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doi number

Quim. Nova, Vol. XY, No. 00, 1-5, 200_

Cristiane Barata-Silvaa,*, Tatyane P. dos Santosa, Adherlene V. Gouvab, Ariane L. Larentisa, Josino C. Moreiraa e Paula
N. Sarcinellia
a
Centro de Estudos da Sade do Trabalhador e Ecologia Humana, Escola Nacional de Sade Pblica, Fundao Oswaldo Cruz,
Av. Leopoldo Bulhes, 1480, 214041-210 Rio de Janeiro RJ, Brasil
b
Laboratrio de Alimentos e Contaminantes, Instituto Nacional de Controle da Qualidade em Sade, Fundao Oswaldo Cruz, Av.
Brasil, 4365, 21040-900 Rio de Janeiro RJ, Brasil

Artigo

ADAPTAO DA METODOLOGIA DE ANLISE DE METEMOGLOBINA COMO BIOMARCADOR DE EFEITO


DA EXPOSIO AO AGROTXICO DIFLUBENZURON

Recebido em 25/09/2014; aceito em 16/01/2015; publicado na web em 23/03/2015

ADAPTATION OF METHOD OF ANALYSIS OF METHEMOGLOBIN AS A BIOMARKER OF EFFECT OF EXPOSURE


TO THE PESTICIDE DIFLUBENZURON. This work aimed to adapt the analysis of methemoglobin recommended by Evelyn
Malloy (visible spectrophotometry), in order to facilitate its application in the field, or to analysis in clinical laboratory, of existing
sites of diflubenzuron application. The parameters changed included: centrifuge rotation speed; time between the collection of
biological sample and analysis, and storage temperature of the samples; and the volume of reagents. The comparison of the rotation
speed (rpm) of the reference methodology with the rpm of a clinical centrifuge did not reveal a statistically significant difference
in the levels of methemoglobin. The time between the collection of biological sample and analysis was extended for a period of
up to 48 hours for both conservation by refrigeration and ambient temperature, producing no statistically significant difference
when compared to the standard duration of 2 hours. Regarding the reagents, the reference methodology already uses the volume
necessary to ensure complete reaction, whereas a wider range from the recommended volume to a 5-fold reduction in comparison
to the reference methodology could be used. It was concluded that the proposed changes to the methodology for adapting the
analysis are applicable to studies of field / workplace exposure and ensure the reliability of results. The adapted methodology was
inter-laboratory validated and the parameters changed can be selected according to the requirements of the laboratory at which
the methemoglobin is to be measured.
Keywords: diflubenzuron; methemoglobin; UV-VIS spectrophotometry.

INTRODUO
O diflubenzuron caracterizado como um agrotxico pertencente ao grupo qumico das benzoilureias e sua nomenclatura
IUPAC N-[[(4-clorofenil)amino]carbonil]-2,6-difluorobenzamida
ou 1-(4-clorofenil)-3-(2,6-difluorobenzoil) ureia.1 A formulao
utilizada sob a forma de p na concentrao de 25% e aplicada
em containers ou pequenos recipientes residenciais que armazenam
gua. Na agricultura, a aplicao realizada sob a forma de pequenas
gotculas geradas por meio de sprays.2,3
Diflubenzuron ou Dimilin, como comercialmente conhecido,
obteve o registro em 1985 com a finalidade de agir como inseticida e
acaricida em plantaes de algodo, cogumelos, florestas e em plantas
ornamentais.4 A partir desta data, este agrotxico vem sendo utilizado
amplamente e novos estudos toxicolgicos vm sendo realizados
para definir o perigo e o risco que tal substncia pode causar para a
populao exposta.4
Atualmente, no Brasil, o diflubenzuron amplamente utilizado
em campanhas de sade pblica para o controle de vetores de doena,
principalmente do mosquito transmissor do vrus da dengue, o Aedes
aegypti. Esta substncia qumica veio a ser utilizada em substituio
do larvicida Temephos e do adulticida Cipermetrina, que possuem
uma toxicidade maior em exposies crnicas para os trabalhadores
que os manipulam quando comparado ao diflubenzuron.5
Segundo estudos, a toxicidade aguda pela via oral, drmica ou
inalatria do diflubenzuron baixa, logo, sua classificao toxicolgica classe IV, isto , substncia pouco ou muito pouco txica.3
*e-mail: cristianebarata@hotmail.com

