IHEM

CONICET

Mecanismos Moleculares involucrados en

la exocitosis acrosomal del
espermatozoide humano.

Doctorando: Licenciada Cecilia Ins Lopez

Director: Dr. Luis Mayorga
Co-directora: Dra. Silvia Belmonte
Lugar de trabajo: Laboratorio de Biologa
Celular y Molecular, IHEM-CONICET, Facultad
de Ciencias Mdicas, Universidad Nacional de
Cuyo

A mi familia
A todos los que de alguna manera me acompaan da a da

Agradecimientos
Por darme la oportunidad de doctorarme:
IHEM-CONICET
Universidad Nacional de Cuyo
PROBIOL
CONICET
Por dirijirme:
Luis Mayorga
Silvia Belmonte
Por formar parte de mi comit tutorial:
Alicia Penissi
Miguel Sosa
Roberto Yunes
Por su asesoramiento:
Claudia Tomes
Por su ayuda y su compaa da a da:
Natalia Zanetti
Teresita Branham
Laura Gomez

Diego Marzese
Sebastin Real
Laila Suhaiman
Leonardo Pelletn
Marcelo Roggero
Gerardo De Blas
Jimena Castillo
Oscar Bello
Marcelo Rodrguez Pea
Facundo Rodrguez
Matas Bustos
Valeria Zarelli
Virginia Gonzalez Polo
Maximiliano Gutierrez
Cristina Vazquez
Emanuel Campoy
Cecilia Lerena
Natalia Leiva
Y a todos aquellos que de alguna manera estuvieron conmigo y me apoyaron durante todo
este tiempo.

Gracias

INTRODUCCIN ............................................... 6
La fertilizacin ....................................................................................... 7
El espermatozoide ................................................................................. 9
La capacitacin .................................................................................... 15
Motilidad hiperactivada y quimiotaxis........................................................... 19
La reaccin acrosomal ......................................................................... 21
Modelo de espermatozoides permeabilizados ............................................. 27
Maquinaria proteica involucrada en la fusin de membranas durante la
exocitosis acrosomal ........................................................................................ 29

HIPTESIS Y OBJETIVOS............................... 35
Hiptesis.............................................................................................. 36
Objetivos .............................................................................................. 37
Objetivo General ............................................................................................. 37
Objetivos especficos....................................................................................... 37

MATERIALES Y MTODOS ............................ 40

RESULTADOS .................................................... 49
La salida de colesterol regula el anclaje de Rab3A a las membranas 50
Antecedentes .................................................................................................... 50
Resultados ......................................................................................................... 55
Desarrollo de tcnicas que permitan producir protenas
recombinantes permeables a membranas Estudio de la funcin de
Rab3A en espermatozoides no permeabilizados................................ 60
Rol de lpidos como segundos mensajeros en la reaccin acrosomal 76

DISCUSIN ........................................................ 94
Aporte original de la tesis .................................................................... 95
Perspectivas ........................................................................................ 102

BIBLIOGRAFA................................................ 105
APNDICE: ...................................................... 130
Abreviaturas utilizadas ....................................................................... 131

INTRODUCCIN

La fertilizacin
La fertilizacin es el proceso por el cual el espermatozoide se fusiona con el
ovocito, se combina la informacin gentica de ambas gametas y se forma un
embrin (1;2). El espermatozoide eyaculado no tiene capacidad de fertilizar y
debe sufrir un conjunto de cambios en el tracto genital femenino conocidos
como capacitacin (3). Adems de la capacitacin el espermatozoide requiere
de otras capacidades que adquiere en el tracto genital femenino para que se
concrete la fertilizacin y que describiremos brevemente a continuacin. Una
de ellas es la quimiotaxis, movimiento dirigido hacia el ovocito por medio de
sustancias qumicas (4-6). Otra propiedad necesaria para la fertilizacin es la
motilidad hiperactivada (3;7). La razn por la que se requiere es que el ovocito
se encuentra rodeado por un conjunto de clulas foliculares llamado corona
radiata y cubierto por una matriz extracelular especializada llamada zona
pellucida. El espermatozoide debe atravesar la corona radiata y la zona pellucida
para que se produzca la fertilizacin. Una vez que el espermatozoide entra en
contacto con la zona pellucida se produce la unin primaria. Se trata de una
unin no covalente entre la membrana plasmtica del espermatozoide y la zona
pellucida que mantiene al espermatozoide en contacto con el ovocito (3). La
zona pellucida dispara la reaccin acrosomal, un proceso de exocitosis por el
cual el espermatozoide libera enzimas hidrolticas y pierde la membrana
plasmtica junto con la membrana acrosomal externa (8). Despus de la
reaccin acrosomal se produce la unin secundaria, donde las interacciones no
covalentes se dan entre la zona pellucida y la membrana acrosomal interna.
Luego el espermatozoide atraviesa la zona pellucida y finalmente se fusionan
ambas gametas (3). A lo largo de esta introduccin describiremos las
caractersticas estructurales y funcionales del espermatozoide, la capacitacin y
la reaccin acrosomal. Despus se detallar el modelo de reaccin acrosomal
7

desarrollado en nuestro laboratorio. La Figura 1 resume los principales

aspectos del proceso de fertilizacin.

Figura 1 Esquema representando el

proceso de fertilizacin. 1) El
espermatozoide capacitado atraviesa
las clulas foliculares que rodean al
ovocito y se une a la zona pellucida. 2)
Se produce la reaccin acrosomal. 3)
El espermatozoide penetra la zona
pellucida. 4) La membrana plasmtica
del espermatozoide se fusiona con la
membrana plasmtica del ovocito. 5)
El ncleo del espermatozoide ingresa
al citoplasma del ovocito. Figura
tomada de Alberts et al 2002
(refenecia 2).

El espermatozoide
El espermatozoide, la gameta masculina, es una clula altamente diferenciada
cuya funcin es transportar informacin gentica. En mamferos los
espermatozoides

se

producen

travs

de

un

proceso

llamado

espermatognesis. En el testculo se encuentran clulas diploides llamadas

espermatogonias que se dividen y se diferencian en otro tipo de clulas
diploides llamadas espermatocitos primarios. El espermatocito primario forma
dos espermatocitos secundarios despus de la meiosis I. Los espermatocitos
secundarios luego de la meiosis II forman cuatro espermtides que ya son
haploides. Luego de un proceso de diferenciacin llamado espermiognesis se
producen los espermatozoides. Durante esta ltima etapa las espermtides
pierden la mayor parte del citoplasma y organelas intracelulares y adquieren las
caractersticas distintivas del espermatozoide (9-12). En la Figura 2 se
esquematizan todos los cambios asociados a la espermatognesis y
espermiognesis.
El espermatozoide est formado por una cabeza y una cola. La cabeza
tiene distinta forma de acuerdo a la especie. Los espermatozoides humanos y
de otras especies tienen una cabeza espatulada, mientras que otras especies,
como el ratn, poseen espermatozoides con cabezas faliciformes (1). El
ncleo del espermatozoide presenta un alto grado de empaquetamiento de la
cromatina por medio de

protenas llamadas protaminas (13). Este

empaquetamiento es incompatible con el proceso de transcripcin. Aunque se

ha descrito la presencia de RNA (mRNA, siRNA y miRNA) en
espermatozoides (14) no se han observado ribosomas, por lo que se asume
que no sintetiza protenas. Recientemente, un trabajo realizado con
espermatozoides humanos y bovinos propone que hay sntesis protenas en las

ESPERMATOGNESIS
ESPERMIOGNESIS
Figura 2 Esquema la espermatognesis y espermiognesis. Figura tomada de Alberts et al
2002 (referencia 2).

10

mitocondrias que son codificadas en el ncleo (15), pero todava hay mucha
controversia al respecto. No se conoce bien si el RNA del espermatozoide
tiene alguna funcin durante el desarrollo embrionario o si simplemente es un
remanente de etapas anteriores de la espermatognesis (14).
El espermatozoide presenta una vescula por encima del ncleo llamada
acrosoma. El tamao y la forma del acrosoma varan entre especies. Se forma
a partir del complejo de Golgi (9;16). Como ya lo mencionamos, cuando el
espermatozoide entra en contacto con la zona pellucida, se libera el contenido
del acrosoma por un proceso de exocitosis regulada llamado reaccin
acrosomal (8). En el interior del acrosoma se encuentran enzimas hidrolticas
(glicosidasas y proteasas) que le permitirn al espermatozoide degradar la zona
pellucida para poder atravesarla y as poder fusionarse con el ovocito. La
acrosina es la mejor caracterizada de las enzimas acrosomales. Se trata de una
proteasa similar a la tripsina que est presente solamente en espermatozoides.
La acrosina se sintetiza como proacrosina, un zimgeno que se cliva luego de
la reaccin acrosomal para formar la acrosina activa (1). Otras enzimas
tambin presentan isoformas propias del acrosoma, como hialuronidasa, galactosidasa, -N-acetilglucosaminidasa, otras proteasas similares a tripsina y
una proteasa similar a catepsina D. El acrosoma presenta tambin otras
enzimas que pueden estar presentes en otros tipos celulares, entre ellas
proteasas, esterasas, glucosaminidasa, arilsulfatasas, arilamidasas, fosfatasas
cidas, -N-acetilglucosaminidasa, fosfolipasa C (PLC) y fosfolipasa A2
(PLA2) (1). El acrosoma tambin se comporta como reservorio de Ca2+ (1720), una funcin que en otros tipos celulares la realiza el retculo
endoplsmico. Aunque el acrosoma no realiza otras funciones del retculo
endoplasmtico como la sntesis de lpidos o protenas.
La cola del espermatozoide presenta cuatro regiones: el cuello, la pieza
media, la pieza principal y la pieza terminal (1). El cuello es una regin fibrosa
que se encuentra inmediatamente posterior al ncleo y donde se localiza la

