1

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

BAB I
PENDAHULUAN
A. LATAR BELAKANG
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus,
spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi
beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal,
diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi
monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum
hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung. Melihat
dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain
bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk
mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel
bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam
penelitian-penelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini
adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri dengan
senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan
ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun
pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

pewarna asam dan pewarna basa. Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan

yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta
mengikuti aturan dasar yang berlaku. Oleh karena itu yang melatar
belakangi praktek ini yaitu untuk mengetahui teknik pewarnaan
mikroorganisme sehingga mempermudah kita dalam melihat bagianbagian bakteri. Inti/nucleus
Dengan mikroskop

electron tampak bahwa badan atau inti tidak

b.

mempunyai dinding inti/membran inti.

Struktur sitoplasma
Bahan sel yang dikandung didalam membran sitoplasma dibagi

c.

menjadi : Daerah sitoplasma,daerah kromatin,bagian zat cair.

Membran sitoplasma
Membran sitoplasma disebut juga membrab sel yang komposisinya

d.

terdiri dari fosfolipid(20-30%).

Dinding sel
Dinding sel adalah suatu struktur yang kaku yang memberi bentuk

e.

pada sel.
Kapsul
Ukuran kapsul

f.

sangaat

dipengaruhi

ditumbuhkannya bakteri tersebut.

Flagel

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

oleh

medium

tempat

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

Flagel adalah bagian yang berbentuk seperti benang/rambut yang

teramat tipis mencuat menmbus dinding dibawah membran sel didalam

g.

sitoplasma.
Piil = fimbriae
Beberapa bakteri gram negatif memiliki rambut pendek

dan keras

yang disebut pili,berukuran lebih kecil,lebih pendek dan lebih banyak

h.

dari pada flagella.

Spora
Spesies-spesies tertentu bakteri menghasilkan spora,diluar sel
vegetatif.
Selain itu bakteri juga memiliki morfologi. Adapun bentuk bakteri
bermacam-macam yaitu sebagai berikut :

1.

Bakteriberbentukbulat ( bola )
Bakteri bulat dinamakan juga kokus (coccus) dapat dibedakan

atas :
a.

Monokokus : Bakteri yang berbentuk bola tunggal,misalnya

neisseria gonorrhoeae,penyebab penyakit kencing nanah.

b.
Diplokokus : Bakteri berbentuk bola yang bergandengan dua
dua,misalnya diplococcus pneumoniae,penyebab penyakit pneumonia
atau radang paru-paru.

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

c.

Sarkina : Bakteri berbentuk bola yang berkelompok empat-

empat,sehingga bentuknya mirip kubus.

d.
Sterpkokus : Bakteri bentuk bola yang berkelompok
memenjang membentuk rantai.
e.
Stafilokokus : Bakteri berbentuk bola yang berkoloni
membentuk sekelompok sel tidak teratur,sehingga bentuknya mirip
dongkolan buah anggur.
2.
Bakteri berbentuk batang
Bakteri berbentuk batang dinamakan basilus (bacillus yang berarti
batang). Bentuk basilus dapat pula dibedakan atas :
a.
Basil tunggal : Bakteri yang hanya berbentuk satu batang

b.

tunggal misalnya salmonella typhi,penyebab penyakit tifus.

Diplobasil : Bakteri berbentuk batang yang bergandengan

c.

duadua.
Sterptobasil : Bakteri berbentuk batang yang bergandengan
memanjang

3.

membentuk

rantai

misalnya

bacillus

anthracis,penyebab penyakit antraks.

Bakteri berbentuk melilit
Bakteri berbentuk melilit,yang dinamakan spirillum atau spiral. Ada
3 macam bentuk spiral,yaitu sebagai berikut :
a.
Spiral:golongan
bakteri
yang
bentuknya
spiral,misalnya spirillum. Sel tubuhnya umumnya kaku.

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

seperti

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

b.

