Anda di halaman 1dari 19

LAPORAN PRAKTIKUM

TEKNIK DASAR LABORATORIUM


UJI HEMAGLUTINASI , HAMBATAN HEMAGLUTINASI & ELISA

Oleh :
Novian Agni Y (1406504371)
Kelompok 1

PROGRAM MAGISTER BIOMEDIK


FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA
JAKARTA
2014
UJI HEMAGLUTINASI
A. TUJUAN
1

Mengukur titer hemagglutinin (HA) sediaan virus (dengan pengenceran tertinggi)


yang masih memberikan reaksi aglutinasi positif ujikan (virus dapat berikatan dengan sel
darah merah dari berbagai spesies), yang nantinya akan digunakan untuk uji Hambatan
Aglutinasi (HI).
B. PENDAHULUAN
Pada taksonomi makhluk hidup, virus dikelompokkan pada kingdom tersendiri karena
dapat dianggap sebagai benda mati atau benda hidup. Virus dianggap benda mati karena
dapat dikristalkan, sedangkan dianggap benda hidup karena dapat memperbanyak diri
dalam tubuh inang serta memiliki materi genetik. Virus hanya memiliki satu materi
genetik yaitu DNA atau RNA. Virus influenza termasuk dalam kategori virus RNA. Virus
influenza diklasifikasikan menjadi 3 golongan, yakni virus influenza A, B dan C (Teama,
2012). Virus H1N1 termasuk virus influenza tipe A yang dapat menginfeksi manusia
maupun hewan seperti ayam

Gambar 1. Struktur virus influenza

Virus-virus tertentu (influenza) memiliki struktur khusus berupa selubung protein


spesifik yang disebut hemagglutinin atau HA, yang dapat terikat pada reseptor sialic acid
pada permukaan sel target. Virus ini juga dapat berikatan dengan eritrosit membentuk
gambaran lattice (kisi/jeruji). Proses ini kemudian disebut hemaglutinasi, yang menjadi
dasar pada beberapa uji laboratorium. Manfaat Uji hemaglutinasi dapat digunakan untuk
membedakan subtipe HA, mengukur nilai HA sediaan virus influenza dan mengukur titer
HA yang berguna saat ; kultur virus, mengambil stok virus, melakukan uji HI dan
penentuan kadar 4HAU untuk standarisasi antigen uji HI. Uji hemaglutinasi (HA) yang
dikerjakan pada praktikum ini bertujuan untuk menentukan titer antigen virus (influenza)
yang kemudian akan digunakan untuk uji Hambatan Aglutinasi (HI) . Metode ini relatif
mudah dilakukan dan sederhana.

Gambar 2. Virus mengikat sel

C. ALAT DAN BAHAN UJI HEMAGLUTINASI


Alat :
1) Mikroplate dengan dasar berbentuk V
2) Mikropipet
Bahan :
3) Larutan PBS (Posphate Buffer Saline) : 50 l/well
4) Antigen Virus H1N1 : 100 l
5) Sel Darah Merah Ayam : 50 l/well
D. LANGKAH KERJA UJI HEMAGLUTINASI
1.
2.

3.
4.
5.

Menyediakan mikroplate dengan dasar berbentuk V


Melabeli mikroplate: well A1-12 dan well C1-12 sebagai perlakuan uji, well E1 dan E2 sebagai
kontrol
Memasukkan 50 l PBS pada well A2-12 dan C2-12
Memasukkan 100 l antigen H1N1 pada well A1 dan C1
Melakukan pengenceran menggunakan mikropipet dengan cara dilution fold: mengambil
antigen 50 l dari well A1 dimasukkan ke A2, kemudian dari A2 diambil 50 l dimasukkan
ke A3 dan seterusnya sampai A12. Demikian juga dengan kolom B, pengenceran dilakukan

6.

dengan cara dilution fold. Ulangi cara pada well C.


Memasukkan 50 l SDM pada setiap well, kemudian mencampur dengan baik secara

7.

manual dengan sedikit menggoyangkan mikroplate


Menginkubasi pada suhu ruang (22-25oC)

8.

Catat pengenceran tertinggi antigen yang masih memberikan reaksi aglutinasi sel darah
merah

E. HASIL UJI HEMAGLUTINASI

Dari hasil percobaan, diperoleh reaksi aglutinasi positif pada well A dan C, yaitu
mulai dari well A1 dan C1 (antigen yang tidak mengalami pengenceran) sampai well A4 dan
B4 (antigen dengan pengenceran 1/8). Hasil positif menunjukkan terjadinya ikatan antara
eritrosit ayam dengan antigen virus sehingga membentuk gambaran lattice yang melapisi
well, sedangkan hasil negatif ditandai dengan adanya endapan eritrosit pada dasar well. Pada
well dengan hasil positif, pengenceran 1/8 merupakan pengenceran tertinggi yang masih
dapat mengaglutinasi eritrosit. Karena volume reaksi pada percobaan ini adalah 50 l, maka
untuk menentukan unit 8 HA adalah dengan membagi 8 dengan 8 menjadi 1. Hal ini berarti 1
bagian antigen tidak lagi diencerkan dengan PBS sehingga nantinya akan diperoleh 8 unit HA
(yang digunakan untuk uji HI). Well E1 dan E2 sebagai kontrol negatif menunjukkan hasil
yang negative dimana tidak terjadi aglitunasi.