Porm, no existe relato de classificao pela Agncia Internacional


para Pesquisa sobre Cncer (IARC). Com o atual uso intenso deste
composto, somente possvel observar os possveis efeitos carcinognicos e mutagnicos aps uma exposio ocorrida por um longo
perodo a baixas doses, denominada de exposio crnica.6
O principal efeito txico do diflubenzuron em animais de experimentao relatado na literatura a formao de sulfemoglobina e
metemoglobina, efeitos pelos quais estes metablitos so utilizados
como indicativos de alterao da homeostasia do organismo exposto.
Estudos sugerem que a formao de metemoglobina ocorre devido
presena do metablito p-cloroanilina (PCA), principalmente
quando a exposio ocorre pela via inalatria e oral.7 E, desta forma,
tal metabtito sanguneo pode ser utilizado como um biomarcador
de exposio, visto que a metemoglobina um pigmento endgeno
resultante do contato com o xenobitico.
A metemoglobina (MHb) um pigmento da hemoglobina resultante da ao de substncias que induzem oxidao de um dos
tomos de ferro que est na composio da hemoglobina, do estado
ferroso (Fe+2) para o frrico (Fe+3). Sob esta forma, o transporte gasoso
no sangue fica comprometido, pois a MHb no consegue se ligar ao
oxignio, ao gs carbnico ou ao monxido de carbono devido ao
estado de oxidao +3. Alm disso, h a formao de um subproduto, o superxido (O2.), que uma espcie reativa de oxignio, tendo
grande importncia em diversos processos fisiopatolgicos.8
A metemoglobina produzida naturalmente no organismo durante
o processo de auto-oxidao de forma lenta e consistente, presente em
quantidades iguais ou inferiores a 2% de hemoglobina total.6 Desta
forma, a Norma Regulamentadora No 7 preconiza que o percentual
de metemoglobina deve ser inferior a 2%.9 Com os nveis basais

Barata-Silva et al.

elevados, o sistema de reduo presente no organismo no capaz de


reduzir metemoglobina a hemoglobina, levando a desfechos relacionados com a porcentagem de metemoglobina formada: concentraes
de metemoglobina entre 10-20% so geralmente bem toleradas em
seres humanos, mas j ocorre colorao ciantica visvel; concentraes entre 20-25% podem causar cefalia, dispnia, fotofobia,
cansao, confuso mental, taquicardia, palpitaes e dor torcica;
valores maiores que 55% provocam deteriorao acentuada do estado
de conscincia, arritmias cardacas, acidose, isquemia neurolgica
e choque cardiognico, enquanto concentraes superiores a 70%
so geralmente fatais.10 Existem diversas substncias exgenas que
promovem o aumento da porcentagem de metemoglobina no organismo humano, como analgsicos, quimioterpicos, nitratos e nitritos,
anilinas, naftaleno, nitrobenzenos, nitroglicerinas, entre outros,11 que
devem ser considerados quando se quer utilizar a metemoglobina
como biomarcador de efeito da exposio ao diflubenzuron. Desta
forma, a anlise da metemoglobina se torna essencial para ser utilizada
como um biomarcador de efeito da exposio ao diflubenzuron. A sua
adaptao uma etapa importante na eliminao dos fatores limitantes
na implementao desta metodologia em laboratrios de referncias,
assim como sua aplicao em campo ou em laboratrio de anlises
clnicas existentes nas localidades de aplicao do diflubenzuron.
METODOLOGIA
A metodologia empregada para anlise de metemoglobina foi
descrita primeiramente por Evelyn-Malloy (1938),12 posteriormente
foi modificada por J.Meunier (1972) e atualizada por Carrazza
(1998),13 na qual a dosagem de metemoglobina no sangue venoso
realizada por meio de espectrofotmetro UV-visvel. Essa tcnica se fundamenta no princpio de que os pigmentos sanguneos
oxiemoglobina, deoxiemoglobina, metemoglobina e cianometemoglobina possuem absoro mxima em comprimentos de ondas
semelhantes, mas cada pigmento tem picos de absoro menores,
porm significativos, em diferentes comprimentos de onda, conforme representado na Figura 1.
Como mostrado na Figura 1, a metemoglobina possui uma absoro pequena, porm exclusiva, no comprimento de onda de 630 nm,
obtendo-se neste uma absorbncia proporcional concentrao de
metemoglobina na amostra.14