Vibrio atau bentuk koma yang dianggap sebagai bentuk spiral

tak sempurna,misalnya vibrio cholerae. Penyebab penyakit

c.

kolera.
Spirochaeta:golongan bakteri berbentuk spiral yang bersifat
lentur pada saat bergerak,tubuhnyan dapat memenjang dan
mengerut.

B. RUMUSAN MASALAH
Rumusan masalahnya adalah bagaimana membedakan bakteri gram
positif dan gram negatif melalui pewarnaan?
C. TUJUAN
Tujuannya adalah untuk membedakan bakteri gram positif dan gram
negatif melalui pewarnaan.
D. MANFAAT
Manfaat dari pembuatan makalah ini adalah dapat mengetahui cara
pewarnaan bakteri khususnya pewarnaan Gram dan perbedaan antara
bakteri Gram positif dan Gram negatif.

1.

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Teori Umum
Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena
tidak mengadsorpsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang
menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme
ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan
cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan.
Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti
spora dan bahan infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat.
Pewarnaan yang digunakan untuk melihat salah satu struktur sel
disebut pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang digunakan
untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang
memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif.
Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang
memilihkan bakterinya menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan
tidak tahan asam (Dwidjoseputro.1998).

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian

Gram

pada

tahun

1884.

Dengan

metode

ini.

Bakteri

dapat

dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri

gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri
terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan
oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias
dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel
seperti Mycoplasma sp (Waluyo, 2004).
Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh
waktu pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan
yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang digunakan adalah
garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan
negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna
dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan
basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat
warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung
warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna
negatif (Hadiutomo. 1990).
NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas

kaca objek. Ulasan ini kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang
terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak sehingga dapat terlihat
bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering kali
dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat
terutama bila suspensi tersebut berasal adari bukan media padat.
Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila terlalu encer, maka akan
diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparatnya
(Sutedjo.1991).
Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat
warna untuk meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan
sekelilingnya. Lazim, prosedur pewarnaan ini menggunakan zat warna
basa seperti seperti crystal violet, biru metilen, karbol fuchsin basa,
safranin atau hijau malakit. Kadang kala digunakan zat warna negatif
untuk pewarnaan sederhana : zat warna asam yang sering digunakan
adalah nigrosin dan merah kongo Prosedur Pewarnaan sederhana
mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan untuk
melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri pada
NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

bakteri dikenal bentu yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral.
Dengan pewarnaan sederhana dapat juga terlihat penataan bakteri.
Pada coccus dapat terlihat pewarnaan seperti rantai (stertococcus),
buah anggur ( stafilococcus), pasangan (diplococcus), bentuk kubus
yang terdiri dari 4 atau 8 (saranae).
Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat
basa, tetapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif, pada metode ini
mikroba dicampur dengan tinta cina atau nigrosin, kemudian digesekkan
diatas kaca objek.Zat warna tidak akan mewarnai bakteri, akan tetapi
mewarnai lingkungan sekitar bakteri. Dengan mikroskop mikroba akan
terlihat tidak berwarna dengan latar belakang hitam (Lay,1994)

BAB III
PEMBAHASAN
A. Pengertian Pewarnaan Gram Bakteri

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

10

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satu

macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri
dan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya . Pewarnaan ini dapat
menggunakan pewarnaan basa pada umumnya antara lain kristal violet ,
karbol , fuchsin , dan safranin.

Pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang

ditujukan terhadap bakteri yang sulit diwarnai, dimana bakterinya tidak

diwarnai

melainkan

latar

belakangnya,

Metode

pewarnaan

negatif

merupakan suatu metode perwarnaan umum, dimana digunakan larutan zat

warna yang tidak meresap ke dalam sel-sel bakteri melainkan melatar
belakangi sehingga kelihatan atau nampak sebagai bentuk-bentuk kosong
tak berwarna (negatif).
Pewarnaan gram merupakan

pewarnaan

yang

digunakan

untuk

mengelompokan bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram

positif akan mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak
berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan
kehilangan zat warna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan
sewaktu diberi zat pewarna air fucsin atau safranin akan tampak
berwarna merah. Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh perbedaan

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

11

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

dalam struktur kimiawi dinding selnya. Pewarna yang digunakan dalam

pewarnaan gram antara lain kristal violet, alkohol, safranin, dan iodine.
Prinsip pewarnaan negatif yaitu suatu metode pewarnaan tidak
langsung dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap kedalam
sel bakteru melainkan ke dalam latar belakangnya. Sedangkan Prinsip
pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri ;
sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna
dan penambahan larutan pencuci.Prinsip pewarnaan spora yaitu suatu
metode pewarnaan yang menggunakan malachite green dan safranin, yang
dalam hasilnya pewarnaan akan muncul warna hijau pada sporanya dan
warna merah pada sel vegetatifnya
Kristal violet atau ungu gentian adalah pewarna triaryl methane.
Pewarna ini digunakan sebagai histologis noda dalam metode gram
klasifikasi bakteri. Kristal violet memiliki sifat sifat anti bakteri, jamur
dan obat cacing, dan sebelumnya penting sebagai antiseptik topikal
Lugols yodium, juga dikenal sebagai solusi lugol, merupakan solusi dari
iodium dan iodida dalam air. Larutan yodium lugol digunakan sebagai
antiseptik dan desinfektan, dan untuk desinfikasi darurat air minum, dan
sebagai reagen untuk deteksi pasti di dalam laboratorium, pewarnaan dan

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

12

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

tes meis. Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan
sitologi. Safranin digunakan sebagai conterstain dalam beberapa protokol
pewarnaan. Mewarnai seluruhinti sel darah merah. Ini adalah counterstain
klasik dalam gram stain. Hal ini juga dapat digunakan untuk deteksi tulang
rawan, musin dan butiran sel mast. Safranin biasanya memilki struktur
kimia. Ada juga trimetil safranin kedua senyawa berperilaku dasarnya
identik dan aplikasi pewarnaan biologi dan kebanyakan prosedur safranin
tidak membedakan diantara keduanya. Persiapan safranin komersial sering
mengandung campuran dari kedua jenis. Safranin juga digunakan sebagai
indikator redok dalam kimia analitik Fiksasi adalah suatu metode
persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik dengan
menggunakan grutaldehid dengan proses pemabakaran. Fiksasi bertujuan
untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek glass
tanpa merusak struktur selnya.
(kokus,

basil,

spirilum,

dan

Berbagai macam tipe morfologi bakteri

sebagainya)

dapat

dibedakan

dengan

menggunakan pewarna sederhana. Istilah pewarna sederhana dapat

diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat
warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

13

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa)

sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana
umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif).
Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat
macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan
diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau
jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna
pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan
sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara
sel-sel microbe atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan
diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian
dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk
dalam

pengecatan

ini

adalah

pengecatan

endospora,

flagella

dan

pengecatan kapsul. Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak

mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan
zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna
mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan
sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

14

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yng

mengandung zat pati dan granula fosfat. Melihat dan mengamati bakteri
dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna
juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka
dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat
terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel
bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitianpenelitian mikrobiologi.
Beberapa faktor kesalahan pada praktikum antara lain pemberian zat
warna yang berlebihan sehingga sel bakteri tidak nampak, kurang
maksimalnya dalam proses fiksasi sehingga masih ada bakteri yang belum
mati, dan faktor yang lain adalah pada proses pencucian terlalu deras
dalam membilas zat warna dengan air sehingga dapat menyebabkan
bakteri larut terbawa air.
B. Tujuan Pewarnaan
Tujuan pewarnaan terhadap mikroorganisme ialah untuk :
1.

Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun fungi.

2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad

3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad.

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

15

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

4.

Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifatsifat fisik dan kimia dapat diketahui.

