kovalen ini terjadi antara gugus rantai samping polipeptida.
(Bintang, 2010)
4. Struktur Kuartener
Struktur kuartener terbentuk dari beberapa bentuk tersier, dengan
kata lain multi sub unit. Interaksi intermolekul antar sub unit protein ini
membentuk struktur keempat atau kuartener. Suatu protein dikatakan

mempunyai struktur kuarterner bila protein terdiri atas 2 rantai


polipeptida atau lebih disatukan oleh gaya dispersi (ikatan hidrogen).
Protein seperti ini dinamakan oligomer, sedangkan asam amino yang
menyusunnya disebut monomer.
Sebagian besar protein berbentuk globular yang mempunyai berat
molekul lebih dari 50.000 merupakan suatu oligomer, yang terjadi dari
beberapa rantai polipeptida yang terpisah. Rantai polipeptida ini yang
juga disebut protomer saling mengadakan interaksi membentuk struktur
kuartener dari protein oligomer tersebut. Dalam proses denaturasi ini,
protein oligomer mengalami dua proses bertingkat: (1) Disosiasi rantai
polipeptida yang satu dari yang lainnya, dan (2) Merenggangnya sauan
rantai polipeptida. Kemantapan struktur kuartener suatu protein oligomer
disebaban oleh interaksi dan ikatan non kovalen yang lemah antara
masing-masing sub-bagiannya. Kemampuan untuk berhimpun diri
daripada beberapa sub bagian ini merupakan ciri struktur kuartener suatu
protein oligomer. (Bintang, 2010)
Fungsi protein diantaranya sebagai berikut:
1. Sebagai enzim hampir semua reaksi biologis dipercepat atau di bantu oleh
suatu senyawa makromolekul spesifik yang disebut enzim, dari reaksi
yang sangat sederhana seperti reaksi transportasi karbondioksida yang
sangat rumit seperti replikasi kromosom. Protein besar peranannya
terhadap perubahab-perubahan kimia dalam system biologis.
2. Alat pengangkut dan penyimpanan Banyak molekul dengan MB kecil
serta beberapa ion dapat diangkut atau dipindahkan oleh protein-protein
tertentu. Misalnya hemoglobin mengangkut oksigen dalam eritrosit,
sedangkan mioglobin mengangkut oksigen dalam otot.
3. Pengatur pergerakan protein merupakan komponen utama daging,
gerakan otot terjadi karena adanya dua molekul protein yang saling
bergeseran.

4. Penunjang mekanik kekuatan dan daya tahan robek kulit dan tulang
disebebkan adanya kolagen, suatu protein berbentuk bulat panjang dan
mudah membentuk serabut
5. Pertahanan tubuh atau imunisasi pertahanan tubuh biasanya dalam bentuk
antibody, yaitu suatu protein khusus yang dapat mengenal dan menempel
atau mengikat benda-benda asing yang masuk ke dalam tubuh seperti
virus, bakteri, dan sel-sel asing lain.
6. Media perambatan impuls saraf protein yang mempunyai fungsi ini
biasanya berbentuk reseptor, misalnya rodopsin, suatu protein yang
bertindak sebagai reseptor penerima warna atau cahaya pada sel-sel mata
7. Pengendalian pertumbuhan
8. Sebagai bahan pembentuk senyawa kimia seperti enzim yang berperan
penting dalam mengatur berbagai proses yang terjadi di dalam tubuh.
(Bintang, 2010)
Protein memegang peranan penting dalam berbagai proses biologi.
Peran-peran tersebut antara lain:
1. Katalisis enzimatik
Hampir semua reaksi kimia dalam sistem biologi dikatalisis oleh enzim
dan hampir semua enzim adalah protein.
2. Transportasi dan penyimpanan
Berbagai molekul kecil dan ion-ion ditansport oleh protein spesifik.
Misalnya transportasi oksigen di dalam eritrosit oleh hemoglobin dan
transportasi oksigen di dalam otot oleh mioglobin.
3. Koordinasi gerak
Kontraksi otot dapat terjadi karena pergeseran dua filamen protein.
Contoh lainnya adalah pergerakan kromosom saat proses mitosis dan
pergerakan sperma oleh flagela.
4. Penunjang mekanis
Ketegangan kulit dan tulang disebabkan oleh kolagen yang merupakan
protein fibrosa.
5. Proteksi imun