UJI HAMBATAN AGLUTINASI


A. TUJUAN
Mengukur titer

antibodi

spesifik

(dengan pengenceran

tertinggi)

terhadap

hemagglutinin (HA) sediaan virus yang masih dapat menginhibisi terjadinya aglutinasi sel
darah merah.
B. PENDAHULUAN
Secara bahasa haemagglutination inhibition dapat diartikan sebagai hambatan
haemaglutinasi. Sedangkan haemaglutinasi merupakan penggumpalan dari sel darah
merah. Kemampuan mengaglutinasi tidak dimiliki oleh semua virus atau bakteri yang
menyerang ayam tetapi hanya beberapa virus dan bakteri yang memiliki zat
haemaglutinin, diantaranya paramyxovirus (ND), poxvirus (Pox), adenovirus (EDS),
orthomyxovirus (AI), bakteri Mycoplasma sp., Haemophilus paragallinarum maupun
Salmonella pullorum. Zat haemaglutinin yang terdapat dalam tubuh virus atau bakteri
tersebut bersifat antigenik yang dapat merangsang terbentuknya antibodi spesifik.
Antibodi yang terbentuk tersebut memiliki kemampuan mengambat terjadinya aglutinasi
darah yang disebabkan oleh haemaglutinin dari virus atau bakteri.
HI test menggunakan reaksi hambatan haemaglutinasi tersebut untuk membantu
menentukan diagnosa penyakit secara laboratorium dan mengetahui status kekebalan
tubuh (titer antibodi). Prinsip kerja dari HI test ialah mereaksikan antigen dan serum
dengan pengenceran tertentu sehingga dapat diketahui sampai pengenceran berapa
antibodi yang terkandung dalam serum dapat menghambat terjadinya aglutinasi eritrosit.
HI test merupakan metode uji serologis yang mudah dilakukan dan hasilnya dapat
diketahui dengan cepat.

C. ALAT DAN BAHAN


Alat :
1. Microplate dengan dasar berbentuk V
2. Micropipet
Bahan :
1. 12,5 l Larutan PBS (Phosphat Buffer Saline)
2. 12,5 l Antigen virus H1N1 (4 HAU)
3. 25 l serum positif (serum darah kelinci yang sudah divaksinasi H1N1,
mengandung Ab terhadap virus H1N1)
4. 25 l serum negatif (serum darah kelinci yang belum divaksinasi H1N1, tidak
mengandung Ab terhadap virus H1N1)
5. 50 l Sel darah merah ayam segar

D. LANGKAH KERJA
1.
2.

Menyediakan mikroplate dengan dasar bentuk V


Melabeli mikroplate: well A2-12 dan B2-12 sebagai perlakuan serum positif, well D2-12 dan E212

3.

sebagai perlakuan serum kontrol. Well G1-2 sebagai kontrol PBS. Melabeli serial delusi

pada well (1-2048)


Memasukkan 25 l PBS pada well A2-12 dan B2-12 (serum positif), 25 l PBS pada well D2dan E2-12 (serum negatif) dan 25 l PBS pada well G1-2 (sebagai kontrol)
Memasukkan 25 l serum positif pada well A1,B1 dan 25 l serum negatif pada well D1,E1
Melakukan pengenceran menggunakan mikropipet dengan cara dilution fold: mengambil
12

4.
5.

serum 12,5 l dari well A1 dimasukkan ke A2, kemudian dari A2 diambil 12,5 l
9

dimasukkan ke A3 dan seterusnya sampai A12. Demikian juga dengan kolom B,D dan E

7.

pengenceran dilakukan dengan cara dilution fold.