C. Teknik Pewarnaan
Langkah-langkah utama teknik pewarnaan ialah :
1.

Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal

atau tipis

2.

Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan

kimia seperti sabun, formalin, fenol.

3. Aplikasi zat warna : tunggal, atau lebih dari 1 zat warna

D. Macam-Macam Pewarnaan
Dalam pewarnaan garam bakteri ini tentunya digunakan cat-cat khsus
untuk mewarninya. Pewarna asam memiliki negatif charge kromogen,tidak
akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

16

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

pada permukaan bakteri. oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat
dengan latar belakang berwarna.
Komposisi Cat Gram

1. Gram A : Kristal Gentian Violet.

2. Gram B : KI dan I2
3. Gram C : Aseton + EtOH
4. Gram D : Safranin

1. Pengecatan Gram
Cat Gram A

Kristal Violet

: 2 gram

Etil Alkohol 95

: 20 ml

Ammonium Oksalat

: 0,8 gram

Akuades

: 80 ml

Cat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristalviolet) dan

merupakan cat primer. Cat Gram A merupakan cat primer yang akan
memberi warna mikroorganisme target. Semua mikroorganisme akan
berwarna ungu sesuai warna cat Gram A.

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

17

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

Cat Gram B

Yodium

: 1 gram

Kalium Yodida

: 2 gram

Akuades

: 300 ml

Cat Gram B berwarna coklat dan merupakan cat Mordan, yaitu cat
atau bahan kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap
mikroorganisme target. Pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik
(lebih kuat).
Cat Gram C

Aseton

: 50 ml

Etil Alkohol 95 %

: 50 ml

Cat Gram C tidak berwarna dan berfungsi untuk melunturkan cat

sebelumnya. Akibat pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan:
a. Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu,karena tahan
terhadap alkohol. Ikatan antara catdengan bakteri tidak dilunturkan
oleh alkohol. Bakteriyang bersifat demikian disebut bakteri Gram
positif.

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

18

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

b. Bakteri akan tidak berwarna, karena tidak tahanterhadap alkohol.

Ikatan antara cat dengan bakteridilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang
bersifat demikiandikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif.
Cat Gram D

Safranin
Etil Alkohol 95 %
Akuades

: 0,25 gram
: 10 ml
: 90 ml

Cat Gram D berwarna merah dan merupakan cat sekunder atau

kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non
target. Cat sekunder mempunyai spektrum warnayang berbeda dari cat
primer. Akibat pemberian cat Gram D, akan terjadi 2 kemungkinan :
a. Bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu, karena telah
jenuh mengikat cat Gram A sehingga tidak mampu mengikat cat Gram
D.
b. B a k t e r i G r a m n e g a t i v e a k a n b e r w a r n a merah, karena cat
sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C maka akan mampu
mengikat cat Gram D.

M i k r o o r g a n i s m e b e r w a r n a ungu Gram positif.

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

19

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

M i k r o o r g a n i s m e b e r w a r n a merah Gram negatif.

1. Teori Salton :
a) G r a m n e g a t i v e : k a d a r l i p i d t i n g g i ( 2 0 % ) d i dalam
dinding sel. Zat lipid ini akan larut selama pencucian dengan alkohol.
Pori-pori pada dinding sel membesar,sehingga zat warna yang sudah
diserap mudah dilepaskan dan bakteri menjadi tidak berwarna.
b) Bakteri Gram positif : mengalami denaturasi protein pada dinding
selnya akibat pencucian dengan alkohol.Protein menjadi keras dan
beku, pori-pori mengecil sehingga kompleks Kristal yodium yang
berwarna ungu dipertahankan dan bakteri akan tetap berwarna
ungu.

2. Teori permeabilitas dinding sel

Gram positif : mempunyai susunan dinding yang kompak dengan lapisan

peptidoglikan yang terdiri dari 30 lapisan. Permeabilitas dinding sel
kurang, dan kompleks Kristal yodium tidak dapat keluar.