Antibodi merupakan protein yang sangat spesifik dan dapat mengenal


serta berkombinasi dengan benda asing seperti virus, bakteri dan sel dari
organisma lain.
6. Membangkitkan dan menghantarkan impuls saraf
Respon sel saraf terhadap rangsang spesifik diperantarai oleh oleh protein
reseptor. Misalnya rodopsin adalah protein yang sensitif terhadap cahaya
ditemukan pada sel batang retina. Contoh lainnya adalah protein reseptor
pada sinapsis.
7. Pengaturan pertumbuhan dan diferensiasi
Pada organisme tingkat tinggi, pertumbuhan dan diferensiasi diatur oleh
protein faktor pertumbuhan. Misalnya faktor pertumbuhan saraf
mengendalikan pertumbuhan jaringan saraf. Selain itu, banyak hormon
merupakan protein.
(Bintang, 2010)
Jenis-jenis protein diantaranya :
1. Kolagen, protein struktur yang diperlukan untuk membentuk kulit, tulang
dan ikatan tisu.
2. Antibodi, protein sistem pertahanan yang melindungi badan dari pada
serangan penyakit.
3. Dismutase superoxide, protein yang membersihkan darah kita.
4. Ovulbumin, protein simpanan yang memelihara badan.
5. Hemoglobin, protein yang berfungsi sebagai pembawa oksigen
6. Toksin, protein racun yang digunakan untuk membunuh kuman.
7. Insulin, protein hormon yang mengawal aras glukosa dalam darah.
8. Tripsin, protein yang mencernakan makanan protein.
(Bintang, 2010)
Pemurnian protein adalah suatu rangkaian proses isolasi jenis tunggal
dari dari satu campuran kompleks. Biasanya pemurnian ini bertujuan untuk
mengetahui lebih jauh mengenai struktur, sifat-sifat kimia maupun fisika
suatu senyawa yang terdapat di bahan alam. Sehingga diperlukan suatu
proses guna memperoleh senyawa dalam keadaan murni. Mendapatkan

suatu jenis protein dari bahan alam dalam keadaan murni bukanlah
pekerjaan mudah, sebab molekul protein tidak stabil terhadap pemanasan
serta pelarut organik.
Untuk mempelajari suatu protein tertentu, perlu dilakukan isolasi
perotein tersebut dengan protein yang lain yang mungkin terkandung dalam
jaringan. Purifikasi protein merupakan teknin biokimia yang banyak
digunakan.
Banyak metode yang digunakan untuk fraksinasi protein terutama
berdasarkan ukuran molekul dari protein. Sebagai contoh, protein yang
diangkat dari larutan dengan menambahkan garam, proses dari ukuran
molekul protein yang lebih besar ke ukuran yang lebih kecil. Peristiwa
pemisahan atau pengendapan protein oleh garam berkonsentrasi tinggi
disebut "salting out". Metode "salting out" ini mungkin bergantung pada
fenomena fisik, dua fenomena tersebut yang penting di antaranya adalah
penghentian dari daya tarik dari permukaan protein oleh ion garam dan
perpindahan air dari sekitar molekul protein oleh kompetisi dari ion dari
garam dengan air. (Girindra, 1986)
Salting out merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan
protein yang didasarkan pada prinsip bahwa protein kurang terlarut ketika
berada pada daerah yang konsentrasi kadar garamnya tinggi. Konsentrasi
garam diibutuhkan oleh protein untuk mempercepat keluarnya larutan yang
berbeda dari protein satu ke protein yang lainnya. (Girindra, 1986)
Pengaruh penambahan garam terhadap kelarutan protein berbedabeda, tergantung pada konsentrasi dan jumlah muatan ionnya dalam larutan.
Semakin tinggi konsentrasi dan jumlah muatan ionnya, semakin efektif
garam dalam mengendapkan protein.
Kelarutan protein akan berkurang bila kedalam larutan protein
ditambahkan garam- garam anorganik. Pengendapan terus terjadi karena
kemampuan ion garam untuk menghidrasi, sehingga terjadi kompetisi antara
garam anorganik dengan molekul protein untuk mengikat air. Karena garam

