FRACIONAMIENTO CELULAR

El fraccionamiento celular es usado para investigar la bioqumica y fisiologa de organelos fuera del ambiente
complejo de la clula intacta. El objetivo principal de este experimento es aislar los cloroplastos, ncleo y
mitocondria del tejido de plantas por el mtodo de fraccionamiento celular. Los otros objetivos son examinar
esas fracciones microscpicamente y estimar el coeficiente de sedimentacin de los cloroplastos.
HOMOGENIZACIN
Para preparar los tejidos para el fraccionamiento celular, primero se debe suspender en un medio apropiado (una
solucin amortiguadora, salina azcar isotnica). Para mantener la integridad de los organelos y enzimas
durante el procedimiento de la fraccionacin, todas las soluciones y cristalera deben mantenerse fras. Despus
de rebanar las hojas, el tejido est preparado para la homogenizacin, procedimiento que rompe los enlaces
celulares y libera el contenido celular, sin daar el medio en suspensin. La suspensin de clulas constituyentes
se llama homogenado. Para los tejidos de plantas, la homogenizacin se debe realizar con un mortero (fig.1), al
cual se le aade arena como abrasivo. En este proyecto los cloroplastos se aislarn de la espinaca; ncleos y
mitocondria se aislarn de la coliflor.
CENTRIFUGACIN
Debido a las diferencias en tamao y densidad, cada componente celular est sujeto a una fuerza centrfuga. La
fuerza generada por la centrfuga se expresa como fuerza centrfuga relativa (RCF) en unidades de g. La RCF es
una funcin de velocidad de centrifugacin en revoluciones por minutos (rpm) y la distancia de partculas desde
el eje de rotacin. Conociendo esta distancia (x) y el (rpm), se puede determinar el RCF de la ecuacin: RCF =
1.19 x 10-5 (rpm)2x, donde x se toma como la distancia (en cm) desde el eje de rotacin hasta el margen de
afuera del tubo de centrfuga.
CENTRIFUGACIN DIFERENCIAL
En la centrifugacin diferencial, el homogenado es centrifugado repetidas veces a altas velocidades,
sedimentndolo progresivamente en pequeas partculas. El mtodo est ilustrado en la fig. 2. La primera
centrifugacin es a 600g por 10 minutos, el cual sedimenta la fraccin nuclear. Este pellet contiene el ncleo,
clulas intactas y tejido. La prxima separacin es el sobrenadante postnuclear o partculas suspendidas en
lquido sobre el pellet nuclear, el cual es transferido a otro tubo de centrfuga y se centrfuga a 10,000 g por 30
minutos en una centrfuga refrigerada. El material sedimentado se conoce como fraccin mitocondrial; ste
contiene mitocondria y micro cuerpos.
EJEMPLO:

EN EL HGADO

PROC
EDIMI
ENTO
1. Perfusin y lavado
del hgado, para el
lavado
utilizaremos KCL.

1. Homogenizacin
de la muestra, en
un
trituramos

mortero
el

3. Contrapeso y se
lleva la muestra
ala centrifugadora
a 5 minutos.

4. La primera centrifugacin que en su

sedimento encontramos: ncleos y
fragmentos de la membrana plasmtica
luego llevamos el sobrenadante a una
segunda centrifugacin por 10 minutos.
LA SANGR

5. Se obtuvo el segundo
centrifugado en el cual
encontramos
en
su
sedimento: mitocondrias y
lisosomas.

EN LA SANGRE

a. Se extrae sangre de un
compaero de clase. Y
se le agrega a un tubo
de ensayo eliminando
cualquier coagulo que
se forme.
b. Se contrapeso

c. Se
lleva
a
centrifugacin por
10
minutos
obteniendo el suero
sanguneo

RESULTADOS:

N CENTRIFUGACIN

TIPO

OBSERVACIN

PRIMERA
CENTRIFUGACIN

FRACCIONAMIENTO
NUCLEAR

Ncleos, membrana

SEGUNDA
CENTRIFUGACIN

FRACCIONAMIENTO
MITOCONDRIAL

mitocondria y lisosomas

DISCUSIN:
Fraccionamiento sub celular consiste en una tcnica bioqumica utilizada para separar ls distintos organelos y
componentes celulares para su estudio, en la prctica primero se procedi a decolorar el hgado de pollo el cual
se realiz por la tcnica de perfusin la cual consiste en inocular unan solucin de nuestra muestra de hgado con
el fin de eliminar el tejido con una solucin buffer (eliminar el color rojo, la sangre) para ello utilizamos KCl
0,154M helado.2
Cuando se perfunde se suele realizar en un rgano aislado lo cual permite el bombeo de una disolucin isotnica,
esta se encarga de aportar todos los nutrientes necesarios y a su vez eliminar desechos.

Luego se procede al fraccionamiento y homogenizacin, luego la muestra se coloc en un tubo de ensayo con
sacarosa, ya que le da un medio adecuado a la muestra seguida de centrifugacin a distintas velocidades y
tiempos, pues en la primera centrifugacin que se realiz en 5 minutos encontramos en el sedimento ncleos,
membrana plasmtica, en la segunda centrifugacin observamos en el sedimento mitocondrias y lisosomas.
Finalmente en el sobrenadante se encuentran partculas menos densas esta se debera llevar a una tercera
centrifugacin pero por la premura del tiempo no se lleg a realizar. Dando fin con la segunda centrifugacin a la
prctica. (1)(2)(3)
Resumen
Primero se procedi a la extraccin del rgano en este caso del hgado, el cual va a ser colocado en una placa
Petri, para luego ser perfundido con KCl helado, siendo inoculado con una jeringa en el tejido, luego se procede
al fraccionamiento y homogenizacin, se llev la muestra a 2 tubos con sacarosa, contrapesamos y finalmente
sometemos a centrifugacin la primera a 5 minutos y la segunda a 10 minutos en las cuales observamos fraccin
nuclear y fraccin mitocondrial respectivamente.
CONCLUSIONES:
1. Se identific tericamente las fracciones de sedimento y sobrenadante en los 2 procesos de centrifugacin
a las cuales se someti al hgado; al igual que la sangre pero esta se someti a una sola centrifugacin de
10 minutos obteniendo el suero sanguneo.
2. Se identific la fraccin celular nuclear y mitocondrial por centrifugacin diferencial.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS:
1. KOOCMAN, J. Bioqumica: Textos y atlas. (3, ed.). Argentina: Panamericana. p: 198
2. CAMPBELL, N. (2008). Biologa. (7! ed.).Argentina: Panamericana. pp: 97 100
3. LODICH, Berk. (2008). Biologa Celular y Molecular. (5, ed.) Argentina: Panamericana p: 167

PUNTO ISO ELECTRICO

El Punto Isoelctrico (IEP) est definido como el pH en el
cual las cargas positivas igualan a las cargas negativas y no existe movimiento en un campo elctrico.
En su calidad de protena, la gelatina exhibe una conducta anfotrica debido a la presencia de grupos funcionales
de aminocidos y grupos amino y carboxil terminales. En medios acdicos, es decir en presencia de altas
concentraciones de iones H+, la gelatina tiene carga positiva. En medios alcalinos, es decir en presencia de iones
OH-, la gelatina tiene carga negativa. En el punto isoelctrico (IEP) las cargas positivas de los radicales NH3+
igualan a las cargas negativas de los radicales COO-.
El IEP es una propiedad intrnseca de la gelatina, determinada por los tratamientos de las materias primas y el
tipo de proceso:

Las gelatinas Tipo A (cidas) presentan un IEP que oscila entre 6 - 9.5. Sin embargo, el tratamiento
previo de ciertas materias primas (como por ejemplo el proceso de depilado del cuero o piel) pueden bajar el
IEP a menos de 6.

