Anda di halaman 1dari 9

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA

PRACTICAS DE LABORATORIO
COCOS GRAM POSITIVOS
Maye Bernal Rivera

Introduccin
Los cocos gram positivos excluyendo las enterobacterias, son los microorganismos
ms frecuentemente aislados de muestras de pacientes y se han involucrado como
agentes importantes en procesos de enfermedades infecciosas desde el ao 1836.
Se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y forman parte de la flora
microbiana normal de la piel y las mucosas del hombre y de animales.
Las
infecciones en el hombre se producen por contacto directo con individuos infectados o
portadores sanos, o por penetracin a travs de piel y mucosas mediante objetos
corto punzantes por heridas, trauma o procedimientos quirrgicos o por la accin de
toxinas producidas por cepas de algunas especies.
Staphylococcus
Los estafilococos son clulas esfricas gram positivas dispuestas en grupos
semejantes a racimos de uvas en medios slidos o en pares, cadenas o ttradas, en
medios lquidos. Crecen bien en medios simples y de acuerdo a la especie producen
diferentes pigmentos: blanco, amarillo y dorado y algunas de ellas producen beta
hemlisis. Son catalasa positiva, inmviles, no esporulados, con raras excepciones,
no encapsulados y son aerobios o anaerobios facultativos.
Streptococcus
Los estreptococos son clulas esfricas u ovaladas gram positivas dispuestas en
pares o cadenas cortas o largas. Son ms exigentes que los estafilococos, no crecen
en medios simples, por el contrario requieren de factores de crecimiento como la
sangre y sus derivados. Producen diferentes tipos de hemlisis, caracterstica que
permite clasificarlos en beta hemolticos, alfa hemolticos o no hemolticos. No forman
pigmentos, son catalasa negativa, inmviles, no esporulados, con formacin de
cpsula variable. Son aerobios y anaerobios facultativos.
Enterococcus
Los enterococos clasificados anteriormente como una especie de estreptococos, son
clulas esfricas gram positivas dispuestas en pares o cadenas cortas. Al igual que
los estreptococos, requieren de factores de crecimiento como la sangre y sus
derivados. Son capaces de desarrollarse en medios que contienen altas
concentraciones de NaCl (6.5%) y de bilis (40%). Pueden producir hemlisis de tipo
alfa, beta o ser no hemolticos. No forman pigmentos, son catalasa negativa,

inmviles, no esporulados, con formacin de cpsula variable. Son aerobios y


anaerobios facultativos.

PRACTICA DE LABORATORIO
Objetivo
Proporcionar al estudiante el conocimiento cientfico y las habilidades prcticas de los
mtodos y tcnicas utilizados en Microbiologa Mdica para el aislamiento e
identificacin de las principales especies de cocos gram positivos que afectan al
hombre.

PARTE I. SIEMBRA
Objetivos especficos
-

Establecer la diferencia entre gneros de cocos gram positivos


Estudiar las caractersticas macroscpicas, microscpicas y cambios producidos
en el medio de diferentes especies de cocos gram positivos
Conocer algunas de las pruebas bioqumicas de laboratorio utilizadas para la
identificacin de especies de cocos gram positivos
Identificar especies de Staphylococcus, Streptococcus y Enterococcus
Estudiar el caso clnico y aislar e identificar el agente etiolgico, a partir de la
muestra asignada de cada paciente.

Materiales
-

Asa curva
Mechero
Casos clnicos
Muestras biolgicas
Caldo BHI
Agar Sangre
Campana con vela (CO2 ) e incubadora a 37C

Procedimiento
1.
2.
3.
4.

Marcar adecuadamente cada uno de los medios.


Sembrar la muestra en caldo BHI y agar sangre (por agotamiento)
Incubar a 37C por 24 horas en aerobiosis con atmsfera de CO2
Realizar pruebas para la identificacin del agente, segn instruccin del
profesor. (Manitol, Novobiocina, DNAasa, Bacitracina, CAMP, Optoquina, KF,
Motilidad, etc)

Actividad
1. Investigue 3 caractersticas que diferencien las bacterias gram positivas de las
gram negativas

2. Escriba qu pruebas se debe realizar para diferenciar Staphylococcus de


Streptococcus
3. Cules son las especies de Staphylococcus, Streptococcus y Enterococcus
ms importantes en patologa humana?