anorganik lebih menarik air maka jumlah air yang tersedia untuk molekul
protein akan berkurang (Mayes et al, 1990).
Fraksi yang diperoleh dari pengen dapan amonium sulfat perlu
dimurnikan lagi dengan metode kromatografi. Kromatografi adalah teknik
pemisahan zat untuk analisis dan preparative dengan melarutkan campuran
dalam fase gerak (cairan atau gas), yang mengalir melalui fase diam atau
stasioner, zat zat yang hendak dipisahkan harus berinteraksi dengan fase
stasioner dengan kuat yang berbeda beda , interaksi ini dapat bersifat
adsorbs, partisi, pertukaran ion, dan interaksi lainnya.
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan
perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk
memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.Molekul
yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase
diam.Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan
cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah.
Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan
pergerakan pada kolom. Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen
tersebut dapat dianalisa dengan menggunakan detektor atau dapat
dikumpulkan untuk analisa lebih lanjut. Beberapa alat-alat analitik dapat
digabungkan dengan metode pemisahan untuk analisis secara on-line (online analysis) seperti: penggabungan kromatografi gas (gas chromatography)
dan kromatografi cair (liquid chromatography) dengan mass spectrometry
(GC-MS dan LC-MS), Fourier-transform infrared spectroscopy (GC-FTIR),
dan diode-array UV-VIS (HPLC-UV-VIS). (Hamid, 2001)
Kromatografi yang digunakan yaitu filtrasi gel. Kromatografi filtrasi
gel merupakan teknik pemisahan protein dan makro molekul biologi lain
berdasarkan ukuran molekul, jadi bekerja sebagai suatu penyaring molekul.
Proses pemisahan ini menggunakan gel yaitu dekstran (polimer gula yang
larut dalam air) dan mengalami reaksi ikatan silang (cross linkage) sehingga
dekstran menjadi tidak larut dalam air, tetapi masih dapat menyerap molekul
air dalam molekulnya. (Hamid, 2001)

Daya serap matriks bergantung pada jumlah ikatan silang yang terjadi
di dalamnya. Matriks atau gel dekstran disebut juga sebagai sefadeks,
misalnya sefadeks G-50. Huruf dan nomor menunjukkan bahwa safadeks
tersebut dapat dikembangkan (Swelling) dengan air atau larutan penyangga
dengan besar pengembangnya 50 kali. Gel atau matriks ini berpori yang
dikemas di dalam kolom dan dielusi dengan fase cair mobil. Molekul yang
lebih kecil akan masuk ke dalam pori matriks dan bergerak lebih lambat,
sedangkan molekul yang lebih besar akan bergerak lebih cepat karena tidak
tertahan di dalam pori matriks.

Gambar Kolom Desalting

Gambar Kromatografi Filtrasi Gel

LDH merupakan enzim yang mengkatalisis perubahan piruvat


menjadi laktat yang tergantung pada kofaktor nikotinamida. LDH
ditemukan hampir pada semua organisme karena mempunyai peran penting
pada metabolisme karbohidrat. Selama kondisi dimana produksi piruvat dari
glikolisis dapat meningkatkan kemampuan sel untuk memetabolisme
piruvat. LDH dapat mengubah piruvat menjadi laktat, dengan demikian
akan menghasilkan NAD

teroksigenasi yang diperlukan untuk proses

glikolisis selanjutnya. LDH juga dapat mengkonversi reaksi sebaliknya


yaitu pembentukan piruvat dari laktat yang juga akan menghasilkan NADH,
baik NADH ataupun piruvat dapat digunkan untuk proses metabolisme
lainnya.