Las gelatinas Tipo B (alcalinas) tienen un IEP que oscila entre 4.5 5.6.
La gelatina con un IEP bajo se debe al fenmeno de amidacin de aminocidos. Las gelatinas de Tipo A y B
provenientes de materias primas tratadas o pre tratadas con sustancias alcalinas que eliminan los grupos de
amidas, presentan un IEP bajo.
CARACTERSTICAS
Las funcionalidades de las protenas se ven afectadas cuando se aproximan al IEP, debido a la atraccin
electroesttica de los grupos con carga opuesta. De esta manera, en el IEP las propiedades de la gelatina
coinciden con los valores mximos o mnimos. Mnimos : hidratacin, viscosidad y gelificacin ; mximos:
turbidez, fuerza de gel, poder de espumado y sinresis-

PROCE

El IEP es til para explicar las posibles interacciones de la gelatina con otros ingredientes, en particular los
polmeros aninicos. Por ejemplo, una gelatina Tipo B interacta mejor con un polmero aninico (ej.

DIMIE

carrageninas en el mousse de chocolate) para evitar la precipitacin por incompatibilidad, que depende de las
condiciones de Ph.

NTO

1 tubo: 3,2 Ac. Actico + 6,8 H2O destilada.

2 TUBO: 5 mL de solucin Tubo 1 + 5 Ml
de H2O destilada.
3 TUBO: 5 mL de solucin Tubo 2 + 5 Ml
de H2O destilada.
4 TUBO: 5 mL de solucin Tubo 3 + 5 Ml
de H2O destilada.
Agregamos a 9 tubos de ensayo cido
actico ms agua destilada.

5 TUBO: 5 mL de solucin Tubo 4 + 5 Ml

de H2O destilada.
6 TUBO: 5 mL de solucin Tubo 5 + 5 Ml

Agregamos a 1 ml de casena en
acetato de sodio 0,1 N a cada tubo.
Obteniendo un efecto inmediato.

de H2O destilada.
7 TUBO: 5 mL de solucin Tubo 6 + 5 Ml
de H2O destilada.

Despus de 30 minutos calentar

ligeramente cada uno de los tubos y
apreciar el efecto sobre la solubilidad.
Anotar.

8 TUBO: 5 mL de solucin Tubo 7 + 5 Ml

de H2O destilada.
9 TUBO: 5 mL de solucin Tubo 8 + 5 Ml
de H2O destilada. (de este tubo se saca 5 ml y
se elimina)

Finalmente agregamos una gota de

fenolftalena. Mezcla.

Sucesivamente se le agrego NaOH

hasta la aparicin de color rosado.

RESULTADOS:
N DE TUBO
9pH de cada tubo
Enturbiamiento al mezclar

3,5

3,8

4,1

4,4

4,7

5,0

5,3

5,6

5,9

Enturbiamiento a ppdo a 30

Solubilidad despus de calentar

Solubilidad despus de agregar NaOH

10%

O= no cambio

+ = Opalescencia X= ppdo

APLICACIN DE LA ECUACION DE HENDERSON HASSELBACH

pH= pK +log

[SAL]
[ CIDO]

La concentracin de cido es 1,6 ml de cido 1 N en el tubo 1 (1,6 ml. 1N = 16ml. 0,1 N)

La Concentracin de sal es de 0,1 N en cada caso.
pK Ac. Actico = 4,7
1
=3,5
16

1
pH=4,7 +log =4,4
2

1
pH=4,7 +log =3,8
8

1
pH=4,7 +log =4,7
1

pH=4,7 +log

1
pH=4,7 +log =3,8
4

pH=4,7 +log

1
=5,0
0,5

pH =4,7 +log
1
pH=4,7 +log

pH =4,7 +log

1
=5,3
0,25

=5,6
0,125
1
0,625 =5,9

PI = 4,4

DISCUSIN:
El punto isoelctrico en una protena tiene que ver con las cargas positivas y con las cargas negativas, siendo
importante saber que esta propiedad es especfica de cada protena, utilizando una muestra practica de casena.
El PI no es ms que una caracterstica de las protenas donde estn neutras y por tal motivo precipitan, esta
caracterstica es la que se resalta en la prctica al comparar los tubos ya que nos permite diferenciar donde se
produce el punto isoelctrico, se ve cuando hay mayor precipitado. En los diferentes tubos se observaron
enturbecimiento y opalescencia.