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

20

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

Gram negatif : lapisan peptidoglikan yang tipis,hanya 1 2 lapisan

dan susunan dinding selnya tidak kompak. Permeabilitas dinding sel
lebih besar sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks kristal
yodium.
Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan
sebagai berikut :
1.

Pewarnaan sederhana
Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan

hanya untuk melihat bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna

yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri
(kokus,

basil,

spirilum,

dan

sebagainya)

dapat

dibedakan

dengan

menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya

digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah
bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya
bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang
digunakan

untuk

pewarnaan

sederhana

umumnya

(komponen kromoforiknya bermuatan positif).

bersifat

alkalin

Zat warna yang dipakai

hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut.

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

21

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat

morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak
digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan
fukhsin-karbol (5 detik).
Adapun prosedur kerjanya yaitu :

Pewarnaan Gram Sederhana

1. Bakteri disiapkan untuk diamati
2. Dibersihkan object glass atau kaca objek dengan kapas atau tisuue
3. Di pindahkan bakteri dengan mengunakan jarum inoculum pada kaca

2.

objek
4. Difiksasikan dengan api Bunsen hingga kering dan merata
5. Di tetesi dengan pewarna crystal violet ditunggu 30 menit
6. Dilap kaca objek dengan tissue
7. Di cuci aquades
8. Di tutup kaca objeknya
9. Di amati dibawah mikroskop
Pewarnaan differensial
Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna

seperti pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam.

Adapun prosedur kerjanya yaitu :
1.
2.
3.
4.

Bakteri disiapkan untuk diamati

Dibersihkan kaca objek dengan kapas
Diberi label warna bakteri pada kaca objek
Di pindahkan bakteri dengan mengunakan jarum inokulasi 1 ulasan pada
kaca objek.

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

22

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

5. Difiksasi kaca objek dengan api Bunsen hingga kering .

6. Diteteskan Kristal violet sebagai pewarna utama.
7. Di tunggu 1 menit
8. Dicuci dengan aquades
9. Diteteskan larutan 1000 l
10. Ditunggu 1 menit dan Dicuci aquades
11. Diberi larutan etanol setetes hingga etanol jatuh jernih dan dicuci
lagi dengan aquades
12. Ditetes safranin dan di tunggu 30 detik dan dicuci aquades
13. Di tutup kaca objeknya
14. Diamati mikroskop
Adapun Penjelasan sebagai berikut:
a) Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni grampositif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel
mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan
Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik
ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri
Klebsiella pneumoniae. Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat
dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif
berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau
sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

23

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme

yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
1. Zat warna utama (violet kristal)
2. Mordan (larutan Iodin) yaitu

senyawa

yang

digunakan

untuk

mengintensifkan warna utama.

3. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic
yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.
4. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai
kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan
dengan alkohol.
b) Pewarnaan Tahan Asam
Beberapa
spesies
bakteri

pada

genus

Mycobacterium,

Cryptosporidium dan Nocardia tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan

sederhana.

Namun,

mikroorganisme

ini

dapat

diwarnai

dengan

menggunakan Karbol Fuchsin yang dipanaskan. Panas membuat pewarna

dapat terserap oleh sel bakteri karena panas dapat menghilangkan lapisan
lilin pada dinding sel bakteri. Sekali bakteri tahan asam menyerap karbol
fuchsin, maka akan sangat sulit untuk dilunturkan dengan asam-alkohol,
oleh karena itu merka disebut bakteri tahan asam.