III.

ALAT DAN BAHAN


Alat
Batang pengaduk
Beaker glass
Blender
Kain kassa
Pipet tetes
Rak tabung
Tabung falcon
Tabung sentrifugasi

IV.

Bahan
Ammonium sulfat
Dada ayam
Dapar tris pH 8,4
Dapar yang telah dibekukan

PROSEDUR KERJA
Dada ayam ditimbang sebanyak 50 gram kemudian diblender dengan
dapar yang telah dibekukan selama 4 x 30 detik dengan jeda 10 detik.
Kemudian dibagi menjadi 2 bagian sama banyak, masing-masing bagian 25
gram, 25 gram tersebut dimasukkan kedalam 4 tabung sentrifugasi yang
berbeda. Setelah itu disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan
15.000 rpm. Supernatan (cairan) yang diperoleh disaring menggunakan kain
kassa dan pellet (endapan) yang berada didalam kain kassa diperas hingga
tidak ada supernatan yang terkandung didalamnya, diukur supernatannya.
Supernatan ditambahkan ammonium sebanyak 5,07 gram sedikit demi
sedikit dan diaduk perlahan selama 15 menit. Pengerjaan ini dilakukan di
dalam gelas kimia yang berisi es batu. Setelah itu dimasukkan kedalam 2
tabung sentrifugasi yang berbeda. Disentrifugasi selama 15 menit (apabila
supernatan dan pellet belum terbentuk maka perlu dilakukan penambahan
waktu selama 15 menit). Setelah itu supernatan dan pelletnya dipisahkan,
lalu pellet diambil untuk tahap selanjutnya. Dilakukan resuspensi pellet
ammonium sulfat dengan cara pellet ammonium sulfat ditambahkan 1 mL
dapar Tris HCl lalu diaduk perlahan hingga semua pellet larut kemudian
dimasukan ke dalam tabung lain yang berisi pellet ammonium sulfat dan
ditambahkan dapar Tris HCl hingga volumenya mencapai 3 mL lalu diaduk
hingga homogen.
Disiapkan kolom desalting yang didalamnya berisi dapar, lalu gunting
bagian ujungnya hingga diperoleh larutan dapar dan ditampung pada beaker

glass. Setelah dapar keluar sampel dimasukan ke dalam kolom desalting dan
ditampung menggunakan beaker glass. Setelah itu dielusi dengan
menambahkan eluen berupa dapar sebanyak 3 mL
V.

DATA PENGAMATAN & PERHITUNGAN


PERCOBAAN
Ditimbang dada ayam sebanyak

HASIL DAN GAMBAR

50 gram.

Berupa potongan dada ayam


Dada ayam + buffer yang telah
beku dimasukan ke dalam blender
, kemudian di blender selama 4 x
30 detik dengan jeda 10 detik.
Dibagi menjadi 2 bagian sama
banyak, masing-masing bagian 25
gram.
Satu bagian yang berisi 25 gram
tersebut dimasukan ke dalam 4 Menghasilkan larutan yang kental
tabung sentrifugasi yang berbeda. dan berwarna peach (+++)
Kemudian disentrifugasi selama
20

menit

dengan

kecepatan

15.000 rpm

Terjadi pemisahan, pada bagian atas


berupa supernatan yang berwarna
peach bening (+) sedangkan pada
bagian bawah berupa pellet dengan

endapan berwarna peach (+++)


Supernatan disaring menggunakan
kain kassa dan sisa pellet yang
berada di atas kain kassa diperas
hingga tidak ada lagi supernatan
yang terkandung didalamnya.
Diukur berapa supernatan yang
diperoleh.