Quim. Nova

Na tentativa de anular a ao de outros pigmentos interferentes


presentes no sangue, como por exemplo, carboxiemoglobina e
sulfemoglobina, quatro leituras so realizadas. A primeira leitura
(A1) a ser efetuada na amostra tratada (Soluo de Triton-X 1%
v/v e Soluo de Tampo Fosfato Dibsico de Sdio 0,01 mol
L-1 pH 6,80 com posterior centrifugao) feita sem alterao da
composio dos pigmentos sanguneos presentes na amostra. A
segunda leitura (A2) realizada na amostra anteriormente descrita
com adio de cianeto de potssio, que levar a transformao da
metemoglobina em cianometemoglobina, que nesse comprimento
de onda possui uma absorbncia mnima. Desta forma, o valor
observado resultante dos pigmentos residuais da hemoglobina, e a diferena da primeira leitura com a segunda fornecer
a real proporo da concentrao de metemoglobina presente
na amostra.
A terceira leitura (A3) realizada em uma alquota da amostra
tratada com uma soluo de ferricianeto de potssio, que, ao contato
com a hemoglobina, promove a oxidao do ferro levando formao de metemoglobina, que fornecer um valor de absorbncia. A
esta amostra acrescida uma soluo de cianeto de potssio para
novamente promover a leitura residual de outros pigmentos da hemoglobina, que denominada como quarta leitura (A4). A diferena
entre a terceira e quarta leitura proporcional concentrao da
metemoglobina gerada in vitro.
Assim, com a obteno desses valores, possvel aplicar a equao abaixo para estimar o percentual de metemoglobina presente na
amostra de cada trabalhador e concluir se tais nveis esto conformes
ou no com o preconizado pela NR-07 (< 2%):9

Percentual de Metemoglobina =

A1 A 1
100
A3 A 4

Na etapa de adaptao da metodologia realizada neste trabalho,


diversas condies de armazenamento e anlise foram testadas a fim
de facilitar a execuo do processo, empregando espectrofotmetro
UV-visvel modelo UV-1601 da Schimadzu utilizando microcubeta
de vidro com 1cm de caminho tico.
As solues utilizadas nos experimentos na avaliao da metemoglobina foram preparadas a partir de reagentes fabricados pela
Sigma-Aldrich com grau de pureza superior a 90%.

Figura 1. Representao da absoro dos pigmentos sanguneos nos diferentes comprimentos de onda (adaptado da Ref. 14)