Un factor importante es la intervencin de color y tiempo. Luego cuando agregamos el indicador en pH acido
(fenolftalena) podemos ver que mientras lo alejes del pH el indicador desaparece.
RESUMEN:
En esta prctica se enumeran 9 tubos, en el primer tubo se mide 3,2 ml de cido actico 1N y 6,8 ml de agua
destilada, luego se mide 5 ml de agua para los tubos restante. Despus sacamos 5ml del primer tubo y luego
pasarlo al segundo tubo este procedimiento se repite hasta llegar al noveno tubo donde se elimina esos 5ml.
Luego se agrega 1ml de casena en acetato de sodio a cada tubo y observamos los cambios, as dejamos pasar 30
minutos y observamos los cambios; calentamos los tubos ligeramente, luego se le agreg fenolftalena,
sucesivamente se le agrego NaOH hasta la aparicin de color rosado.
CONCLUSIN:

Se determin el PI de una protena que fue de 4,4 relacionando la solubilidad mnima con el pH de la
solucin en que ella se produce.

VITAMINA C
La vitamina C es una vitamina hidrosoluble sensible al calor. Qumicamente hablando, se trata de cido Lascrbico y sus sales, los ascorbatos (los ms comunes, que son ascorbatos de sodio y de calcio).
ACCIN
La vitamina C es un cofactor enzimtico implicado en diversas reacciones fisiolgicas (hidroxilacin). Es
necesaria para la sntesis del colgeno y de los glbulos rojos, y contribuye al buen funcionamiento del sistema
inmunitario. Tambin juega un papel en el metabolismo del hierro, en la transformacin de dopamina
en noradrenalina y en la biosntesis de carnitina. Bajo su forma oxidada, atraviesa la barrera hemato-enceflica
para acceder al cerebro y a varios rganos. Muy frgil en solucin, se destruye al contacto con el aire, por la luz o
el calor. Se trata de un antioxidante, molcula capaz de contrarrestar la accin nociva de oxidantes como los
radicales libres. Con este fin, tambin se emplea la forma R- del cido ascrbico, la cual, al contrario que la
forma

L-,

no

presenta

actividad

vitamnica.

SOS TERAPUTICOSU
Segn varios terapeutas e investigadores que hacen uso de dosis farmacolgicas de ascorbatos, si esta molcula
es administrada bajo una forma adecuada, por medio de tcnicas apropiadas, en dosis suficientemente frecuentes,
en conjuncin con ciertos agentes y durante un perodo suficiente, puede prevenir y, a menudo, curar, un gran
nmero de enfermedades, corrientes o raras, mortales o no, particularmente la gripe y las enfermedades
coronarias. Sin embargo, se ha demostrado que es errnea la creencia popular de que la vitamina C evita el
resfriado, aunque s puede acortar ligeramente su duracin.
Se utiliza tambin como desintoxicante de algunos medicamentos y drogas, y tiene la capacidad de evitar la
formacin de nitritos y aminas cancerosos por su poder antioxidante. Recientemente se emplea en la prevencin y
tratamiento de la enfermedad del viajero (cinetosis).
Apoyo al sistema inmunitario
El cido ascrbico apoya el sistema inmune (los glbulos sanguneos blancos). La vitamina C fortalece no slo
las clulas inmunes (linfocitos y macrfagos) sino tambin la concentracin de inmunoglobulinas en el suero
sanguneo.
Regulacin del colesterol
Un estudio que data de 1986 indica que la vitamina C podra tener un papel importante en la regulacin de la
sntesis del colesterol.
Vitamina C y plomo
En 1939, 34 trabajadores que haban absorbido plomo fueron tratados con vitamina C. Recientemente, un estudio
sobre animales mostr que la vitamina C tena un efecto protector contra la intoxicacin por plomo sobre la
funcin nerviosa y muscular. Entre fumadores, la administracin de 1000 mg de vitamina C permiti una
reduccin media del 81% de las concentraciones sanguneas de plomo, mientras que 200 mg quedaron sin efecto.
Los autores concluyeron que un suplemento de vitamina C podra representar un modo econmico y prctico de
hacer bajar las concentraciones de plomo en la sangre.
Autismo
Un suplemento de vitamina C reduce la gravedad de los sntomas en nios que sufren autismo.
Traumatologa
La aparicin del sndrome de desfallecimiento multivisceral, que para los traumatlogos es uno de los principales