Diperoleh larutan berupa supernatan


berwarna peach (+).
Supernatan yang diperoleh akan
digunakan untuk tahap selanjutnya,
sedangkan

pellet

yang

berupa

endapan dibuang.
Lalu

supernatan

ditambahkan

ammonium sulfat sebanyak 5,07


gram sedikit demi sedikit dan
diaduk perlahan selama 15 menit.
Pengerjaan ini dilakukan di dalam
gelas kimia yang berisi es batu.

Ammonium sulfat tersebut larut ke


dalam supernatan dan tidak terbentuk
busa.

Setelah itu dimasukan ke dalam 2


tabung sentrifugasi yang berbeda

Menghasilkan larutan yang agak


pekat dan keruh dengan warna peach
(++)

Kemudian disentrifugasi selama


15 menit

Setelah disentrifugasi selama 15


menit supernatan dan pellet belum
terpisah atau terbentuk maka perlu
dilakukan penambahan waktu selama
15 menit.
Supernatan dan pellet dipisahkan

Terjadi pemisahan, pada bagian atas


berupa supernatan yang berwarna
peach bening (+) sedangkan pada
bagian bawah berupa pellet dengan
endapan berwarna peach (++)
Pellet

yang

diperoleh

akan

digunakan untuk tahap selanjutnya


sedangkan supernatan dimasukan ke
dalam gelas kimia

Dilakukan

resuspensi

pellet

ammonium sulfat dengan cara :


pellet ammonium sulfat + 1 mL
dapar

Tris

HCl

lalu

diaduk

perlahan hingga semua pellet


larut, kemudian dimasukan ke
dalam tabung lain yang berisi
pellet

ammonium

ditambahkan

dapar

sulfat

dan

Tris

HCl

hingga volumenya mencapai 3 Pellet ammonium sulfat yang


diperoleh berupa endapan berwarna
mL lalu diaduk hingga homogen
peach (++)
Disiapkan kolom desalting, lalu
gunting bagian ujungnya hingga
diperoleh

larutan

dapar

dan

ditampung pada beaker glass

Menghasilkan larutan tidak berwarna


Kemudian sampel dimasukan ke
dalam

kolom

desalting

dan

ditampung menggunakan beaker


glass. Setelah itu dielusi dengan
menambahkan eluen berupa dapar
sebanyak 3 mL

Menghasilkan larutan berwarna


peach keruh (+). Pada cairan ini
mengandung protein LDH.

PERHITUNGAN
Diketahui

: Supernatan yang diperoleh = 13 mL


Ammonium sulfat = 0,39 gram/mL

Ditanyakan : Berapa gram ammonium sulfat yang perlu ditambahkan ?


Jawab

= 13 mL x 0,39 gram/mL
= 5,07 gram
Jadi, ammonium sulfat yang perlu ditambahkan sebanyak 5,07 gram
VI.

PEMBAHASAN
Pemurnian protein adalah suatu rangkaian proses isolasi jenis tunggal
dari dari satu campuran kompleks. Pemurnian ini bertujuan untuk
mengetahui lebih jauh mengenai struktur, sifat-sifat kimia maupun fisika
suatu senyawa yang terdapat di bahan alam, sehingga diperoleh senyawa
protein dalam keadaan murni. (Mayes, P.A et al, 1990)
Pada praktikum ini, dilakukan pemurnian protein laktat dehidrogenase
(LDH) dari dada ayam dengan cara pengendapan protein oleh ammonium
sulfat. Proses pengendapan protein dapat dilakukan dengan menggunakan
amonium sulfat berkonsentrasi tinggi atau larutan jenuhnya (salting out).
Salting out merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan protein
yang didasarkan pada prinsip bahwa protein kurang terlarut ketika berada
pada daerah yang konsentrasi kadar garamnya tinggi. Kelarutan protein akan
berkurang bila kedalam larutan protein ditambahkan garam- garam
anorganik. Pengendapan terus terjadi karena kemampuan ion garam untuk
menghidrasi, sehingga terjadi kompetisi antara garam anorganik dengan
molekul protein untuk mengikat air. Hal ini terjadi karena garam anorganik
mempunyai kemampuan untuk mengikat air maka jumlah air yang tersedia
untuk molekul protein akan berkurang. (Bintang, 2010)
Laktat dehidrogenase (LDH) merupakan enzim intraseluler yang
terdapat pada hampir semua sel yang bermetabolisme, dengan konsentrasi
tinggi yang dapat ditemukan pada jantung, otot rangka, hati, ginjal, otak,