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

24

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

Bakteri tahan asam memiliki kadar lemak (asam mycolic) yang tinggi
pada dinding sel mereka. Pada pewarnaan bakteri asam menggunakan
metode Ziehl-Neelsen (juga disebut Hot Stain), bakteri tahan asam akan
berwarna

merah

karena

menyerap

pewarna

karbol

fuchsin

yang

dipanaskan, karena pada saat pemanasan dinding sel bakteri yang memiliki
banyak lemak membuka sehingga pewarna dapat terserap. Namun tidak
dapat dilunturkan dengan asam alkohol karena pada saat suhu normal
lemak pada dinding sel bakteri kembali menutup, sehingga ketika diwarnai
dengan pewarna tandingan, yaitu Methylene Blue, warnanya tetap merah.
Berbeda dengan bakteri tidak tahan asam, ia akan menyerap pewarna
tandingan yaitu methylene blue sehingga berwarna biru.

Pada metode Kinyoun-Gabbet, tidak perlu dilakukan pemanasan, maka

dari itu metode Kinyoun-Gabbet juga disebut Cold Stain. Metode KinyounGabbet tidak perlu dilakukan dengan pemanasan karena pada pewarna
NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

25

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

Kinyoun terdapat alkali fuchsin dengan konsentrasi yang tinggi, sehingga

walau tanpa pemanasan dapat menghilangkan lapisan lilin pada dinding sel
bakteri tahan asam. Komposisi Kinyoun antara lain: alkali fuchsin, fenol,
alkohol 95%, dan aquades. Sebagai pewarna tandingan adalah Gabbet, yang
memiliki komposisi antara lain : methylene blue, asam sulfat 96%, alkohol
murni, dan aquades. Sama seperti pada metode Ziehl-Neelsen, bakteri
tahan asam akan berwarna merah, sedangkan bakteri tidak tahan asam
akan berwarna biru. Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam,
yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus
Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah
besar

zat

lipodial

(berlemak)

di

dalam

dinding

selnya

sehingga

menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zatzat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh
metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.

Adapun prosedur kerjanya yaitu:

Mula mula ambil mikroskop dilemari dengan seksama, kemudian

letakkan diatas meja dengan hati hati
a. Buka iris diafrogma, kemudian atur cahaya

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

26

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

b. Ambil objek glass dan dengan bersihkan dengan alcohol agar bebas

dari lemak
c. Beri etiket dan lingkari objek glass dengan spidol permanen kira kira 1 2cm dibelakang objek glass
d. Oles sampel sputum diatas objek glass dan keringkan pada suhu
kamar
e. Fixasi diatas api selama 3x berturut turut
f. Teteskan karbol fukhsin kuat pada sediaan sambil diuapkan selama 5
menit. Lalu bilas menggunakan aquadest
g. Kemudia tetesin Hc1 alkohol pada sediaan. Lalu tunggu selama 30
detik kemudian bilas dengan aquadest
h. Setelah itu teteskan methyien blue pada sediaan dan biarkan selama

i.

2 menit lalu bilas menggunakan auadest.

Tunggu sampai kering dan periksa dibawah mikroskop dengan
menggunakan imersi dan pembesaran 100 x.

3.

Pewarnaan Gram Negatif

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat

warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan
mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,
sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu
pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

27

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau

merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe
bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu :
1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

4.

Pewarnaan Spora
Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan

biasa, diperlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah

pewarnaan spora yang paling banyak digunakan. Endospora sulit diwarnai
dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu dilakukan
pemanasan supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam spora, seperti
halnya pada pewarnaan Basil Tahan Asam dimana cat carbol

fuschsin

harus dipanaskan untuk bisa menembus lapisan lilin asam mycolic dari
Mycobacterium .

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

28

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

Adapun prosedur kerjanya yaitu :

Mula mula ambil mikroskop dilemari dengan seksama, kemudian
letakkan diatas meja dengan hati hati
a. Buka iris diafrogma, kemudian atur cahaya
b. Ambil objek glass dan dengan bersihkan dengan alcohol agar bebas
dari lemak
c. Beri etiket dan lingkari objek glass dengan spidol permanen kira kira 1 2cm dibelakang objek glass
d. Oles sampel sputum diatas objek glass dan keringkan pada suhu
kamar
e. Fixasi diatas api selama 3x berturut turut
f. Teteskan karbol fukhsin kuat pada sediaan sambil diuapkan selama 5
menit. Lalu bilas menggunakan aquadest
g. Kemudia tetesin Hc1 alkohol pada sediaan. Lalu tunggu selama 30
detik kemudian bilas dengan aquadest
h. Setelah itu teteskan methyien blue pada sediaan dan biarkan selama

i.