11

placa basal del axonema. El axonema est formado por microtbulos con la
disposicin caracterstica 9+2. Se extiende a lo largo de todo el flagelo (1;2) y
se encuentra rodeado por 9 fibras densas. En la pieza media un gran nmero
de mitocondrias rodea a las fibras densas; mientras que en la pieza principal
hay una vaina fibrosa, que est formada por dos columnas longitudinales
comunicadas por costillas (21;22). La funcin de las mitocondrias es la de
otorgar la energa necesaria para la motilidad del espermatozoide, mientras
que el papel de la vaina fibrosa en la motilidad no est del todo caracterizado.
Al parecer le da firmeza al flagelo y afecta la calidad de su movimiento. La
Figura 3 esquematiza la forma y las partes de un espermatozoide humano y
un corte transversal de la cola del espermatozoide.
La membrana plasmtica del espermatozoide se encuentra dividida en
dominios. Estos dominios presentan diferente composicin lipdica, poseen
distintas protenas y sus azcares de superficie no son iguales (1). La cabeza
presenta dos dominios principales: el dominio acrosomal y el dominio postA

Figura 3 A) Esquema de un espermatozoide humano.

El espermatozoide est formado por una cabeza y una
cola. En la cabeza se encuentra el ncleo y el acrosoma.
La cola est dividida en pieza media, pieza principal y
pieza terminal. En la pieza media se encuentran las
mitocondrias. Figura tomada de Alberts et al 2002
(referencia 2) y modificada. B) Corte transversal del la
cola de un espermatozoide, se pueden observar las fibras
densas y la vaina fibrosa. Figura tomada de de
Lamirande et al 2008 (referencia 75) y modificada.

12

acrosomal. A su vez la regin acrosomal puede dividirse en subdominios: un

segmento acrosomal anterior y un segmento ecuatorial. En el espermatozoide
de cobayo el segmento acrosomal anterior se subdivide en segmento marginal
y segmento principal, pero no se sabe si esto sucede tambin en otras especies.
La membrana plasmtica de la cola tambin est dividida en dominios: uno
cubre la pieza media y el otro abarca la pieza principal y la pieza terminal (1).
La Figura 4 muestra los dominios de membrana del espermatozoide. Los
dominios de membrana se pueden estudiar por tcnicas de microscopa de
fluorescencia como FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) (2325) y tcnicas de microscopa electrnica como criofractura (26-28).

Figura 4 A) Esquema de los dominios de membrana de un espermatozoide de cobayo. B)

Visualizacin de los dominios de membrana de la cabeza de un espermatozoide ovino por microscopa
de fuerza atmica. Ac indica regin acrosomal, Eq3 indica regin ecuatorial y PAc indica regin postacrosomal. Barra: 1 m. A) tomado de Alberts et al 2002 (referencia 2), B) tomado de Jones et al 2007
(referencia 29).

Recientemente se ha comenzado a emplear microscopa de fuerza

atmica en el estudio de la superficie del espermatozoide (29-31). Tambin se
han desarrollado tcnicas que permiten estudiar la difusin de molculas
individuales en los dominios de la membrana (32).

13

El espermatozoide sufre varios cambios despus de la espermiognesis

(1). En el epiddimo sufre un proceso llamado maduracin (33), durante la
eyaculacin tambin ocurren algunas modificaciones (34-36) y luego, en el
tracto genital femenino, se produce la capacitacin (29), como ya se mencion
previamente. En los tres procesos hay cambios metablicos, en los lpidos de
membrana y antgenos de superficie. A los objetivos de esta tesis no
profundizaremos acerca de todas las modificaciones que se producen durante
la maduracin y la eyaculacin. En cambio s explicaremos lo que sucede
durante la capacitacin. Si bien este trabajo se enfoca en el mecanismo
molecular de la reaccin acrosomal, una etapa posterior, la capacitacin est
ntimamente relacionada con uno de los aspectos que se tratan aqu: los
efectos de la prdida de colesterol de la membrana plasmtica sobre la
reaccin acrosomal.

14

La capacitacin
El espermatozoide eyaculado es incapaz de fertilizar a un ovocito.
Previamente tiene que sufrir una serie de cambios bioqumicos y biofsicos
conocidos como capacitacin. Los cambios ms llamativos que se producen
durante la capacitacin son: prdida de colesterol de la membrana plasmtica
(37;38), fosforilacin de protenas tanto en serina/treonina (39) como en
tirosina (40-43), aumento de la concentracin intracelular de Ca2+ y HCO3(44;45), hiperpolarizacin de la membrana plasmtica (46) y cambio en la
distribucin de antgenos (47;48). Aunque se pensaba que la capacitacin era
un proceso exclusivo de mamferos, recientemente se ha descrito que
espermatozoides de sapo sufren cambios similares, como fosforilacin de
protenas en tirosina y prdida de colesterol cuando se encuentran en las
cercanas del huevo (49;50). La Figura 6 resume el proceso de capacitacin y
su regulacin, que a continuacin se describe en detalle.
En condiciones fisiolgicas el proceso de capacitacin se produce en el
tracto genital femenino, principalmente en el oviducto. El fluido del oviducto
tiene la composicin inica adecuada donde adems hay protenas aceptoras
de colesterol, como albmina y HDL (51;52). As las clulas capacitadas y con
motilidad hiperactivada pueden nadar hasta el istmo atradas por el ovocito
(ms adelante trataremos en profundidad los conceptos de motilidad
hiperactivada y de quimiotaxis). Se puede inducir la capacitacin in vitro
utilizando un medio que contenga HCO3-, Ca2+ y albmina (53). El HCO3- y el
Ca2+ son necesarios para procesos de movilizacin de iones y transduccin de
seales. La albmina se requiere para que se produzca la salida de colesterol de
la membrana.
En los procesos de movilizacin de iones y de hiperpolarizacin hay
diversos tipos de canales implicados: canales de Ca2+ dependientes de voltaje
15

(54;55), canales de Na+ como el canal de Na+ epitelial (epithelial Na+ channel:
ENaC) (56) e intercambiador de Na+/HCO3- (44), canales de Cl- como el
regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis qustica (cystic
fibrosis transmembrane conductance regulator: CFTR) (57), y canales de K+
(46).
La movilizacin de HCO3- activa una adenilatociclasa soluble que lleva a
un aumento del cAMP intracelular (44). Este aumento promueve la
fosforilacin de protenas en serina/treonina dependiente de PKA (39;58-60)
y la fosforilacin en tirosina por un mecanismo que todava no est totalmente
identificado (40-42;61;62).
La fosforilacin de protenas no es el nico evento disparado por la
entrada de HCO3- y el aumento de cAMP. Se ha observado que la entrada de
HCO3- provoca un proceso de reorganizacin de los lpidos de la membrana,
en el cual hay movilizacin de fosfolpidos entre la hemicapa interna y externa
(63-65). Estos rearreglos en la membrana inducen una redistribucin del
colesterol hacia la parte apical de la membrana plasmtica de la cabeza del
espermatozoide. Slo despus de esta redistribucin es que se produce la
prdida de colesterol de la membrana (66). En la Figura 5 se muestran fotos
de microscopa de fluorescencia donde se observa la redistribucin y prdida
de colesterol asociadas a la capacitacin.
Durante la capacitacin hay redistribucin de antgenos. Estos antgenos
son tanto proteicos como lipdicos. Uno de los lpidos que se redistribuyen es
el seminolpido, una clase particular de glicolpido presente slo en
espermatozoides y clulas de Schwann. Durante la capacitacin pasa de
ubicarse en la parte apical de la membrana plasmtica a la regin postacrosomal (48). Estos procesos de redistribucin de antgenos, junto con los
procesos de intercambio de lpidos entre las dos hemicapas y la prdida de
colesterol, alteran la fluidez de los subdominios de la membrana plasmtica
durante la capacitacin (64).

16

Figura 5 Redristribucin de colesterol en la

membrana del espermatozoide durante la
capacitacin. A) patrn de los espermatozoides no
capacitados. B) Redistribucin de colesterol durante
la capacitacin. C) Prdida de colesterol posterior a
la redistribucin. Tincin con filipina. Figura
tomada de Flesch et al 2001(referencia 66).