PARTE II.
LECTURA E INTERPRETACION PARA LA DIFERENCIACION E IDENTIFICACIN
DEL AGENTE ETIOLGICO.
Sthaphylococcus. Diagnstico de Laboratorio
Las colonias de estafilococo son fciles de reconocer, relativamente son grandes
tienen de 2 a 3 mm o ms, dependiendo de la edad del cultivo. Las colonias son
circulares, convexas, de superficie lisa, bordes enteros, cremosas, blancas o
amarillas o doradas. Para iniciar la identificacin adems de las caractersticas de
crecimiento tanto en medio lquido como slido y la coloracin de Gram, se utiliza la
prueba de la catalasa que permite diferenciarlos del gnero estreptococo, el cual
carece de esta enzima. Para identificar especies se utilizan diferentes pruebas dentro
de las cuales estn las siguientes.
Pruebas Bioqumicas

CATALASA
Principio
La catalasa es una enzima que descompone el perxido de hidrgeno (H 2O2) en
agua y oxgeno segn la siguiente reaccin:
2H2O2 2H2O + O2 (burbujas de gas)
La prueba catalasa se usa con frecuencia, para diferenciar miembros de la familia
Micrococcaceae de miembros de la familia Streptococcaceae.
Materiales
- Colonia aislada (Medio de cultivo sembrado e incubado)
- Perxido de hidrgeno al 3%
Procedimiento
1. Con un palillo de madera, transferir parte del centro de una colonia a la
superficie de un portaobjetos.
2. Agregar una gota de perxido de hidrgeno al 3% y observar la formacin de
efervescencia o burbujas.
Resultados
- Positiva: Una prueba positiva esta dada por la aparicin rpida y sostenida de
burbujas o efervescencia.
- Negativa: Unas pocas burbujas pequeas despus de 20 a 30 segundos se
considera un resultado negativo.

Falsas Positivas: Los eritrocitos poseen catalasa, por lo cual debe tenerse
cuidado de no tomar eritrocitos del agar sangre junto con el material de la
colonia.

COAGULASA
Principio
La coagulasa es una protena de composicin qumica desconocida, que tiene
actividad similar a la protombina, capaz de convertir el fibringeno en fibrina, lo que
da como resultado la formacin de un cogulo visible en los sistemas apropiados. Se
utiliza para identificar Staphylococcus aureus de otras especies. La coagulasa se
presenta en dos formas, ligada y libre y para determinarlas se utiliza dos
procedimientos: en lmina y en tubo; si la prueba en lmina da positiva, no hay
necesidad de hacer la prueba en tubo.
Prueba en lmina (Coagulasa ligada)
Materiales
- Cepa en estudio
- Lmina
- Plasma de conejo
Procedimiento
- Colocar 1 gota de plasma sobre la lmina
- Agregar la colonia en estudio
- Mezclar
Resultados
- Positivo: La presencia de aglutinacin o formacin de grumos
- Negativo: No se observa aglutinacin, permanece emulsionada la colonia
Prueba en tubo (Coagulasa libre)
Materiales
- Cepa en estudio
- Tubo de ensayo con 0.5 ml de plasma de conejo
Procedimiento
- Agregar la colonia en estudio al tubo de ensayo
- Incubar a 35C por 4 horas; si no se ha formado el cogulo, reincubar por 24
horas a temperatura ambiente
Resultados
- Positivo: La formacin de un cogulo
- Negativo: No se observa formacin de coagulo, permanece lquido el plasma

MANITOL

Principio
Al utilizar el microorganismo al manitol como sustrato e incorporarlo al sistema
Embden-Meyerhoff-Parnas, que tiene como productos finales cidos que provocan la
disminucin del pH en el medio de cultivo, que se detecta mediante el viraje del
indicador rojo de fenol a amarillo.
Materiales
- Cepa en estudio
- Caldo de Manitol
Procedimiento
- Sembrar la colonia en el caldo
- Incubar a 35C por 24 horas
Resultados
- Positivo: cuando el indicador del medio vira a amarillo
- Negativo: cuando conserva su color rojo
DNAsa
Principio
Se basa en la presencia de la enzima termoestable DNAsa que es capaz de clivar los
enlaces fosfodiester internos de la molcula de DNA. Para evidenciar la presencia de
la enzima, se inunda el medio con cido clorhdrico normal, el cual precipita la
molcula del cido pero no sus polmeros.
Materiales
- Cepa en estudio
- Agar DNA
- Acido clorhdrico 1 Normal
Procedimiento
- Sembrar por estra gruesa la colonia en estudio, en el agar DNA
- Incubar a 35C por 24 horas
-

A las 24 horas: Inundar la superficie del medio con HCL 1N, esperar 2 minutos

Resultados
- Positivo: La formacin de un halo transparente alrededor de la siembra indica
presencia de DNAsa.
- Negativo: La formacin de un precipitado alrededor de la siembra indica
ausencia de la enzima

NOVOBIOCINA
Principio

Los estafilococos coagulasa negativos pueden dividirse en especies sensibles y


resistentes a la novobiocina. Staphylococcus saprophyticus es de las especies
resistentes, la ms frecuente en humanos, causante de infecciones de el tracto
urinario. Por lo tanto esta prueba proporciona una identificacin presuntiva confiable
de esta especie.
Materiales
- Cepa en estudio
- Disco de novobiocina de 5ug
- Agar sangre de carnero
Procedimiento
- Preparar una suspensin (equivalente al estndar 0.5 de McFarland) del
microorganismo en agua destilada.
- Sembrar con escobilln en forma masiva sobre la placa de Mueller Hinton
- Colocar con la pinza un disco de novobiocina en el centro
- Incubar a 35C durante por 24 horas
Resultados
- Sensible: Halo de inhibicin mayor a 16 mm
- Resistente: Halo de inhibicin menor a los 12 mm