Vol. XY, No. 00

Adaptao da metodologia de anlise de metemoglobina

Adaptao da rotao, tempo e temperatura de


armazenamento das amostras
A primeira condio testada foi na etapa de hemlise dos eritrcitos e sedimentao de fragmentos que interferem na leitura, realizada
atravs da centrifugao durante o preparo da amostra. A rotao
por minuto (rpm) preconizada na metodologia12,14 de 10.000 rpm,
mas nesta etapa foi testada uma rotao de 6.000 rpm, que pode ser
atingida em uma centrfuga clnica. Foi mantido o tempo de rotao
de 15 minutos para as trs condies analisadas.
Outra condio a ser adaptada o tempo entre a coleta de sangue
e a leitura da amostra para a determinao de metemoglobina, que
segundo a metodologia utilizada como referncia12,14 no poderia
exceder 2 horas. Porm, outro estudo15 descrito na literatura possibilitou a anlise em at 24 horas aps a coleta, quando a amostra
conservada em condies especficas. Assim, alteraes nas condies
de armazenamento e no tempo entre a coleta e a anlise foram testadas
e comparadas estatisticamente com as condies da metodologia
preconizada. Foram testados armazenamentos do sangue sob forma
coletada, ou seja, com apenas heparina, e do sangue processado na
centrfuga com a soluo hemolisante (Soluo de Triton-X 1% v/v e
Soluo de Tampo Fosfato Dibsico de Sdio 0,01molL-1 pH 6,80)
em temperatura ambiente (mdia de 20 C) e sob refrigerao (mdia
de 4 C). Para as amostras descritas acima foram testados os tempos de
0, 2, 4, 6, 24, 48 horas entre a coleta e a leitura no espectrofotmetro.
Para a comparao dos resultados obtidos nos experimentos acima descritos foi utilizado ANOVA: fator nico e teste t de Student,
com nvel de significncia de 0,05 (95% de confiana). Foi tambm
avaliada a normalidade na distribuio dos resultados.
Avaliao dos volumes dos reagentes por planejamento
experimental
Para avaliar a influncia de outros parmetros sobre a aplicabilidade da metodologia, foi mantida a rotao da centrfuga a 6.000 rpm
por 15 minutos e planejada uma sequncia de experimentos alterando
duas variveis ao mesmo tempo, a partir de uma anlise multivariada
empregando uma matriz experimental do tipo DCCR (Delineamento
Composto Central Rotacional)16 em cinco nveis, sendo elas os
volumes das solues entre 5 L e o preconizado pela metodologia
oficial, 25 L, de cianeto de potssio a 5% e ferricianeto de potssio
a 5%, que so utilizadas no momento das leituras para a formao de
cianometemoglobina e 100% de metemoglobina, respectivamente.
Para a construo do plano fatorial do tipo DCCR, todas
as combinaes experimentais foram implementadas pela variao entre as condies definidas pelos valores normalizados
de cada uma das duas variveis, entre -1 e +1, que permitem
identificar efeitos lineares e interao das variveis sobre a
resposta, incluindo repeties na condio do ponto central
(0), que corresponde ao valor intermedirio entre os nveis
-1 e +1. Alm disso, foi feita a adio de condies nos pontos -1,41
e +1,41, que permitem avaliar efeitos quadrticos das variveis sobre
a resposta.16 Por meio da utilizao de variveis normalizadas, seus
efeitos podem ser comparados sem que sofram influncia da amplitude dos valores reais de cada varivel, permitindo, desta forma,
identificar aqueles com maior influncia sobre a resposta avaliada.
Os ensaios relativos condio do ponto central foram realizados de
forma a determinar o erro experimental e avaliar a linearidade dos
efeitos das variveis sobre a resposta, sendo sua triplicata utilizada
para calcular as mdias e desvio padro.
A avaliao estatstica dos resultados do planejamento foi realizada com o auxlio do programa STATISTICA 9.1 (Statsoft, USA). Os
efeitos de cada uma das variveis foram estimados a 95% de confiana

e foram considerados estatisticamente significativos aqueles com


p< 0,05.16 Para a realizao de tais experimentos foi utilizado como
material de referncia o sangue de um voluntrio, do qual a mdia
dos valores de percentual de metemoglobina j eram conhecidos
devido a uma sequncia de anlises de seu material biolgico feita
em dias variados.
Validao da metodologia adaptada: avaliao de
especificidade, seletividade e preciso
Os critrios de validao avaliados para as condies da metodologia adaptada foram a especificidade, seletividade e preciso,
sendo que esta ltima foi composta por trs nveis: repetibilidade,
preciso intermediria e reprodutibilidade. A repetibilidade ou
preciso intracorrida objetivou a observao dos resultados obtidos
em experimentos realizados em uma mesma amostra em um curto
espao de tempo (em um mesmo dia). J a preciso intermediria
ou preciso intercorrida avaliou o comportamento dos resultados
quando as anlises foram executadas em dias diferentes utilizando
a amostra colhida do mesmo voluntrio a cada dia. Para a realizao destas anlises, cada condio foi repetida 10 vezes no mesmo
dia (preciso intracorrida) ou 15 vezes ao longo dos dias (preciso
intercorrida). A existncia de outliers foi avaliada com um intervalo
de confiana de 95%, visando retirada dos resultados fora deste
parmetro, para calcular o coeficiente de variao associado ao
mtodo. Esta avaliao necessria pois a literatura preconiza que
um mtodo possui repetibilidade quando o coeficiente de variao
no ultrapassa 20%.17
A reprodutibilidade ou preciso interlaboratorial foi avaliada
com o objetivo de observar a concordncia dos resultados obtidos
nos experimentos realizados em laboratrios distintos utilizando
alquotas de uma mesma amostra. Para isso, uma amostra de sangue
foi dividida em dois frascos com volumes semelhantes e cada laboratrio preparou as solues necessrias para a execuo da anlise.
A primeira alquota denominada como A foi analisada no Setor de
Agrotxicos do Laboratrio de Toxicologia do Centro de Estudos da
Sade do Trabalhador e Ecologia Humana (CESTEH) localizada na
Fundao Oswaldo Cruz (FIOCRUZ-RJ), e a segunda alquota, B,
foi devidamente acondicionada e transportada em at duas horas para
o Laboratrio de Toxicologia da Universidade Federal Fluminense
(UFF), onde foi realizada a anlise.
RESULTADOS E DISCUSSO
O estudo de comparao entre as rotaes utilizadas no processamento da amostra foi realizado visando comparar a eficcia nesta
anlise da centrfuga clnica, de mais fcil acesso e manipulao em
diversos laboratrios de anlises clnicas, que permite obter 6.000
rotao por minuto, com a centrfuga de grande porte que possibilita alcanar uma rotao de 10.000 rpm. A proposta de mudana
na rotao se justifica pelo fato de que a probabilidade de que um
laboratrio de anlises clnicas tenha acesso a uma centrfuga com
capacidade de rotao por minuto de 10.000 rpm pequena e que
os altos custos e o tamanho ocupado por ela sejam fatores limitantes
para a sua aquisio. Assim, possibilitando a utilizao de outras
centrfugas sem comprometer o resultado, a metodologia se torna
mais facilmente aplicvel na rotina laboratorial para anlise de exposio a substncias qumicas. Normalmente a centrfuga de mais
alta rotao possui a opo de refrigerao, que neste experimento
no foi utilizada, permanecendo com o tempo de centrifugao de
15 minutos. Os resultados gerados aps a anlise dos dados permitiram a inferncia de que o percentual de metemoglobina obtida no
sofre mudana estatisticamente significativa do seu valor quando a