En cuanto al rol de los lpidos como segundos mensajeros durante la

capacitacin, es poco lo que se ha estudiado al respecto. Hay algunas
evidencias de que fosfolipasa D (PLD), que hidroliza fosfatidilcolina (PC) para
producir cido fosfatdico (PA), activa la polimerizacin de actina durante la
capacitacin en espermatozoides bovinos por una va dependiente de protena
quinasa C (PKC) (67). Se ha descrito tambin que la activacin de
fosfatidilinositol 4-quinasa (PI4K) y de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K),
implicadas en la produccin de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2) y
fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PIP3) respectivamente, tambin activan la
polimerizacin de actina por vas independientes en espermatozoides bovinos
(68) (En la parte de Resultados, la Figura 28 muestra la regulacin de los
fosfoinodtidos). Otra va dependiente de lpidos que est implicada en la
capacitacin es la de los endocanabinoides. Se ha sugerido que podran actuar
como agentes decapacitantes (69), pero no se conoce en detalle este
mecanismo. La Figura 6 esquematiza todos los cambios asociados al proceso
de capacitacin.

17

Figura 6 Esquema representando las caractersticas principales del proceso de capacitacin. Las flechas azules representan caractersticas generales de la capacitacin. Las
flechas negras rellenas representan procesos directos, mientras que las flechas punteadas representan procesos que se activan de manera indirecta.

18

En el humano y en otros mamferos slo un bajo porcentaje del total de

los espermatozoides eyaculados sufre todos los cambios asociados a la
capacitacin. Es notable que slo en los espermatozoides capacitados se
pueda disparar la reaccin acrosomal. Aunque todava falta caracterizar este
proceso, sobre todo en cuanto a su sealizacin por lpidos, es importante
entender qu rol tienen los lpidos en la capacitacin para poder entender cul
es su funcin en la reaccin acrosomal.

Motilidad hiperactivada y quimiotaxis

Una caracterstica notable que adquiere el espermatozoide en el tracto genital
femenino es la motilidad hiperactivada. En general la motilidad se altera al
mismo tiempo que el espermatozoide se capacita, pero las vas involucradas
son distintas y se consideran procesos independientes (7). La capacitacin
hace que el espermatozoide adquiera motilidad progresiva, en lnea recta.
Cuando el espermatozoide adquiere motilidad hiperactivada el movimiento
del flagelo se vuelve ms amplio y los espermatozoides adquieren la capacidad
de cambiar de direccin en lugar de nadar en lnea recta (7;70). Algunas veces
cuando se observa espermatozoides con motilidad hiperactivada en un medio
acuoso se puede apreciar que nadan en crculo. Esto se debe a que el
portaobjetos y el cubreobjetos son barreras que no puede atravesar ni
esquivar. En cambio en el tracto genital femenino este tipo de motilidad les
permite nadar en el lquido viscoso presente en el oviducto, pasar entre las
clulas foliculares de la corona radiata y una vez que ocurre la reaccin
acrosomal atravesar la zona pellucida. La motilidad hiperactivada tambin le
permite al espermatozoide cambiar la direccin del movimiento cada vez que
sea necesario. Esto es muy til cuando se encuentra con obstculos en el
oviducto o cuando tiene que responder a estmulos quimiotcticos.

19

Se ha descrito que hay quimiotaxis en espermatozoides humanos (4) y

que depende de la capacitacin (71). Las clulas de la granulosa y el ovocito
secretan progesterona, que acta como un quimioatrayente sobre los
espermatozoides (4-6).
A continuacin se describir en detalle el mecanismo por el cual se
produce la reaccin acrosomal.

20

La reaccin acrosomal
La reaccin acrosomal es un proceso de exocitosis regulada por el cual se
libera el contenido del acrosoma. Durante la reaccin acrosomal se produce
un proceso de fusin en mltiples puntos entre la membrana plasmtica y la
membrana acrosomal externa, dando lugar a la formacin de vesculas mixtas.
Despus de la reaccin acrosomal se pierde prcticamente toda la membrana
acrosomal externa, excepto en la regin ecuatorial, por lo que queda expuesta
la membrana acrosomal interna. Por debajo de la membrana acrosomal
interna se encuentra un complejo proteico muy rgido llamado perforatium que
le da firmeza a la membrana acrosomal interna mientras el espermatozoide
atraviesa la zona pellucida (3) y se produce la fertilizacin (Figura 1).
El inductor fisiolgico de la reaccin acrosomal en mamferos es ZP3,
una de las glicoprotenas que componen la zona pellucida. En espermatozoides
humanos ZP4 tambin puede disparar la exocitosis acrosomal, aunque por vas
aparentemente diferentes (72). Progesterona tambin estimula la reaccin
acrosomal a travs de un receptor no genmico (73;74). Existen tambin
inductores no fisiolgicos que estimulan distintos componentes de las vas de
sealizacin implicadas. Entre ellos encontramos ionforos de Ca2+ como
A23187, el cido lisofosfatdico (LPA), diacilglicerol (DAG), anlogos del
cAMP, etc.
Aunque hay numerosas publicaciones que indican la activacin de
distintas vas de sealizacin durante la reaccin acrosomal, poco se sabe
acerca de cmo interactan entre s y exactamente en qu momento se
activan. A continuacin haremos una breve descripcin de lo que se conoce
sobre las vas de transduccin de seales durante la reaccin acrosomal.

21

Especies reactivas del oxgeno (Reactive Oxigen Species: ROS)

Lo que ms se conoce sobre ROS en espermatozoides es su funcin
durante la capacitacin. En este proceso estn implicadas en dos vas de
sealizacin que llevan a la fosforilacin de protenas en treonina y en tirosina.
Es muy poco lo que se sabe sobre ROS durante la reaccin acrosomal. Se ha
observado que inhibidores de la enzima superxido dismutasa, catalasa u
xido ntrico sintasa inhiben la reaccin acrosomal en espermatozoides
bovinos y humanos, mientras que el radical superxido (O2-.), H2O2 y xido
ntrico (NO.) disparan la reaccin acrosomal (75). Estos resultados indican
que tienen un papel durante la reaccin acrosomal pero no son concluyentes
en cuanto al mecanismo involucrado.
cAMP
En espermatozoides de mamfero hay una adenilato ciclasa soluble
(44;76) regulada por HCO3- y Ca2+ (77;78) que al parecer es la principal
adenilato ciclasa en espermatozoide. Sin embargo se ha descrito tambin la
presencia de adenilatociclasas de membrana (79;80). Se ha visto que el cAMP
es necesario tanto para la capacitacin como para la estimulacin de la
reaccin acrosomal en cobayo y ratn (79;81). Como ya se describi
anteriormente, durante la capacitacin se activa la adenilato ciclasa soluble de
manera dependiente de HCO3- (44;59;60). Durante la reaccin acrosomal no
est claro cul es la adenilato ciclasa que se activa. Hay trabajos que afirman
que en espermatozoides de ratn es necesario HCO3- (82), lo que apoyara la
hiptesis de que se trata de la adenilato ciclasa soluble, pero otras
publicaciones indican lo contrario (83). Como voy a explicar ms adelante
durante la estimulacin de la reaccin acrosomal se produce un ingreso
masivo de Ca2+ extracelular. Cabe esperar que este aumento de Ca2+ pueda
activar la adenilato ciclasa soluble incluso en ausencia de HCO3-.

22

Protenas G
Se han descrito protenas Gi en espermatozoide de ratn (84;85) y Gs
(86;87) en espermatozoides de ratn y humanos. Hay evidencias de que
durante la estimulacin de la reaccin acrosomal con ZP3 se activa una
protena Gi, ya que la toxina pertsica inhibe la exocitosis acrosomal tanto
en espermatozoides de ratn (84) como en espermatozoides humanos (88).
En cambio la reaccin acrosomal disparada por progesterona en
espermatozoides humanos no es sensible a toxina pertsica (89).
Ca2+
Una de las vas de transduccin de seales mejor estudiadas y
caracterizadas es la de Ca2+ (17;19;90;91). La sealizacin por Ca2+ est muy
regulada y compartimentalizada. Lidera procesos como la motilidad
hiperactivada y la reaccin acrosomal. Existe una diversidad muy grande de
canales de Ca2+ (90) presentes en la membrana plasmtica del espermatozoide
y tambin hay varios reservorios de Ca2+ en el espermatozoide: el acrosoma,
las mitocondrias y la regin posnuclear (envoltura nuclear redundante: RNE,
redundant nuclear envelope; y vesculas que contienen calreticulina: CRV,
calreticulin containig vesicles). La hiperactivacin de los espermatozoides est
asociada a oscilaciones de calcio que son independientes de IP3 y el reservorio
implicado es RNE/CRV, mientras que durante la reaccin acrosomal se
producen movilizaciones de Ca2+ dependientes de IP3 (91).
En espermatozoides humanos tanto ZP3 como progesterona producen
un pico transitorio de Ca2+ seguido por un aumento sostenido (Figura 7, (9295). Mientras que en espermatozoides de ratn ZP3 produce una respuesta
bifsica similar a la observada en espermatozoides humanos (96) progesterona
dispara otro tipo de respuesta. Se produce un aumento transitorio o un
aumento sostenido de Ca2+ intracelular, pero no una respuesta bifsica (97).
En el pico inicial de la respuesta bifsica estn implicados canales de Ca2+

23

dependientes de voltaje. Tanto en espermatozoides de ratn como en

humanos el aumento transitorio de Ca2+ disparado por ZP3 es dependiente de
canales de Ca2+ activados por bajo voltaje de tipo T (transient low voltage
activated channels), (96;98). Se ha descrito en ratn que esta entrada inicial de
Figura 7 Elevacin bifsica de Ca2+
en respuesta a progesterona. En la
parte superior se ve una secuencia de
fotos de un espermatozoide humano
marcado con el sensor de Ca2+
Calcium Green y estimulado con
progesterona. La figura se presenta en
pseudocolor y la escala se encuentra a
la derecha de la secuencia de fotos.
En la parte inferior se ve la
cuantificacin de la intensidad de la
fluorescencia de las fotos. Puede
observarse que primero hay una
elevacin transitoria de Ca2+ seguida
por un aumento progresivo. Foto
tomada de Kirkman-Brown et al 2000,
(referencia 92).