signos anunciantes de defuncin, aparece menos a menudo entre los pacientes que reciben vitamina C. Esta
vitamina reduce tambin la duracin de la estancia en cuidados intensivos.
Fertilidad
Entre hombres infecundos, se demostr que un suplemento de vitamina C mejoraba la cualidad del esperma
(morfologa y movilidad de los espermatozoides) y aumentaba el nmero de espermatozoides.

PRO
CEDIM

Extraer el jugo de limn.

IENTO
Se prepara una dilucin 0,1/2 en
una solucin actica
metafosfrica.

Se titula la muestra con una

solucin de 2,6
diclorofenolindofenol.

Con la titulacin tomara un

color ligeramente rosado.

RESULTADOS:
DETERMINACIN CUANTITATIVA:
Gb=0,3 ml
Ga=1,2 ml
GaGb=0,9 ml

 1ml0,12 mgac . asc .

0,108 mg0,1ml

0,9 mlx

x100 ml

x=0,108 mg ac . asc .

x=1,8 mg

DISCUSIN:
En esta prctica se pudo observar la manera en como la vitamina c reacciona con la solucin 2,6
diclorofenolindofenol a raz que se forma un complejo coloreado entre la solucin y la vitamina C, debido que
esta es un tipo de reaccin acido-base.
Que se encontr que la vitamina c es el zumo de limn en el cual la muestra fue diluida con una solucin actica
metafosfrica y titulada con la solucin 2,6 diclorofenolindofenol y observamos el cambio de color, que pasa de
azul oscuro a rosa dbil. El cido ascrbico (vitamina C) se determin qumicamente en el laboratorio basndose
en su fuerte capacidad reductora; que es capaz de reducir al 2,6 diclorofenolindofenol (azul en medio bsico y
rojo en medio acido) a un compuesto incoloro. El 2,6 diclorofenolindofenol en este caso acta como un solvente
indicador y la soluciona Actico metafosfrica como una solucin extractora, la cual se hace bsica para poder
cuantificar.
As comparando los resultados de los distintos alimentos analizados podemos observar que la cantidad de
vitamina c en ellos es muy variable.
Tambin cabe mencionar que la vitamina c se degrada a temperaturas por lo que se recomienda no cocer por
demasiado tiempo, ya que esto conlleva a la desnaturalizacin e inactivacin de las vitaminas cuando lo
ingerimos.
RESUMEN:
En el desarrollo de la presente prctica, se determin cuantitativamente el porcentaje de vitamina C en el limn.
Primero se extrajo el zumo de limn, 0,1 ml y se diluyo en una solucin actica metafosfrica, 0,19 ml logrando
una dilucin 1/20.
Luego se prepar el blanco utilizando 2 ml de solucin actica metafosfrica titulando con el indicador. Se
procedi a calcular del promedio del sol. Blanco. Con la dilucin de la muestra ya realizada se empez a titular
con 2,6 diclorofenolindofenol y hasta la variacin del color ha rosado dbil.
CONCLUSIN:
-

Se determin cuantitativamente que el jugo de limn presenta una cantidad de Ac. Ascrbico de 1,8 mg.