Barata-Silva et al.

rotao por minuto de 10.000 rpm (0,44 0,19) substituda pela de


6.000rpm (0,78 0,39), uma vez que foi encontrado um p>0,05.
Estes resultados permitem observar que a substituio por uma menor
rotao por minuto no ir comprometer a fidedignidade dos resultados gerados na anlise. Essa etapa de desenvolvimento permitiu a
alterao na metodologia para a utilizao da centrfuga com menor
capacidade rotacional.
Para avaliar o comportamento da amostra frente ao tempo entre a
coleta e a anlise e as condies de armazenamento, os outros parmetros do experimento, como o tempo de centrifugao e a rotao,
permaneceram como o preconizado na metodologia de referncia,12,14
de 15 minutos e 10.000 rpm, respectivamente. A justificativa para
alterar esse parmetro na metodologia se deve limitao operacional
com relao ao tempo, visto que entre a coleta, processamento e a
leitura da amostra, a metodologia preconizada recomenda no ultrapassar o tempo de 2 horas. Assim, para promover a avaliao de um
quantitativo elevado de amostras ou se o local de coleta de amostra
estiver a uma certa distncia do laboratrio em que a metemoglobina
ser dosada, a metodologia de referncia preconizada se torna limitada
e de difcil aplicao.
Os resultados deste conjunto de experimentos foram agrupados
em trs grandes grupos conforme o tempo de armazenamento, sendo eles de 0 a 6 horas (T1), 24 horas (T2) e 48 horas (T3), para a
realizao das anlises estatsticas. Primeiramente, os conjuntos de
dados foram avaliados quanto distribuio, que foram normais,
sendo posteriormente realizado o teste t para a comparao dos
resultados de cada conjunto. Foi observado que no havia diferena
estatisticamente significativa (p>0,05) entre as diferentes condies
de armazenamento, com ou sem refrigerao. Sendo assim, os dados
puderam ser tratados como conjuntos que teriam somente a varivel
tempo entre a coleta e anlise para ser avaliada. Para T1, T2 e T3
foram excludos os outliers e foram obtidas mdias de percentual de
metemoglobina de 0,55 0,21, 0,39 0,08, 0,41 0,14, respectivamente. Entretanto, uma limitao em algumas destas avaliaes foi
o nmero restrito de rplicas (n=3) que impossibilitou uma anlise
de outliers, obtendo-se assim desvios padro superiores a 20% em
algumas condies experimentais, o que foi contornado na validao
da metodologia empregando todas as condies adaptadas.
Os resultados gerados sugerem que a metodologia pode ser
modificada, promovendo desta forma uma adaptao, visto que o
tempo preconizado na metodologia de referncia12,14 (2 horas) limita
a logstica do processo de coleta de amostra e anlise em laboratrio.
Avaliao dos volumes dos reagentes por planejamento
experimental
Para avaliar o resultado do percentual de metemoglobina mediante
a alterao do volume dos reagentes empregados na metodologia de
anlise, um conjunto de experimentos foi realizado promovendo a
combinao de duas variveis em diferentes condies, levando a
diferentes concentraes dos reagentes, conforme o estabelecido
pelo planejamento experimental DCCR em cinco nveis e mantendo
a rotao da centrfuga em 6.000 rpm por 15 minutos. A Tabela 1
representa os volumes das solues de cianeto de potssio e ferricianeto de potssio, a normalizao das variveis e os valores de
metemoglobina obtidos nos experimentos.
Para tais resultados, a mdia obtida pelas rplicas nas condies
do ponto central foi de 0,98 com desvio padro de 0,15 em termos de
% de MHb (erro experimental de cerca de 15 %), podendo-se afirmar
que as variveis testadas no apresentam influncia sobre o percentual
de metemoglobina, pois todos os nveis testados de diferentes volumes
apresentam resultados similares considerando o erro experimental em
torno de 15% e um intervalo de confiana de 95%.