Ca2+ activa PLC4 y se produce un aumento de IP3 que provoca la salida de

Ca2+ acrosomal (99;100). Se ha detectado presencia de canales de Ca2+
dependientes de IP3 en espermatozoides de ratn (101) y humanos (102). La
prdida de Ca2+ acrosomal produce la apertura de canales de Ca2+ operados
por reservorios intracelulares (store operated Ca2+ channels: SOCCs) que
producen un ingreso masivo de Ca2+ que desencadena la reaccin acrosomal
(17;18;103). Los canales que actan como SOCCs son de la familia de los Trp
(transient receptor potencial) que se expresan tanto en espermatozoides de
ratn (18) como humanos (103). En nuestro laboratorio hemos desarrollado
un modelo de espermatozoides permeabilizados con estreptolisina O (SLO).
Con este modelo vimos que no es suficiente la apertura de los SOCCs para
desencadenar la reaccin acrosomal sino que hace falta una salida de Ca2+ del

24

acrosoma posterior a la apertura de los SOCCs para que se produzca la fusin

de las membranas (19).
Lpidos
Se han estudiado diversas vas de sealizacin por lpidos durante la
reaccin acrosomal. Si bien hay numerosas publicaciones que abordan el
estudio de los lpidos en la reaccin acrosomal, no est bien caracterizado de
qu manera ni en qu momento actan. Esto plantea la necesidad de estudiar
con mayor profundidad su papel durante la exocitosis acrosomal, para llegar a
un modelo que explique su funcin. En esta seccin trataremos de resumir lo
que se conoce hasta el momento sobre algunas vas de sealizacin por
lpidos.
Una de las vas que ms se ha estudiado es la de fosfolipasa A2 (PLA2).
Esta una enzima hidroliza la unin ester de cido araquidnico (AA) presente
en la posicin 2 de un fosfolpido o de DAG. El AA puede ser modificado
posteriormente por cicloxigenasa (COX) para producir prostaglandinas o por
lipoxigenasa (LOX) para producir leucotrienos. En la Figura 8 A se
esquematiza la va de PLA2. Hay evidencias de que PLA2 se activa durante la
reaccin acrosomal tanto cuando se estimula con ZP3 (104), progesterona o
A23187 (105). Su activacin depende de protenas G, Ca2+ (106;107) y DAG
(108). Los efectos posteriores a la produccin de AA no estn del todo
determinados. Hay publicaciones que aseguran que durante la reaccin
acrosomal se activa COX (109) mientras que otros sostienen que su actividad
slo es necesaria durante la capacitacin y que su efecto en la reaccin
acrosomal es indirecto (110).
Otra enzima modificadora de lpidos que se activa durante la reaccin
acrosomal es PLC. La hidrlisis de PIP2 debida a PLC produce un aumento de
DAG y PA (111). Si bien se ha descrito que PLC4 es requerida para disparar
la apertura de los SOCCs, no est determinado qu isoforma produce este

25

aumento de DAG y PA. Este proceso es dependiente de Ca2+ extracelular y se

produce tanto cuando se estimula con progesterona (112) como cuando se
estimula con A23187 (113). Hay evidencias de que adems de activarse una
PLC especfica para fosfoinostidos tambin se activa una PLC especfica para
PC que produce DAG y fosfocolina. Esta va en particular no parece estar
A

Figura 8. Esquema de las vas de las principales vas de sealizacin dependientes de lpidos. A) PLA2
hidroliza el cido araquidnico de la posicin 2 de fosfolpidos (PL) o de DAG. Luego puede ser
oxidado por COX para producir prostaglandinas o por LOX para producir leucotrienos. B) PLC
hidroliza PIP2 y libera DAG e IP3. Las PLC especficas para PC hidrolizan PC y liberan DAG y
fosfocolina (P-colina). C) PLD hidroliza PC y libera colina y PA. D) La enzima PI3K fosforila PIP2 en
la posicin 3 y produce PIP3. PIP3 activa la serina/treonina quinasa Akt.

26

regulada por PKC, ya que derivados de DAG que no activan PKC produjeron
el mismo efecto (114). El aumento de PA observado puede ser indirecto
debido a la activacin de PLD (115) o directo debido a la fosforilacin de
DAG. Como en esta tesis no estudiamos el rol de ninguna PLC especfica de
PC, cada vez que se mencione se tratar siempre de PLCs especficas de PIP2.
En la Figura 8 B y la Figura 8 C se esquematizan las vas de PLC y de PLD.
Tambin fosfatidilinositol-3-kinasa (PI3K) juega un papel en la reaccin
acrosomal disparada por manosa-BSA en espermatozoides humanos (116) y
por ZP3 en espermatozoides de ratn (117). En espermatozoides de ratn se
produce un aumento significativo de fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato
(PI(3,4,5)P3), pero no fosfatidilinositol 3-fosfato (PI(3)P), fosfatildilinositol 3,4bifosfato (PI(3,4)P2) o fosfatidilinositol 3,5-bifosfato (PI(3,5)P2). Su efecto
depende de protena quinasa D 1 (PKD1), protena quinasa C (PKC) y
protena quinasa B/Akt (117). En la Figura 8 D se esquematiza esta va.
Como puede esperarse, a partir de tantos datos no es simple abordar el
tema de la reaccin acrosomal con una visin integrada del proceso. A
continuacin haremos una breve descripcin de nuestro modelo de trabajo
que pretende abordar el problema de una manera que permita relacionar
varias vas.

Modelo de espermatozoides permeabilizados

Una dificultad que presenta el espermatozoide es la de ser una clula
transcripcionalmente inactiva (13) y a pesar de que se ha propuesto que
pueden llegar a sintetizarse protenas (15) la tasa de sntesis es prcticamente
nula. Estas caractersticas no permiten que se puedan usar herramientas tan
poderosas como la transfeccin o RNAi. Al utilizar agonistas o antagonistas
farmacolgicos se puede tener una idea de las vas estn implicadas. La
desventaja es que no existen tantos agonistas y antagonistas como el nmero

27

de protenas que se quisieran estudiar y no todas estas drogas son permeables

a membranas, condicin necesaria en caso de querer estudiar la funcin de
una protena intracelular.
En

nuestro

laboratorio

hemos

desarrollado

un

modelo

de

espermatozoide permeabilizado que nos permite superar al menos en parte

algunas de estas dificultades. Los espermatozoides se permeabilizan con SLO
de tal manera que se produzcan poros en la membrana plasmtica pero no en
la membrana acrosomal (118;119). Estos espermatozoides pierden los
gradientes de membrana y no responden a agonistas fisiolgicos como
progesterona, pero se puede disparar la reaccin acrosomal con Ca2+ que
ingresa libremente por los poros. La ventaja principal que tiene el modelo de
espermatozoides permeabilizados es que se pueden agregar protenas
recombinantes, anticuerpos, etc. Adems no es un requisito que los agonistas
y antagonistas sean permeables a membranas para ejercer su efecto. En estas
condiciones se puede estudiar mejor la relacin entre las vas de sealizacin y
tener un panorama ms completo del proceso. Adems nos permite estudiar el
efecto agudo del agregado de una protena, algo que no se puede estudiar en
otros tipos celulares mediante transfeccin. La desventaja principal es que no
se pueden estudiar efectos debidos a diferencias en los gradientes de
membrana.
Utilizando este modelo hemos caracterizado las vas de transduccin de
seales disparadas por Ca2+. El ingreso masivo de Ca2+ al espermatozoide
permeabilizado se asemeja a lo que ocurre en condiciones fisiolgicas con la
apertura de los canales SOCCs.
En este contexto hemos llegado a un modelo en el cual la entrada de
Ca2+ a travs de los SOCCs dispara principalmente dos vas: una que provoca
el ensamblaje de complejos proteicos necesarios para la fusin de membranas;
y otra que conduce a la salida de Ca2+ acrosomal (8). Entre las protenas
implicadas en la activacin de la maquinaria de fusin en espermatozoide se

28

encuentran Rab3A (119-121), Rim (datos no publicados de nuestro grupo de

trabajo), NSF (factor sensible a N-etilmaleimida: N-ethylmaleimide sensitive
factor), -SNAP (protena soluble de unin a NSF: soluble NSF attachment
protein) (120;122), protenas del complejos SNARE (receptor de SNAP:
SNAP receptor) y protenas que interactan con este complejo como
sinaptotagmina y complexina (123-127). La va que lleva a la salida de Ca2+
acrosomal est menos caracterizada, pero sabemos que depende de canales de
Ca2+ dependientes de IP3 presentes en el acrosoma (19). El tronco comn
para estas dos vas es el aumento de cAMP y activacin de la protena Epac
(exchange protein directly activated by cAMP), un efector de cAMP diferente
de PKA (128). Ms adelante la Figura 11 resume el modelo de reaccin
acrosomal obtenido a partir de datos de experimentos realizados en
espermatozoides permeabilizados.