dan sel darah merah. LDH juga dapat mengkatalisis perubahan piruvat
menjadi laktat. (Girindra, 1986)
Langkah pertama yang dilakukan adalah penyiapan jaringan, dada
ayam yang akan diambil LDHnya di buang jaringan ikat dengan lemaknya,
yang digunakan hanya dagingnya karena LDH muncul atau dapat diambil
jika ada kerusakan pada jaringan dan dapat disimpulkan bahwa adanya
peningkatan LDH merupakan pertanda telah terjadinya kerusakan jaringan.
(Girindra, 1986)
Kemudian dada ayam tersebut di gerus menggunakan blender dengan
campuran dapar pengekstrasi yang telah dibekukan. Tujuan penggerusan ini
untuk memperoleh protein dari organ jantung tersebut maka protoplasma
akan keluar dan akan diperoleh protein, sedangkan tujuan dari penambahan
dapar pengekstrasi yang telah dibekukan adalah agar protein tidak terjadi
denaturasi karena pada saat di blender suhu didalam menjadi panas jadi
perlu ditambahkan dapar dengan suhu dingin sehingga dapat menstabilkan
suhu pada saat penggerusan dan juga bertujuan agar dapat menginaktivasi
enzim yang bekerja pada sampel, LDH (protein dari ayam) mempunyai suhu
aktif >800C. Jika pada suhu aktif LDH akan tercerna oleh lisosom maka
LDHnya tidak bisa diambil. (Girindra, 1986)
Larutan dapar pengekstraksi tersebut terdiri dari Tris-HCl,2mercaptoethanol, phenylmetylsulfonyl florida (PMSF) dan ethylenediamine
tetraacetic acid (EDTA).Tris-HCl merupakan senyawa organik dengan
rumus (HOCH2) 3CNH2. Tris secara luas digunakan dalam biokimia dan
biologi molekuler. Dalam biokimia, Tris HCl banyak digunakan sebagai
komponen larutan buffer. Tris HCl juga merupakan bahan kimia dengan
sifat dasar, yang memiliki pKa 8,1. Hal ini dapat digunakan untuk
penyangga dan solusi dari perubahan pH yang drastis, menjaga mereka di
kisaran pH 7,0 - 9,0. Sehingga dapat menjaga pHnya agar dapat bekerja
dengan baik. Lalu terdiri dari EDTA yang berfungsi sebagai larutan buffer
dan sebagai pengkhelat yang dapat mengikat ikatan kation sehingga dapat
menurunkan tegangan dan menghasilkan ion untuk menghantarkan arus,