Quim. Nova

Tabela 1. Planejamento de experimentos (DCCR) de anlise do percentual de


metemoglobina variando os volumes das solues de cianeto de potssio e de
ferricianeto de potssio (usando valores reais em L e valores normalizados)
Experimento

KCN
(L)

x1

K3Fe(CN)6
(L)

x2

%MHb

-1

-1

1,27

-1

22

0,59

22

-1

0,80

22

22

0,76

15

15

0,86

15

15

1,15

15

15

0,84

15

15

1,07

-1,41

15

0,64

10

15

-1,41

0,83

11

25

1,41

15

0,97

12

15

25

1,41

0,65

Os resultados indicam que no h diferena estatisticamente significativa entre os volumes de reagentes testados, uma vez que todos os
efeitos apresentam p>0,05 (Tabela 2), ou seja, os resultados para os
volumes de KCN e de K3Fe(CN)6 variando de 5 a 25L so similares,
indicando que o percentual de metemoglobina formada similar em
toda esta faixa de reao. Assim, a anlise estatstica dos efeitos da
variao de cianeto de potssio e de ferricianeto de potssio sobre
o percentual de metemoglobina no mostrou efeito estatisticamente
significativo da variao da metemoglobina em relao aos volumes
das solues de anlise.
Tabela 2. Avaliao estatstica dos efeitos lineares e quadrticos do DCCR
variando os volumes das solues de cianeto de potssio e de ferricianeto de
potssio na formao de metemoglobina
Fator

Efeito

Erro Padro

Mdia/Interseo

0,98

0,09

0,00

x1

0,04

0,12

0,75

x12

-0,13

0,14

0,38

x2

-0,24

0,12

0,10

x22

-0,20

0,14

0,20

x1.x2

0,32

0,18

0,12

Mediante tais resultados foi possvel observar que o volume mximo a ser adicionado das respectivas solues ultrapassa o volume
necessrio para promover as reaes. O analista pode selecionar qual
volume utilizar no experimento, dentro da faixa testada de 5 a 25 L,
sem comprometer o resultado e com 100% de rendimento da reao,
evitando assim uma reao incompleta que poderia gerar um falso
resultado. Tal escolha pode ser pautada na disponibilidade de instrumentos de laboratrio para aliquotar o volume escolhido, como o uso
de pipetas com definio precisa de volume ou na economia do uso
de reagente e, consequentemente, o seu menor volume de descarte.
Esse conjunto de experimentos confirmou a robustez do mtodo
utilizado frente variao na velocidade de rotao da centrfuga,
tempo entre a coleta e anlise da amostra e a variao dos volumes
das solues de anlise, pois independente dessas alteraes, o valor
permaneceu estatisticamente similar.