Maquinaria proteica involucrada en la fusin de membranas

durante la exocitosis acrosomal

Las protenas Rab son esenciales en todos los procesos de transporte. En

cada etapa del transporte se encuentra implicada una Rab distinta. Son
pequeas GTPasas monomricas y como tales ciclan entre dos estados, uno
activo en el cual la protena est unida a GTP y uno inactivo en el cual est
unida a GDP. En su extremo C-terminal tienen dos residuos de cistena
ligados a geranil-geranilo que les permite anclarse a membranas (129). Su
funcin est regulada por varias protenas. Las protenas GEF (factor
intercambiador de nucletidos de guanina: guanine nucleotide exchange
factor) catalizan el intercambio de GDP por GTP y permiten que se activen,
mientras que las protenas GAP (protena activadora de GTPasa: GTPase
activating protein) aceleran su actividad GTPasa lo que las lleva a su estado
inactivo. La protena GDI (inhibidor de la disociacin de GDP: GDP

29

dissociation inhibitor) tiene la capacidad de unirse a las protenas Rab cuando

se encuentran unidas a GDP y es el factor que permite que cuando estn
inactivas se localicen en el citosol y evita que formen agregados debido a los

Figura 9 Ciclo de las protenas Rab. La protena Rab unida a GDP puede encontrarse anclada a membranas
o citoslica formando un complejo con la protena GDI. Cuando interacta con una protena GEF
intercambia GDP por GTP y pasa a su estado activo en el cual recluta protenas efectoras. Cuando interacta
con una protena GAP hidroliza el GTP y vuelve a su estado inactivo unida a GDP donde se reinicia el ciclo.

residuos de geranil-geranilo (130). Se ha encontrado una protena capaz de

disociar GDI de las Rabs en la va endoctica (131). La funcin de GDI es
secuestrar a Rab en su estado unido a GDP y evitar que se una a membranas,
mientras que GDF (factor de disociacin de GDI: GDI dissociation factor)
disocia el complejo Rab-GDI y permite que Rab se una a membranas y pueda
interactuar con la protena GEF. La Figura 9 esquematiza el ciclo de las
protenas Rab.
La protena Rab3A participa en procesos de exocitosis regulada en
neuronas y clulas cromafines (132;133). La sobrexpresin de Rab3A produce
inhibicin de la exocitosis en clulas neuroendcrinas (134). En nuestro
laboratorio hemos visto que Rab3A estimula la exocitosis en espermatozoides
humanos permeabilizados cuando se agrega prenilada y activada con GTP
(119;120) y que anticuerpos dirigidos contra Rab3A inhiben la reaccin
acrosomal disparada por Ca2+. Esto demuestra que Rab3A tiene un rol

30

fundamental en los procesos de exocitosis regulada. El efecto inhibitorio en

clulas neuroendcrinas podra deberse a que Rab3A acta como un regulador
de la exocitosis disparada por Ca2+ en este sistema. En ausencia de Rab3A se
pierde la regulacin y la exocitosis aumenta (132;133) mientras que la
sobrexpresin de Rab3A lleva a que esa regulacin sea mayor (134).
Las funciones de las protenas Rab son diversas. Una de ellas es reclutar
protenas efectoras que pueden cumplir con muchas funciones como
transduccin de seales, interacciones con el citoesqueleto y formacin de un
complejo proteico que acerca las membranas que van a fusionarse para que
finalmente se produzca el ensamblaje de los complejos SNARE (135). No est
claro cules son las protenas efectoras de Rab3A ms directas que participan
en la reaccin acrosomal, aunque se sabe que Rab3A puede interactuar con
Rim y con Rabfilina en otros sistemas celulares (136). Tenemos evidencias de
que -SNAP y NSF son necesarias para que se produzca la reaccin
acrosomal y actan despus de la activacin de Rab3A (120;122).
El complejo SNARE est formado por tres protenas: VAMP (protena
de membrana asociada a vesculas: vesicle-associated membrane protein)
tambin conocida como sinaptobrevina, SNAP-25 (protena asociada a
sinaptosomas de 25 kDa: synaptosome-associated protein of 25kDa) o alguna
protena homloga y sintaxina. Las SNAREs asociadas a neuronas son
VAMP-2, SNAP-25 y sintaxina-1A (137). En espermatozoide hemos
detectado la presencia de SNAP-25, SNAP-23, sintaxina 1A, 1B, 4 y 6 y
VAMP-2

(127).

Las

protenas

VAMP

sintaxina

son

protenas

transmembrana mientras que SNAP-25 se encuentra anclada a membranas a

travs de residuos palmitoilo unidos a cistenas. Estas protenas forman un
complejo de cuatro hlices alfa paralelas de las cuales dos son de SNAP-25
mientras que sintaxina y VAMP contribuyen con una hlice alfa cada una
(138;139). Cuando todas estas protenas se encuentran en la misma membrana
se dice que estn en cis, en cambio cuando VAMP se encuentra en una

31

membrana mientras que sintaxina y SNAP-25 se encuentran en la otra se dice

que estn en trans. Para que se fusionen dos membranas es necesario que las
protenas se encuentren en trans, porque slo as se podr traccionar las dos
membranas como para que se produzca la fusin (137). En la Figura 10 se
esquematiza un complejo SNARE en trans.

Figura 10 Vescula sinptica unida a la membrana plasmtica por medio del complejo SNARE. En rojo
se muestra VAMP, en verde SNAP-25 y en azul sintaxina. Figura tomada de (139) y modificada.

En nuestro modelo postulamos que en el espermatozoide en reposo las

protenas SNAREs se encuentran formando complejos cis (122). Despus de
la activacin de Rab3A, las protenas NSF y -SNAP desensamblan los
complejos cis permitiendo que se formen los complejos trans. Los complejos
trans comienzan a formarse, pero quedan estabilizados por complexina en una
estructura intermedia llamada trans flojo (loose trans). Slo despus de la salida de
Ca2+ del acrosoma termina de ensamblarse el complejo y se fusionan las
membranas. En este proceso sinaptotagmina VI, una protena que acta como
sensor de Ca2+, tiene un rol fundamental, ya que desplaza a complexina y se
elimina el bloqueo de la fusin (123;126). La Figura 11 resume el modelo de
reaccin acrosomal obtenido a partir de resultados de experimentos en
espermatozoides permeabilizados.

32

Figura 11 Representacin grfica de nuestro modelo de trabajo. Despus de la entrada de Ca2+ a travs de los
SOCCs se activan dos vas de sealizacin, una que lleva al ensamblaje del complejo SNARE y otra que lleva a la
salida de Ca2+ acrosomal. Las lneas de puntos representan vas que no estn del todo caracterizadas, mientras que
las lneas completas representan efectos directos.

El modelo de espermatozoides permeabilizados nos ha permitido

avanzar mucho en el entendimiento de los mecanismos implicados en la
exocitosis acrosomal. Aunque carece de datos con respecto a la funcin de
lpidos en la exocitosis acrosomal. En esta tesis, por primera vez en nuestro
grupo de trabajo, estudiaremos de qu manera participan los lpidos en la
cascada de sealizacin que desencadena la exocitosis acrosomal.
Los lpidos tienen una funcin estructural importante, determinan
caractersticas propias de cada membrana como su fluidez, su forma e incluso
la capacidad de fusionarse (140). Las membranas biolgicas son complejas y
estn formadas por una diversidad muy grande de lpidos. Esta diversidad
determina que se formen dominios en la membrana donde los lpidos
presentan distintas fases (141;142). De gran importancia son los
microdominios ricos en colesterol, cidos grasos saturados y esfingolpidos.
Estos microdominios al formar una estructura lquida ordenada tienen
afinidad por lpidos saturados (142) y algunas protenas como caveolina y
flotilina (143;144), mientras que los lpidos insaturados y otras protenas como
el receptor de transferrina quedan excluidos (144).