2 menit lalu bilas menggunakan aquadest.

Tunggu sampai kering dan periksa dibawah mikroskop dengan
menggunakan imersi dan pembesaran 100 x.

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

29

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

5.

Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat

yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan
flagel.

6.

Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan

tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada

kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

30

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

tembaga juga memberi warna pada latar belakang yang berwana biru gelap
atau kehitaman sedang bakterinya sendiri akan berwarna merah.

E. Perbedaan Bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada
komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding
sel

dan

membran

sitoplasma

organisme

gram

positif,

sedangkan

penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan
pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif
memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (2550nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3
nm).
Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting
untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat
yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif
yaitu:
a) Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

31

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau

multilayer.
2. Dinding selnya

mengandung

lemak

lebih

banyak

(11-22%),

peptidoglikan terdapat didalam.

3. Lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat
kering, tidak mengandung asam tekoat.
4. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
5. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar
misalnya kristal violet.
6. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
7. Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
8. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
9. Peka terhadap streptomisin
b) Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal
atau monolayer.
2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%),
peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama
merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat
3. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
4. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti

5.
6.
7.
8.
9.

ungu kristal.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut.
idak peka terhadap streptomisin.
Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

32

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

10.
KELEBIHAN

DAN

KEKURANGAN

PENGECATAN

GRAM

1. Kelebihan :
Pengecatan Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan
terapi antibiotik, sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab
infeksi (kultur dan tes kepekaan bakteri terhadap antibiotik). Hal ini
karena bakteri Gram positif dan negatif mempunyai kepekaan yang
berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika. Kadang-kadang morfologi
bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna diagnostik. Misalnya pada
pemeriksaan Gram ditemukan Gram negatif diplococci intraseluler dari
spesimen pus (nana) uretral, maka memberikan presumptive diagnosis
untuk penyakit infeksi gonore.
2. Kekurangan :
Pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak
yakni lebih dari 104 per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil
mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal, memerlukan prosedur
sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut.
Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk
diperiksa secara mikroskopis.

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

BAB IV

33

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

PENUTUP
A. KESIMPULAN
Kesimpulan yang dapat diambil dari makalah ini ialah sebagai berikut :
1. Metode pengecatan atau pewarnaan adalah salah satu cara untuk
mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi.
2. Tujuan pengecatan terhadap bakteri ialah untuk mempermudah melihat
bentuk jasad bakteri, memperjelas ukuran dan bentuk jasad dari
bakteri, melihat struktur luar dan jika memungkinkan struktur dalam
jasad, dan dapat melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan
sehingga sifat-sifat fisik dan kimia dapat diketahui.
3. Pengecatan/pewarnaan bakteri terdiri dari pewarnaan sederhana,
pewarnaan diferensial, pewarnaan khusus, dan pewarnaan negatif.
4. Perbedaan dasar antara bakteri Gram positif dan negatif adalah pada
struktur

dan

mengandung

komponen

lipid,

lemak

dinding

selnya.