umumnya mengikat ion logam jika terdapat pada sample, sampel yang
digunakan berupa dada ayam yang umumnya bnyak ion Ca 2+ karena
merupakan jaringan yang berotot, lalu terdiri dari 2-Mercaptoethanol yang
berfungsi menghilangkan senyawa polifenol yang terkandung dalam daging
tersebut, dan mendetarurasi protein yang mengkontaminasi LDH yang akan
dimurnikan. (Hamid, 2001)
Setelah itu campuran dada ayam dan dapar pengekstraksi yang telah
homogen dimasukkan ke dalam 4 tabung sentrifugasi yang berbeda dan
disentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan pengadukan 15.000 rpm.
Setelah disentrifugasi terjadi pemisahan, pada bagian atas berupa
supernatant (cairan) yang berwarna peach bening (+) sedangkan pada bagian
bawah berupa pellet dengan endapan berwarna peach (+++). Hal ini sesuai
dengan literatur (Hendra, 1989) dimana prinsip sentrifugasi didasarkan pada
pemisahan olekular dari sel atau organel subselular. Pemisahan tersebut
berdasarkan konsep bahwa partikel yang tersuspensi di sebuah wadah akan
mengendap (bersedimentasi) ke dasar wadah karena adanya gaya gravitasi.
Sehingga laju pengendapan suatu partikel yang tersuspensi tersebut dapat
diatur dengan meningkatkan atau menurunkan pengaruh gravitasional
terhadap partikel. Pengaturan laju pengendapan tersebut dapat dilakukan
dengan cara menempatkan wadah yang berisi suspensi partikel kemesin
sentrifugasi tepatnya pada bagian rotor yang kemudian akan berputar
dengan kecepatan tertentu. Hal tersebut tergantung pada ukuran dan bobot
jenis. Hasil sentrifugasi terbagi menjadi dua, yaitu supernatan dan pellet.
Supernatan adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis
yang lebih rendah. Posisi dari substansi ini berada pada lapisan atas dan
warnanya lebih jernih. Sementara pelet adalah substansi hasil sentrifugasi
yang memiliki bobot jenis yang lebih tinggi. Posisi dari substansi ini berada
pada lapisan bawah dan warnanya lebih keruh. (Hendra, 1989)
Pada sentrifugasi ini digunakan kecepatan pengadukan 15.000 rpm
dengan waktu 20 menit, hal ini menunjukan semakin besar kecepatan
pengadukan semakin banyak pula endapan (pellet) yang dihasilkan dan

semakin lama juga waktu yang dibutuhkan untuk memisahkan campuran


antara supernatant dan pellet. Dapat disimpulkan bahwa kecepatan
pengadukan (rpm) sebanding dengan waktu yang dibutuhkan. (Hendra,
1989)
Langkah

selanjutnya

adalah

filtrasi,

supernatant

disaring

menggunakan kain kasa dan filtratnya di peras hingga tidak ada supernatant
yang terkandung di dalamnya. Supernatant diambil karena didalam
supernatan tersebut mengandung protein. Supernatan yang diambil
kemudian ditambahkan dengan amonium sulfat (NH4)2SO4 sedikit demi
sedikit sebanyak 5,07 gram dan diaduk secara perlahan. Pengerjaan tersebut
dilakukan di dalam gelas kimia yang berisi es batu. Tujuan penambahan
ammonium sulfat adalah untuk mengendapkan protein, ion garam tersebut
mengikat air dan akan borkempetisi dengan molekul protein dalam
mengikat air sehingga kelarutan protein akan berkurang dan protein akan
mengendap. (Hamid, 2001) Didalam pengerjaannya perlu diaduk secara
perlahan agar tidak terjadi denaturasi pada protein dan dilakukan di dalam
gelas kimia yang berisi es batu yang bertujuan agar dengan suhu yang
rendah akan memudahkan proses pengendapan dan mengakibatkan turunnya
daya larut protein sehingga protein mudah berikatan dengan ammonium
sulfat. (Bintang, 2010)
Selanjutnya disentrifugasi kembali, pada sentrifugasi kedua ini yang
diambil adalah pelletnya karena didalam pellet tersebut mengandung protein
yang telah berikatan dengan ammonium sulfat. Kemudian diresuspensi yaitu
disuspensikan kembali dengan cara pellet ammonium sulfat ditambahkan 1
mL dapar Tris lalu diaduk perlahan hingga semua pellet larut, kemudian
dimasukan ke dalam tabung lain yang berisi pellet ammonium sulfat dan
ditambahkan dapar Tris hingga volumenya mencapai 3 mL lalu diaduk
hingga homogen. Tetapi protein tersebut masih belum murni, masih ada
ammonium sulfat yang tersisa sehingga harus di lakukan kromatografi
sebagai tahap pemurnian selanjutnya agar ammonium sulfat dapat
dipisahkan dengan protein. (Bintang, 2010)