33

Otra funcin de los lpidos es actuar como segundos mensajeros. Se

producen generalmente por medio de enzimas modificadoras de lpidos y su
existencia es transitoria. Hay mltiples protenas que contienen dominios de
unin a estos segundos mensajeros que al ser reclutadas a la membrana
desencadenan una serie de respuestas que conllevan a un efecto biolgico
determinado (145).
En esta tesis nos proponemos buscar un modelo integrado sobre el
mecanismo de reaccin acrosomal en el cual se tengan en cuenta las funciones
estructurales de los lpidos y su rol en la sealizacin intracelular. Para tal fin
utilizaremos espermatozoides permeabilizados y tambin desarrollaremos una
tcnica que nos permita introducir protenas en espermatozoides no
permeabilizados. Juntas estas dos metodologas nos permitirn obtener datos
complementarios.

34

HIPTESIS Y
OBJETIVOS

35

Hiptesis
Los lpidos participan activamente del proceso de fusin de
membranas que ocurre durante la exocitosis acrosomal.

La exocitosis acrosomal es un proceso complejo y finamente regulado en el

cual intervienen varias vas de sealizacin. En este proceso estn
involucrados segundos mensajeros y protenas, que finalmente llevan a la
fusin de la membrana plasmtica con la membrana acrosomal externa (8).
Los lpidos no slo proveen caractersticas estructurales a las membranas.
La composicin lipdica de una membrana tambin determina caractersticas
como la fluidez, que a su vez puede afectar el funcionamiento de protenas de
membrana (141). Adems existen numerosas protenas con dominios de
unin a lpidos. Estos dominios permiten que esa protena se asocie a
membranas slo cuando estn presentes los lpidos por los cuales tiene
afinidad (145). De esta manera los lpidos constituyen un sitio donde se
agrupan protenas que actan como segundos mensajeros.
En este trabajo proponemos que los lpidos cumplen con una funcin
importante en la regulacin la reaccin acrosomal. Especialmente
pretendemos determinar qu relacin existe entre los lpidos y la maquinaria
de fusin que se activa durante el proceso de exocitosis acrosomal.

36

Objetivos
Objetivo General

Estudiar el rol de los lpidos durante la exocitosis acrosomal y

su relacin con la maquinaria proteica involucrada en el
proceso de fusin de membranas.

Objetivos especficos

1- Caracterizar el papel de la concentracin de colesterol en la

fusin de membranas que ocurre durante la exocitosis
acrosomal
Durante la capacitacin, entre otros sucesos, se produce una prdida de
colesterol de la membrana plasmtica (37;146). Hay evidencias de que el
contenido de colesterol regula tambin la reaccin acrosomal (147). Nuestro
objetivo es estudiar el mecanismo molecular por el cual se produce esta
regulacin y qu relacin guarda con la maquinaria de fusin de membranas
que se activa durante la exocitosis acrosomal.
Es conocido que colesterol puede formar microdominios ricos en
esfingolpidos

fosfolpidos

con

cidos

grasos

saturados.

Estos

microdominios excluyen los fosfolpidos que contienen cidos grasos

insaturados (142) y tambin tienen la capacidad de reclutar o excluir protenas
(143;144). Es sabido que las protenas SNAREs se ubican en microdominios
37

ricos en colesterol por los residuos palmitoilo de SNAP-25 (148) y que

durante la capacitacin se redistribuyen con la prdida de colesterol (149).
Nuestra hiptesis es que colesterol podra estar controlando de alguna manera
el reclutamiento a membranas y la localizacin de protenas necesarias para la
maquinaria de fusin. Para estudiar esta posibilidad utilizaremos el modelo de
espermatozoides permeabilizados y vamos a buscar la relacin entre la
concentracin de colesterol de las membranas y la exocitosis, teniendo en
cuenta los conocimientos existentes acerca de la regulacin de la exocitosis
acrosomal.

2- Desarrollar mtodos que permitan translocar protenas que

participen en la exocitosis acrosomal al citoplasma del
espermatozoide para estudiar su efecto en clulas vivas
Ya mencionamos que el espermatozoide es una clula transcripcionalmente
inactiva (13) y si bien se ha reportado sntesis de protenas (15), es casi nula y
no est completamente caracterizada. Esto significa que no se pueden utilizar
tcnicas como transfeccin y RNAi para estudiar el rol de protenas y limita el
estudio del espermatozoide. Si bien en nuestro laboratorio hemos resuelto
parcialmente ese problema por medio de la permeabilizacin con SLO
(118;119), ese modelo tiene algunas desventajas. Uno de los principales
inconvenientes del modelo de espermatozoide permeabilizado es que se
pierden los gradientes de membrana y por lo tanto no puede estudiarse su
efecto en la reaccin acrosomal.
Existen diversos pptidos ricos en arginina que tienen la propiedad de
translocarse a travs de las membranas y tambin pueden transportar
protenas unidas covalentemente a ellos (150). Nuestro objetivo es producir
protenas recombinantes unidas a pptidos ricos en arginina para poder
translocar protenas a espermatozoides vivos y estudiar su funcin. De esta

38

manera buscamos encontrar informacin acerca de la funcin de protenas en

condiciones fisiolgicas que de otra manera no podran estudiarse. As
podemos tener un panorama ms completo acerca de los mecanismos que
llevan a la exocitosis acrosomal.

3- Caracterizar el papel de lpidos como segundos mensajeros

en la reaccin acrosomal

Los lpidos adems de su funcin estructural tambin pueden actuar como

segundos mensajeros. Existen enzimas capaces de modificar lpidos. Cuando
estas enzimas se activan producen derivados de lpidos de manera transitoria.
Muchos dominios proteicos tienen la capacidad de unirse a lpidos, como por
ejemplo el dominio C1 que tiene la capacidad de unir DAG, presente en
PKCs y munc13 entre otras protenas. Otro dominio de inters es C2 que une
fosfolpidos cidos en presencia de Ca2+ y est presente en PLCs, PKCs
dependientes de Ca2+ y sinaptotagmina entre otras. Los dominios PH
(homlogos a plekstrina: plekstrin homology) que tienen la capacidad de unir
fosfoinostidos (145). Hay distintas clases de dominios PH que tienen afinidad
por diferentes fosfoinostidos. En este trabajo utilizaremos el dominio PH de
PLC4 que tiene afinidad por PIP2. Cuando estos lpidos se producen por la
activacin de las enzimas que los sintetizan o los modifican, las protenas que
contienen estos dominios se unen a las membranas donde se encuentren estos
lpidos.
Nos interesa estudiar la cascada de sealizacin disparada por DAG. En
particular vamos a estudiar la funcin de PKC en relacin con la sealizacin
por lpidos y con la maquinaria proteica implicada en la fusin de membranas.

39

MATERIALES Y
MTODOS

40

Plsmidos

El plsmido pGEX-2T-R se obtuvo hibridando un oligonucletido (P-gat ccc

gtc gcc gtc agc gtc gca aac gcc gtc gcc agc tag ctc tag y P-aat tct aga gct agc tgg
cga cgg cgt ttg cga cgc tga cgg cga cgg) y ligndolo entre los sitio BamHI y
EcoRI de pGEX-2T. Rab3A se amplific por PCR con el primer 5 cgg tcg
aat tca tgg cct cag cca ca y el primer 3 ccc ccg aat tct cag cag gcg caa tcc tga
tg. Se lig en el sitio EcoRI de pGEX-2T-R. R-Rab3A se subclon a partir de
pGEX-2T-R en el sitio BamHI de pQE80L por PCR usando el primer 5 gtg
gtt ccg cgt gga tcc cgt y el mismo primer 3 que para Rab3A. Rab3A se
subclon a partir de pGEX-2T en el sitio BamHI de pQE80L usando el
primer 5 cca gca agt ata tag cat gg y el mismo primer 3 utilizado antes. Los
siguientes plsmidos fueron gentileza de otros cientficos: pGEX-2T-Rab3A
(Phillip Stahl), pGEX-6P3-PLC4-PH (Tamas Balla), pGEX-5X-1-PABD
(Nicolas Vitale).