Vol. XY, No. 00

Adaptao da metodologia de anlise de metemoglobina

Validao da metodologia adaptada: avaliao de


especificidade, seletividade e preciso
Para a determinao da validao na condio da metodologia
adaptada, a preciso do mtodo foi avaliada nos trs nveis: repetibilidade, preciso intermediria e reprodutibilidade.
A repetibilidade ou preciso intra-corrida teve como objetivo a
observao dos resultados obtidos em experimentos realizados em
uma mesma amostra em um curto espao de tempo (em um mesmo
dia). Aps a avaliao da ocorrncia de outliers entre as rplicas dos
experimentos, foi obtido um coeficiente de variao de 19,8%, o que
considerado aceitvel dentro dos critrios de validao adotados.17
J a preciso intermediria ou preciso intercorrida objetivou a avaliao do comportamento dos resultados quando as anlises foram
executadas em dias diferentes utilizando a amostra colhida do mesmo voluntrio a cada dia. Assim, a anlise foi realizada em 15 dias
diferentes. Aps a retirada dos resultados calculados como outliers,
a mdia obtida foi de 0,48 com desvio padro de 0,08 em percentual
de MHb e o coeficiente de variao obtido foi de 17,8%, o que
considerado aceitvel dentro dos critrios de validao adotados.17
importante ressaltar que um outlier pode ser definido como
um ponto experimental que parece no se ajustar ao mesmo padro
de distribuio de probabilidades definido pela maioria dos outros
pontos experimentais.18 Como a anlise de outliers pode ser feita
de vrias formas distintas e h discusses e controvrsias do ponto
de vista estatstico, ela deve ser feita com cuidado para no levar a
interpretaes errneas dos dados, tanto na manuteno quando na
eliminao de um determinado ponto em comparao com a tendncia
dos demais.19
O ltimo nvel avaliado foi a da reprodutibilidade ou preciso interlaboratorial, no qual a mdia dos resultados obtidos no laboratrio
A foi de 0,55% MHb e de 0,57%MHb no laboratrio B. A partir dos
resultados foi possvel observar que os valores obtidos no possuem
diferena estatisticamente significativa (p > 0,05). Desta forma, a
reprodutibilidade do mtodo foi confirmada e os resultados gerados
em diferentes laboratrios que utilizarem corretamente a metodologia proposta devem gerar resultados estatisticamente semelhantes, o
que se espera de qualquer metodologia, ou seja, a aplicabilidade em
qualquer ambiente laboratorial.
O mtodo adaptado foi empregado para a avaliao de uma
populao ocupacionalmente exposta ao diflubenzuron (guardas de
endemias), atuantes na regio metropolitana do Estado do Rio de
Janeiro no ano de 2012, permitindo avaliar os nveis de metemoglobina antes e aps a jornada de trabalho.20
CONCLUSES
Com o presente trabalho, foi possvel concluir que a proposta
de adaptao da metodologia de anlise se mostrou eficaz para a
quantificao do pigmento sanguneo denominado metemoglobina,
atravs de espectrofotmetro operando no visvel. Esta modificao
permitiu a utilizao de uma menor rotao por minuto na etapa de
centrifugao e possibilitou uma maior margem de tempo para a
realizao da anlise aps a coleta sangunea. Foi possvel concluir
que as propostas de alteraes na metodologia para emprego das
condies de rotao, tempo, temperatura e volumes dos reagentes
so aplicveis para trabalhos de avaliao da exposio em campo/
no local de trabalho e garantem a fidedignidade dos resultados
gerados.
Com as alteraes avaliadas foi possvel concluir que para a
realizao da anlise no se tem a necessidade de aquisio de

equipamentos especficos, como por exemplo, centrfugas de altas


rotaes, e nem a limitao imposta na logstica do tempo de anlise.
Logo, a adaptao realizada propicia a acessibilidade de implementao desta metodologia em um amplo espectro de laboratrios.
Apesar da adaptao da metodologia ter sido implementada de forma
exitosa, necessrio advertir que o mtodo apresenta alta variablidade, o que exige a realizao de um grande nmero de rplicas de
cada experimento.
AGRADECIMENTOS
Este trabalho contou com apoio financeiro da FAPERJ via
Auxlio Pesquisa- APQ1 (processo nmero 110.682/2013) e bolsa
FIOCRUZ para Cristiane Barata Silva.
REFERNCIAS
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