Memasukkan 25 l virus 8 HAU ke semua well kecuali well kontrol
Mencampur secara manual dengan sedikit menggoyangkan microplate, kemudian

8.

menginkubasi selama 30 menit


Memasukkan 50 l SDM ke semua well dan menginkubasi selama 10 menit atau sampai

9.

terlihat hasilnya
Mencatat hasilnya

6.

dilution fold

1
A
B
C
D
E
F
G
H

10

11

12

Serum positif
Serum negatif
PBS
PBS (kontrol)

10

E. HASIL

11

Reaksi hambatan aglutinasi yang positif didapatkan pada well D dan E yaitu pada
well dengan pengenceran antibodi 1/128 dan 1/256, yaitu well D6 dan E7 hingga pada well
yang tidak mengalami pengenceran , well D1 dan E1. Hal ini menunjukkan bahwa titer
antibodi serum yang digunakan masih sangat tinggi, sehingga dengan pengenceran 1/256 pun
masih menunjukkan hasil yang positif. Reaksi hambatan aglutinasi yang positif ditunjukkan
dengan adanya endapan sel darah merah (ring) pada dasar well. Hal ini dimungkinkan karena
antibodi spesifik pada serum positif akan berikatan dengan antigen virus, sehingga antigen
virus tadi tidak sempat mengikat sel darah merah sehingga sel darah merah akan mengendap
pada dasar well. Reaksi hambatan aglutinasi negatif ditunjukkan pada well A1-A12 dan B1B12 serta pada well kontrol G1 dan H1. Hal ini dapat terjadi karena serum kontrol tidak
mengandung antibodi spesifik terhadap antigen virus sehingga ketika ditambahkan antigen
virus ke dalam well, maka antigen virus akan mengikat sel darah merah dan terjadi aglutinasi
sel darah merah. Percobaan ini terbalik antar well uji dan kontrol yang dikarenakan salah
komunikasi atau pelabelan.

12

13

ELISA
A. TUJUAN
Mengetahui titer antibodi spefisik (dengan pengenceran tertinggi) terhadap antigen,
yang masih memberikan perbedaan bermakna dengan kontrol, melalui pembacaan absorbansi
dengan spektrofotometer.
B. PENDAHULUAN
ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) suatu pemeriksaan untuk menganalisis
adanya interaksi antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel dengan menggunakan enzim
sebagai pelapor (reporter label). Terdapat 2 Teknik Metode ELISA, yaitu teknik kualitatif,
berdasarkan fakta bahwa tiap antibodi berikatan pada antigen yang spesifik. Teknik
kuantitatif, berdasarkan jumlah ikatan antigen-antibodi yang ditentukan dengan nilai
absorbansi. Teknik ini menggabungkan spesifitas antibody dengan kepekaan uji enzymatis
dengan spektrofotometer biasa atau antigen dilekatkan pada enzyme yang mudah ditera. Uji
ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik pengerjaan yang relatif sederhana,
ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi.
Ada beberapa type ELISA, yaitu direct ELISA, biasanya digunakan dengan kompetisi
dan Inhibisi ELISA, digunakan untuk deteksi antigen. Indirect ELISA, antigen terikat pada
plate, digunakan untuk deteksi antibody spesifik terhadap antigen tertentu. Sandwich ELISA,
antibodi terikat pada plate, digunakan untuk deteksi antigen. Capture ELISA, antihuman
antibodi terikat pada plate, digunakan untuk deteksi antibody.

ELISA sebagai salah satu metode uji serologis mempunyai satu kelebihan yaitu
mampu mendeteksi beberapa jenis antibodi dari 1 sampel serum (tergantung dari kit ELISA
yang digunakan). ELISA juga memiliki tingkat spesifikasi (yaitu kemampuan mendeteksi
ayam yang tidak terinfeksi atau ayam yang tidak terinfeksi dinyatakan negatif) yang tinggi.

14

C. ALAT DAN BAHAN


Alat :
1. Micropipet
2. Microplate bentuk V
3. Spektrofotometer
Bahan :
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Larutan PBS (Phospate Buffer Saline)


Antigen Virus H1N1 (protein M)
Serum kelinci yang divaksin dengan protein M
Substrat OPD
Larutan Streptavidine-HRP 1/20.000
Stop solution 2,5N H2SO4