Purificacin de protenas
Todos los plsmidos mencionados arriba se transformaron en las cepas BL21
o BL21(DE3)pLysS de Escherichia coli. Se cultivaron toda la noche en medio
LB con ampicilina 50g/ml en el caso de BL21, o ampicilina 50g/ml y
cloranfenicol 50g/ml en el caso de BL21(DE3)pLysS. Se expandieron en el
mismo medio hasta obtener una densidad ptica de 0,6 a 600nm. En ese
momento se indujo con IPTG (0,1-0,5 mM) toda la noche a 22C. Las
bacterias se centrifugaron y se lisaron por congelamiento y sonicacin. Las
protenas GST-R, GST-Rab3A, GST-PLC4-PH y GST-PABD se purificaron
con glutatin-sefarosa 4B (GE) en condiciones nativas en buffer Tris-HCl 50
mM, pH 8, NaCl 0,2 M y glutatin reducido 20 mM. Las protenas His6-RRab3A y His6-Rab3A se purificaron en condiciones nativas con Ni-NTAagarosa (Qiagen) en buffer NaH2PO4 50 mM, pH 8, NaCl 0,3 M e imidazol
500 mM.
41

Prenilacin de Rab3A

Las protenas GST-Rab3A, His6-Rab3A y His6-R-Rab3A fueron preniladas in

vitro, excepto cuando est especificado. Las protenas recombinantes (10 M)
se incubaron en buffer PBS con DTT 1 mM, albmina 1 mg/ml, MgCl2 3
mM, geranil-geranilo pirofosfato 80 M e inhibidores de proteasas (Sigma) y
citosol de cerebro de vaca 1 mg/ml durante 2 hs a 37C. Luego se filtraron en
columnas de Sefadex G-25 con PBS. Las protenas preniladas se cargaron con
GTPS (0,125 mM) o GDPS (0,125 mM), excepto cuando est especificado.
Se incubaron 1 h a 37C en buffer Hepes/KOH 50 mM pH 7,2, MgCl2 50
mM, Igepal 0,03%, DTT 100 mM EDTA 0,25 M. Se filtraron en columnas
de Sefadex G-25 con HB-EGTA (Hepes/KOH 20 mM, sacarosa 250 mM,
EGTA 0,5 mM) o HTF (fluido tubal humano: human tubal fluid, NaCl 5,94
g/L, KCl 0,35 g/L, MgSO4.7H2O 0,05 g/L, KH2PO4 0,05 g/L, CaCl2.2H2O
0,3 g/L, NaHCO3 2,1 g/L, d-glucosa 0,51 g/L, piruvato de sodio 0,036 g/L,
lactato de sodio 2,39 g/L, penicilina 0,06 g/L, estreptomicina 0,05 g/L, rojo
fenol 0,01 g/L) de acuerdo al medio que se use en los experimentos
posteriores.

Swim-up y capacitacin
Se utilizaron muestras de semen de donantes normosprmicos. Se separ la
fraccin de espermatozoides mtiles por swim-up con medio HTF con
albmina srica bovina (ICN, Eurolabs SA) 0,5%, excepto cuando se trabaj
en condiciones no capacitantes en las cuales no se agreg albmina al medio.
Brevemente, se agregaron 500 l de medio HTF sobre 500 l de semen.
Despus de 1 h y 30 minutos se tomaron los 300 l superiores de la fraccin
de HTF en donde se encuentran los espermatozoides mtiles que fueron
capaces de nadar hasta el medio. Se ajust la concentracin a 7 x 106 clulas
por mililitro y se capacit por 2 hs.

42

Permeabilizacin con SLO

Se tomaron espermatozoides capacitados ajustados a 7 x 106 clulas/ml. Se
lavaron los espermatozoides 2 veces con PBS fro. Se incubaron con 2,1 U/ml
de SLO (gentileza del Dr. Bhakdi) durante 15 minutos en hielo. Se lavaron
con PBS fro, se resuspendieron en HB-EGTA con DTT 2 mM y se
incubaron 15 minutos a 37C. Se control el grado de permeabilizacin (entre
60% y 80 %) utilizando eosina Y 0,08%.

Ensayos de reaccin acrosomal

Se realizaron ensayos funcionales tanto en espermatozoides permeabilizados
como no permeabilizados. En trminos generales los espermatozoides se
incubaron 15 minutos en presencia o ausencia de inhibidores y 15 minutos en
presencia o ausencia de estimuladores. Todos los resultados se expresan en
relacin a un control sin estimulantes ni inhibidores (0%) y un control
estimulado (A23187 10M o progesterona 15M en espermatozoides no
permeabilizados; Ca2+ equilibrado a 10 M con EGTA en espermatozoides
permeabilizados; 100%). De cada condicin se tom una alcuota de 10 l y se
dej secar al aire. Luego se fij y permeabiliz con metanol a -20C por un
minuto. Se ti con una lectina de Pisum sativum marcada con fluorescena 50
g/ml durante 40 minutos en cmara hmeda y se lav con agua bi-destilada
durante 30 minutos. Luego se contaron por los menos 200 clulas de cada
condicin.

Ensayos de permeabilidad de protenas

Se trat 5 x 106 espermatozoides con GST o GST-R marcadas con
tetrametilrodamina (Molecular Probes) u Oregon green 488 (Molecular
Probes). Los espermatozoides se incubaron de 1 a 3 hs con 1-4 M de las
protenas, luego se lavaron con PBS y se fijaron con paraformaldehdo al 3%.

43

En algunos ensayos los espermatozoides se observaron in vivo por microscopa

de epifluorescencia.
En otro experimento se incubaron las clulas con GST o GST-R 1 M
durante 1 h. Luego se trataron con 1 mg/ml de tripsina durante 20 minutos y
despus con 2 mg/ml de inhibidor de tripsina. Para extraer las protenas se
lav las clulas con PBS y se resuspendieron en sample buffer no reductor.
Se incubaron a 95C por 6 minutos y posteriormente en hielo 2 minutos. El
procedimiento se repiti 2 veces y luego se centrifug y se agreg mercaptoetanol al 5% al sobrenadante. Antes de extraer las protenas se tom
una alcuota de cada condicin que se fij con paraformaldehdo al 1% para
inmunofluorescencia indirecta contra GST.

Obtencin de membranas de espermatozoides

Se tomaron por lo menos 30 x 106 clulas capacitadas o no capacitadas por
cada condicin experimental. Despus de los tratamientos correspondientes se
incubaron las clulas 2 hs en buffer hiposmtico (citrato de sodio.2H2O 7,35
mg/ml, fructosa 13,5 mg/ml) a 37C y se sonicaron. Se separaron los restos
celulares centrifugando 15 minutos a 4000g y 10 minutos a 10000g. Luego se
separaron las membranas centrifugando a 100000g. Las membranas se
resuspendieron en sample buffer reductor y se utilizaron para realizar
electroforesis en gel de poliacrilamida y western blot.

Western blot
Western blot anti GST: Se bloque con PBS-Tween 0,1% leche 1%. Se utiliz
anti-GST obtenido en conejo diludo 1:1000 en PBS-Tween 0,1% leche 1%.
Se lav 5 veces con PBS-Tween 0,1%. Se incub con anti-IgG de conejoperoxidasa 0,25 g/ml (Jacksons) en PBS-Tween 0,1%. Se lav 5 veces con
PBS-Tween 0,1%.

44

Western blot anti-Rab3A: Se utilizaron espermatozoides capacitados o no

capacitados, cuando se indica se trataron con metil--ciclodextrina (1mM) y se
extrajeron las membranas. Se utiliz una alcuota de las membranas para
incubar con GST-Rab3A prenilada y cargada con GTPS. Luego se realiz
Western blot para detectar ya sea Rab3A endgena o GST-Rab3A. Se bloque
con PBS-Tween 0,1% leche 1%. Se incub con anti-Rab3A (policlonal
obtenido en conejo, Santa Cruz) 1 g/ml en PBS-Tween 0,1% leche 1%. Se
lav 5 veces con PBS-Tween 0,1. Se incub con anti-IgG de conejoperoxidasa 0,25 g/ml en PBS-Tween 0,1%. Se lav 5 veces con PBS-Tween
0,1%. Se utiliz como control de carga la tincin con rojo Ponceau o el
receptor de manosa-6-fosfato (M6PR).
Western blot anti-M6PR: Las membranas de nitrocelulosa previamente
utilizadas para detectar Rab3A, fueron tratadas con HCl 50 mM durante 30
minutos. Luego se bloque con PBS-Tween 0,05%, leche 3%. Se incub con
anti-M6PR obtenido en conejo (gentilieza del Dr. Miguel Sosa) diluido 1:500
en PBS-Tween 0,05%. Se lav 5 veces con PBS-Tween 0,05%. Se incub con
anti-IgG de conejo-biotina 0,112 g/ml en PBS-Tween 0,05%. Se lav 5
veces con PBS-Tween 0,05%. Se incub con estraptavidina-peroxidasa 0,05
g/ml PBS-Tween 0,05%. Se lav 5 veces con PBS-Tween 0,05%.
Western blot anti-PLD1: Se trataron espermatozoides con 2-APB (100 M)
durante 15 minutos a 37C para inhibir la reaccin acrosomal y luego, cuando
se indica, se estimularon con PMA (200 nM) o con A23187 10 M por 15
minutos ms. Se extrajeron las membranas y se realiz electroforesis en gel de
poliacrilamida y Western blot. Se bloque con PBS-Tween 0,1% leche al 5%.
Se incub con anti-PLD1 (policlonal obtenido en conejo, Ab-cam) 1 g/ml
en PBS-Tween 0,1% leche al 1%. Se lav 5 veces con PBS-Tween 0,1%. Se
incub con anti-IgG de conejo-peroxidasa 0,25 g/ml en PBS-Tween 0,1%.