Bakteri

atau

substansi

seperti

Gram
lemak

positif
dalam

presentase yang lebih rendah daripada yang dikandung bakteri Gram

negatif. Dinding sel bakteri Gram positif juga lebih tebal daripada
dinding sel bakteri Gram negatif.
5. Cara pengecatan bakteri khususnya pewarnaan Gram adalah sebagai
berikut. Disiapkan bakteri untuk di amati, dibersikan objek gelas/kaca
objek dengan kapas/tissue. Kemudian diberi label nama bakteri pada

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

34

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

kaca objek inokulasi atau ulasan pada kaca objek. Dipindahkan bakteri
dengan menggunakan jarum inokulum satu ulasan pada kaca objek,
selanjutnya difiksasi kaca objek dengan api bunsen hingga kering dan
merata. Di tetesi dengan pewarna kristal violet sebagai pewarna
utama. Ditunggu 1 menit supaya penerapan warnanya maksimal,
kemudian dicuci dengan aquades dan diteteskan larutan lugol di tunggu
selama satu menit. Dicuci dengan aquades dan diberi larutan etanol
setetes demi setetes hingga etanol jatuh jernih. Kemudian kembali
dicuci dengan aquades dan ditetesi dengan safranin ditunggu 45
menit. Selanjutnya kembali dicuci dengan aquades dan diamati dengan
mikroskop
bentuk / morfologi bakteri.
B. Saran
Saran yang dapat penulis berikan adalah sebaiknya dalam melakukan
pengecatan bakteri, lebih diperhatikan cara kerja dengan teknik
aseptis agar bakteri yang diuji cobakan tidak terkontaminasi oleh
praktikan.

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

35

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

DAFTAR PUSTAKA

Delfahedah, Yuldnia, Surmayati Syukur, dan Jamsari. 2013. Isolasi,

Karakterisasi dan Identifikasi DNA Bakteri Asam Laktat yang
Berpotensi sebagai Antimikroba dari Fermentasi Kakao Varietas
Hibrid. Jurnal Kimia Unand. Volume 2, Nomor 2.
Dewi, Amalia Krishna. 2013. Isolasi, Identifikasi dan Uji Sensitivitas

Staphylococcus aureus terhadap Amoxillin dari Sampel Susu

Kambing Peranakan Ettawa (PE) Penderita Mastitis di Wilayah
Girimulyo,

Kulonprogo,

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034

Yogyakarta.

Jurnal

Sain

Veteriner.

36

PEWARNAAN GRAM BAKTERI

Volume 2, Nomor 31.

Fitrah, Ilham Deskarifal, Darmawi, dan Rasmaidar. 2013. Isolasi

Pasteurella multicoda pada Kuda dan Sensitivitasnya terhadap

Antibiotik. Jurnal Medika Veterinaria. Volume 7, Nomor 2.
Litaay, Magdalena, Risco B. Global, Asadi Abdullah, Karunia Alis, dan
Serli Lejab 2007. Kualitas Media Pemeliharaan Larva Lola Merah
dan Kima Sisik Hasil Filtrasi Bertingkat di Hatchery. Jurnal Ilmu

Kelautan. Volume 12, Nomor 1.

Meisji, Liana Sari, Arfan Abrar, dan Merin. 2013. Isolasi dan
Karakterisasi Bakteri Asam Laktat pada Usus Ayam Broiler.

Jurnal Agripet.Volume 13, Nomor 1.

Pastra, Defin Ari, Melki, dan Heron Surbakti. 2012. Penapisan Bakteri
yang Bersimbiosis dengan Spons Jenis Aplysina sp sebagai
Penghasil Antibakteridari Perairan Pulau Tegal Lampung. Maspari
Journal. Volume 4, Nomor 1.
Purwani, Eni, Estu Retnaningtyas, dan Dyah Widowati. 2013.
Pengembangan Model Pengawet Alami dari Ekstrak Lengkuas,
Kunyit, dan Jahe sebagai Pengganti Formalin pada Daging Besar.
Seminar Nasional IX Pendidikan Biologi FKIP UNS.
Puspitasari, Dyah Ayu, Artini Pangastuti, dan Kusumo Winarno. 2005.
Isolasi Bakteri Pendegradasi Limbah Industri Karet dan Uji
Kemampuannya dalam Perbaikan Kualitas Limbah Industri Karet.

Jurnal Bioteknologi. Volume 2 Nomor 2.

NURLELA SUNDARI Z
O1A1 14 034