D. LANGKAH KERJA
1. Sediakan mickroplate dengan dasar berbentuk V.
2. Pada mikroplate digunakan well A1-A3 dengan pasangan duplonya B1-B3 dan A7-A9
dengan pasangan duplonya B7-B9. Well E1-F3 dengan pasangan duplonya E1-F3 dan
E7-E9 dengan pasangan duplonya F7-F9. Melabeli well A dan B untuk konsentrasi
antigen 50 g/ml, E dan F untuk konsentrasi antigen 25 g/ml. Well A1-A3 (dan
duplonya) untuk antibodi kontrol dan A7-A9 (dan duplonya) untuk antibodi pasca
vaksinasi.
3. Teteskan antigen dengan konsentrasi 50 g/ml pada well A1-A3 dengan pasangan
duplonya B1-B3 dan A7-A9 dengan pasangan duplonya B7-B9.
4. Teteskan antigen dengan konsentrasi 25 g/ml pada well E1-E3 dengan pasangan
duplonya F1-F3 dan E7-E9 dengan pasangan duplonya F7-F9.
5. Lakukan inkubasi pada suhu 4oC selama 1 malam.
6. Lakukan pencucian dengan menggunakan 80 l washing buffer (PBS 0.05% Tween),
buang dan ketuk-ketukkan pada kertas tissue. Pencucian dilakukan sebanyak 3x.
7. Masukkan blocking solution 5% skim milk pada setiap well, inkubasi pada suhu 37 oC
selama 1 jam.
8. Lakukan pencucian dengan menggunakan 80 l washing buffer (PBS 0.05% Tween),
buang dan ketuk-ketukkan pada kertas tissue. Pencucian dilakukan sebanyak 3x.
9. Tambahkan 50 l antibodi kontrol pada well A1 B1 E1 F1. Lakukan pengenceran secara
delution fold pada well 2 dan 3.
10. Tambahkan 50 l antibodi pasca vaksinasi pada well A7 B7 E7 F7. Lakukan
pengenceran secara delution fold pada well 2 dan 3.
11. Lakukan inkubasi pada suhu 4oC selama 1 malam.
12. Lakukan pencucian dengan menggunakan 80 l washing buffer (PBS 0.05% Tween),
buang dan ketuk-ketukkan pada kertas tissue. Pencucian dilakukan sebanyak 3x.
15

13. Tambahkan 50 l antibodi kedua (antibodi anti rabbit berlabel biotin 1/1000) pada setiap
well.
14. Lakukan inkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam.
15. Lakukan pencucian dengan menggunakan 80 l washing buffer (PBS 0.05% Tween),
buang dan ketuk-ketukkan pada kertas tissue. Pencucian dilakukan sebanyak 3x.
16. Tambahkan 50 l streptavidine-HRP 1/20.000 ke setiap well.
17. Lakukan inkubasi pada suhu 37oC selama 1 jam.
18. Lakukan pencucian dengan menggunakan 80 l washing buffer (PBS 0.05% Tween),
buang dan ketuk-ketukkan pada kertas tissue. Pencucian dilakukan sebanyak 3x.
19. Tambahkan 50 l substrat OPD
20. Lakukan inkubasi pada suhu ruangan selama 10-15 menit.
21. Tambahkan stop solution 25 l 2,5N H2SO4. Amati perubahan warna yang terjadi.
22. Baca absorbansi larutan dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang 490 nm.
23. Buat kurva persamaan garis linier, sengan sumbu X titer antibodi dan Y absorbansi.
E. HASIL

Hasil absorbansi larutan uji yang mengandung kompleks antigen-antibodi dengan


menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm dapat dilihat pada tabel 1
dan 2. Rata-rata hasil absorbansi tertinggi sebesar 1.4745 ditunjukkan pada well A1 B1, yang
menggunakan serum positif dan antigen dengan konsentrasi 50 g/ml (Tabel 2). Dari grafik 1,
dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan absorbansi sebesar 0,108 (1.4745-1.366) antara
serum kontrol dan serum positif, didapatkan pada well dengan pengenceran 1/100 dengan
konsentrasi antigen 25 g/ml. Pada well dengan pengenceran 1/100 dengan konsentrasi
antigen 50 g/ml berbedaan absorbansi antara serum kontrol dan serum positif sebesar 0,204.
Jadi dapat disimpilkan semakin besar pengenceran semakin kecil nilai OD. Pada antigen yang

16

telah ditambah antibodi ternyata memiliki nilai OD yang lebih kecil baik tanpa pengenceran
maupun tanpa pengenceran hal ini dikarenakan virus tidak dapat mengikat antigen karena
sudah memiliki antibodi terhadap virus tersebut.

17

Tabel 1. Optical Density


kont1 : 25
well
50
ng/ml
well
25
ng/ml

1 : 50

1 : 100

1 : 25

1 : 50

1 : 100

A1

B1

A2

B2

A3

B3

A7

B7

A8

B8

A9

B9

1.46
9

1.48
0

1.54
9

1.42
9

1.47
8

1.32
0

1.14
1

1.15
4

1.02
2

0.97
3

0.84
0

0.77
7

E1

F1

E2

F2

E3

F3

E7

F7

E8

F8

E9

F9

1.44
2

1.31
1

1.33
3

1.24
1

1.22
7

1.16
3

0.80
4

0.75
0

0.75
9

0.63
6

0.63
1

0.53
1

Tabel 2. Optical Density rata-rata


Antigen tanpa antibodi (control)

1 : 25
1 : 50
1 : 100

Antigen 50 g/ml
1.4745
1.489
1.399

Antigen 25 g/ml
1.3665
1.287
1.195

Antibodi pasca vaksinasi


Antigen 50 g/ml
1.088
0.9975
0.8085

Antigen 25 g/ml
0.777
0.6975
0.581

Grafik1. Pengenceran Antibodi terhadap OD 490

18

19