Kromatografi

merupakan

suatu

teknik

pemisahan

molekul

berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam
untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan.
Kromatografi yang digunakan pada praktikum ini adalah kromatografi
filtrasi gel. Prinsip dari kromatografi filtrasi gel adalah pemisahan
berdasarkan perbedaan ukuran, molekul yang mempunyai ukuran besar
yang tidak dapat masuk ke daerah gel yang merupakan rongga-rongga gel
sehingga akan keluar dari kolom, sedangkan molekul yang mempunyai
ukuran kecil akan terjerap pada fase diam yang berupa rongga/butiran
berpori. (Poedjiadi, 2005)
Kemudian digunakan salting kolom, kolom kromatografi yang
digunakan adalah sephadex G-150 dengan eluen buffer Tris-HCl pH 8,4.
Sephadex terbuat dari protein berhidrat tinggi dengan pori-pori yang sangat
halus. Kolom Sephadex G-150 yang terjadi dielusi dengan buffer
pengembangnya dengan kecepatan tetesan 6 menit per tetes. (Williamson,
1992). Lalu kolom tersebut digunting bagian bawahnya agar dapar keluar,
setelah dapar keluar seluruhnya kemudian ditambahkan sample berupa
pellet yang telah diresuspensi dan dielusi dengan menambahkan eluen
berupa dapar sebanyak 3 mL. Diperoleh sample (protein) adalah 4,1 mL.
Sebenarnya protein yang di hasilkan masih belum murni dan perlu
dilakukan dengan tahap selanjutnya yaitu dengan cibacron blue. Namun
pengerjaannya tidak dilakukan karena di dalam laboratorium tidak memiliki
cibacron blue sehingga hanya dilakukan sampai tahap kromatografi filtrasi
gel dan protein yang didapatkan belum murni seluruhnya.
VII.

KESIMPULAN
1. Metode yang digunakan untuk

pemurnian protein LDH (Laktat

Dehidrogenase) dari bagian daging dada ayam adalah dengan metode


pengendapan protein dengan ammonium sulfat.
2. Kromatografi yang digunakan adalah kromatografi filtrasi gel yaitu
pemisahan protein dari ammonium sulfat berdasarkan perbedaan ukuran.

3. Diperoleh protein sebanyak 4,1 mL dan ammonium sulfat yang harus


ditambahkan sebanyak 5,07 gram.
VIII.

DAFTAR PUSTAKA
1. Bintang, Maria.2010. Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta:
Erlangga
2. Fried 2006
3. Girindra, Aisjah. 1986. BIOKIMIA I. Jakarta: Gramedia
4. Hamid,Abdul,2001.Biokimia Metabolisme Biomolekul.Jakarta:Penerbit
Alfabeta
5. Hendra Adijuwana. 1989. Teknik pemisahan Dalam Analisis Biologis.
Bogor: IPB Press
6. Mayes, P.A., Granner, D.K., Rodwell, V.W., dan Martin, D.W., 1990,
Biokimia Harper Edisi 20, Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta
7. Patong 2012
8. Poedjadi,Anna.1994.Dasar-dasar Biokimia.Penerbit UI-press.Jakarta
9. Poedjiadi, A., 2005,Dasar-Dasar Biokimia,UI Press, Jakarta
10. Triyono 2007
11. Williamson,K.L & L.F.Fieser. (1992). Organic Experiment 7th Edition.
D C Health ang Company. United States of America.