Tabla de identificacin gnero Staphylococcus


S. aureus

S. epidermidis

S. saprophyticus

Coagulasa

DNAsa

Manitol

Prueba

Novobiocina

Streptococcus y Enterococcus. Diagnstico de Laboratorio


Las colonias de estreptococos y enterococos son variables, dependiendo de la
especie; Para iniciar la identificacin adems de las caractersticas de crecimiento
tanto en medio lquido como slido y la coloracin de Gram, se utiliza la prueba de la
catalasa que permite diferenciarlos del gnero estafilococo, el cual produce esta
enzima. Para identificar especies se utilizan diferentes pruebas dentro de las cuales
estn las siguientes.
Pruebas Bioqumicas
BACITRACINA
Principio

Streptococcus pyogenes es sensible a bajas concentraciones (0.04U) de


Bacitracina.
Materiales
- Cepa en estudio
- Agar sangre
- Discos de Bacitracina
Procedimiento:
- Sembrar la colonia masivamente en cuadrcula sobre una placa de agar sangre
- Colocar un disco de Bacitracina y presionar suavemente
- Incubar a 35C por 24 horas
Resultados
- Sensible: La aparicin de cualquier halo de inhibicin alrededor del disco
- Resistente: Crecimiento alrededor del disco
CAMP
Principio
Se basa en que Streptococcus agalactiae produce un factor llamado CAMP (factor
de monofosfato de adenina cclica) que aumenta la zona de hemlisis producida por
algunas cepas de Staphylococcus aureus productoras de lisina.
Materiales
- Cepa en estudio
- Agar sangre
- Cepa de Staphylococcus aureus lisina positivo
Procedimiento:
- Sembrar sobre la palca de agar una estra de estafilococo lisina positivo
- Perpendicular al estafilococo, hacer una estra con la colonia en estudio
- Incubar a 35C por 24 horas
Resultados
- Positivo: Presencia de una zona de hemlisis en forma de flecha
- Negativo: Ausencia de la hemlisis en flecha
OPTOQUINA
Principio
El clorhidrato de etildihidrocuprena (optoquina) a muy bajas concentraciones, inhibe
en forma selectiva el crecimiento de Streptococcus pneumoniae. La optoquina
puede inhibir a otros estreptococos del grupo viridans, pero solo a concentraciones
ms altas.
Materiales
- Cepa en estudio

Agar sangre
Discos de Optoquina 5 ug.

Procedimiento:
- Sembrar la colonia masivamente en cuadrcula sobre una placa de agar sangre
- Colocar un disco de Optoquina y presionar suavemente
- Incubar a 35C por 24 horas
Resultados
- Sensible: La aparicin de un halo de inhibicin mayor a 16 mm de dimetro
- Resistente: Crecimiento alrededor del disco o halos menores a 16 mm
KF
Principio
Determinar la capacidad de un microorganismo de crecer en un medio inhibidor y
fermentar un carbohidrato produciendo un cambio de color.
Materiales
- Cepa en estudio
- Agar KF
Procedimiento:
- Sembrar por doble picadura y estra en la superficie
- Incubar a 35C por 24 horas
Resultados
- Positivo: El medio vira a amarillo
- Negativo: el medio permanece del color original

PRACTICA DE LABORATORIO
PARTE II.

LECTURA E INTERPRETACION DE LOS CULTIVOS Y


PRUEBAS DE IDENTIFICACIN

Objetivos especficos
-

Estudiar las caractersticas macroscpicas de las colonias de cocos gram


positivos
Diferenciar los tipos de hemlisis
Observar las caractersticas microscpicas de los diferentes gneros
Leer e interpretar diferentes pruebas bioqumicas utilizadas para la
identificacin de cocos gram positivos

Materiales
-

Cultivos de las muestras de los pacientes asignadas y medios de las diferentes


pruebas bioqumicas realizadas.

Lminas, asas, mecheros, marcador de vidrio, papel absorbente


Colorantes para Gram
Microscopio y aceite de inmersin.

Procedimiento
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Describir las caractersticas macroscpicas de la colonia


Clasificar el tipo de hemlisis
Observar las caractersticas microscpicas mediante la coloracin de Gram
Leer e interpretar las diferentes pruebas bioqumicas
Identificar el agente etiolgico (Gnero y especie)
Revisar los casos clnicos y hallazgos de los dem

Actividad
4. Dibuje las diferentes caractersticas microscpicas de los hallazgos.
5. Defina los diferentes tipos de hemlisis.
6. Realice un flujograma para la identificacin del agente etiolgico de la muestra
asignada,
7. Escriba 5 enfermedades infecciosas que produzca cada uno de los agentes
etiolgicos aislados en el grupo y otras especies de microorganismos Gram
positivos importantes en patologa humana.
8. Para cada una de las entidades descritas en clase, escriba el examen
microbiolgico de laboratorio, til para su diagnstico.

Anda mungkin juga menyukai