45

Se lav 5 veces con PBS-Tween 0,1%. Se utiliz como control de carga

sinaptotagmina VI.
Western blot anti-sinaptotagmina VI: Las membranas previamente utilizadas
para detectar PLD1 se incubaron con HCl 50 mM durante 30 minutos. Se
bloque con PBS-Tween 0,1% leche 1 %. Se incub con anti-sinaptotagmina
VI (policlonal obtenido en conejo, Ab-cam) 2 g/ml en PBS-Tween 0,1%
leche 1%. Se lav 5 veces con PBS-Tween 0,1%. Se incub con anti-IgG de
conejo-peroxidasa 0,25 g/ml en PBS-Tween 0,1% leche 1%. Se lav 5 veces
con PBS-Tween 0,1%.
En todos los casos se revel utilizando mtodos basados en la
quimioluminicencia (ECL, GE y Western Lightning Chemiluminiscence
Reagent Plus, Perkin Elmer) y se expuso en placas fotogrficas (Kodak Xar).

Inmunofluorescencia

En todos los casos se fij con paraformaldehdo al 2% (excepto en el ensayo

de permeabilidad de GST-R en el que se fij con paraformaldehdo al 1%). Se
neutralizaron los aldehidos residuales con glicina 50 mM en PBS durante 15
minutos. Se permeabiliz con Tritn X-100 al 1% durante 15 minutos,
excepto cuando est especificado. Se bloque con PBS suero bovino al 5%
durante 30 minutos. Los anticuerpos se usaron en PBS suero bovino al 1%.
En algunos casos se realiz doble tincin con PSA-FITC como se explica
previamente para determinar la presencia del acrosoma. En todos los casos se
mont con propil-galato al 1% en PBS glicerol al 50%.
Anti-GST: Se incub con anti-GST 1:100 en durante 3 hs a temperatura
ambiente. Se lav 3 veces con PBS durante 5 minutos. Se incub con anti-IgG
de conejo-Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) 4 g/ml durante 1 h a
temperatura ambiente. Se lav 3 veces con PBS durante 5 minutos.
Anti-His: Se agreg anti-His (monoclonal obtenido en ratn, Calbiochem) 1
g/ml durante 1 h a 37C. Se lav 3 veces con PBS. Se incub con anti-IgG
46

de ratn-rodamina (Kirkegaard and Perry Laboratories) 10 g/ml durante 1 h.

Se lav 3 veces con PBS.
Anti-PLD: Se incub con anti-PLD1 10 g/ml durante toda la noche a 4C.
Se lav 3 veces con PBS. Se incub con anti-IgG de ratn-Alexa Fluor 546
(Molecular Probes) 4g/ml durante 1 h.

Fosforilacin de lpidos con ATP32P

Se permeabilizaron 50 x 106 clulas con SLO para cada condicin. Se utiliz
MgCl2 1mM y NaF 5 mM en HB-EGTA. Se incubaron 15 minutos a 37C en
presencia de U73122 15 M, luego se agreg 0,375Ci de ATP32P a cada
condicin y se estimul con Ca2+ equilibrado a 10 M, PMA 200 nM o PA 10
M durante 15 minutos a 37C. Se agreg 1 volumen de HCl 1M para
neutralizar los fosfoinostidos y 2 volmenes de cloroformo : metanol (1:1)
para extraer los lpidos neutros. Se tom la fase orgnica y se liofiliz. Luego
se resuspendi en cloroformo : metanol : agua (75:25:2) y se separaron los
lpidos por cromatografa en capa fina con cloroformo : acetona : metanol :
cido actico : agua (80:30:26:24:10). Luego se expusieron placas fotogrficas
para detectar los lpidos marcados con 32P. Se determin a qu fosfoinostido
corresponde cada mancha de acuerdo al grado de avance (Rf).

Anlisis estadstico

En los ensayos funcionales de reaccin acrosomal se normalizaron los

porcentajes con respecto a los controles sin estmulo (0%) o estimulados con
progesterona 15 M, A23187 10 M o Ca2+ equilibrado a 10 M con EGTA
(100%). Cada experimento se realiz por lo menos 3 veces. Se realiz
ANOVA de una va utilizando los datos normalizados excluyendo los
controles de referencia. Se establecieron los lmites de confianza de las medias
por test t de Student para determinar si las condiciones experimentales eran

47

diferentes de los controles negativos (sin estimular=0) o positivos

(estimulados=100). Las medias se compararon mediante dos tests post hoc. Se
utiliz test de Dunnet para comparar todas las medias con respecto a un
control y test de Tuckey-Kramer para comaparar todas las medias entre s. En
caso de ser necesario se realiz test de Student apareado para comparar alguna
media con su respectivo control. En todos los casos se considera significativo
un valor de p<0,05.

48

RESULTADOS

49

La salida de colesterol regula el anclaje de Rab3A

a las membranas
Antecedentes:
Durante el proceso de capacitacin se produce prdida de colesterol de la
membrana plasmtica que es la ltima etapa de la capacitacin y es necesaria
para la correcta localizacin de las protenas SNAREs (37;38;52;66;151).
Se conoce que metil--ciclodextrina (CyD) tiene la capacidad de extraer
colesterol de las membranas y hay bibliografa que sugiere que colesterol
podra estar regulando la reaccin acrosomal (147).
En nuestro laboratorio realizamos ensayos utilizando CyD para extraer
colesterol de las membranas o CyD cargada con colesterol (CyDC) para
aumentar la cantidad de colesterol presente en la membrana. Vimos que la
prdida de colesterol produce un pequeo pero significativo aumento en el
porcentaje de clulas que sufren la reaccin acrosomal tras un estmulo. Este
efecto se produce tanto en espermatozoides intactos (Figura 12 A, 2h y 5h;
Figura 12 B) (147) como en espermatozoides permeabilizados (Figura 12 C).
Por otro lado cuando se aumenta el contenido de colesterol en las membranas
por medio de CyDC se inhibe casi totalmente la reaccin acrosomal, tanto
disparada por A23187 (Figura 12 B) en espermatozoides vivos como por
Ca2+ en espermatozoides permeabilizados (Figura 12 C). Esta estimulacin de
la reaccin acrosomal slo se produce en espermatozoides capacitados
(Figura 12 A), lo que indica que la prdida de colesterol es necesaria pero no
suficiente para que se produzca la capacitacin (64). Tambin sugiere que la
prdida de colesterol tiene efectos ms all de la capacitacin en el propio
mecanismo implicado en la reaccin acrosomal.

50

control
Pg
CyDPg

a
a
a

0h
a

control
Pg
CyDPg

control
Pg
CyDPg

2h
c

5h

10 15 20 25 30 35

% reaccin acrosomal
B

control

a
b

A23187
CyD

a
a

CyDC

CyD A23
CyDC A23

20 40 60 80 100 120 140 160

Figura 12 Efecto de colesterol sobre

la reaccin acrosomal. A) Se tomaron
espermatozoides no capacitados (0h),
capacitados durante 2 h (2h) o
capacitados durante 5h (5h). Se trat o
no con metil--ciclodextrina (CyD)
1mM y luego se estimul con
progesterona (Pg) 15M. El control
corresponde a espermatozoides no
tratados con CyD ni estimulados con
Pg. B) Se trataron espermatozoides no
permeabilizados con CyD 1mM o CyD
cargada con colesterol (CyDC) 1mM y
luego se estimul o no con A23187
10M. C) Se trataron espermatozoides
permeabilizados con CyD 1mM o
CyDC 1mM y luego se estimul o no
con Ca2+ equilibrado a 10M. Las
barras de error corresponden al error
standard de la media (SEM). Los grupos
que llevan la misma letra no son
significativamente diferentes entre s
(p>0,05) de acuerdo al test de TukeyKramer.

% reaccin acrosomal relativa

C

Co
Ca
CyD
CyDC
CyD+Ca
CyDC+Ca

b
a
a
c
a
0

20 40 60 80 100 120 140 160

% reaccin acrosomal relativa

Para caracterizar el mecanismo por el cual colesterol regula la reaccin

acrosomal realizamos experimentos que nos permiten relacionar el efecto de
CyD y CyDC con respecto a la sealizacin por Ca2+.
Como expliqu previamente cuando se estimula la reaccin acrosomal se
producen varias movilizaciones de Ca2+. En espermatozoides permeabilizados
si bien slo podemos estudiar lo que sucede despus de la apertura de los

51

SOCCs, este modelo nos permiti ver que hay una segunda salida de Ca2+
acrosomal despus de la apertura de los SOCCs (19). Utilizando un quelante
de Ca2+ fotosensible permeable a membranas (NP-EGTA-AM) se puede
distinguir si un estimulante o un inhibidor de la reaccin acrosomal acta
antes o despus de la salida de Ca2+ acrosomal. Brevemente, se cargan las
clulas

permeabilizadas

con

NP-EGTA-AM

en

la

oscuridad.

En

espermatozoides permeabilizados el quelante atraviesa la membrana

acrosomal e ingresa al acrosoma donde secuestra el Ca2+ acrosomal siempre
que se mantenga en la oscuridad. Luego se estimula con Ca2+ 10M
simulando la apertura de los SOCCs. Las vas de sealizacin se activan hasta
la salida de Ca2+ acrosomal, pero como el Ca2+ est atrapado por el quelante
no se produce la reaccin acrosomal. Si se expone las clulas a la luz UV el
quelante pierde su afinidad por Ca2+ y se recupera la salida de Ca2+ acrosomal,
por lo tanto se produce la exocitosis. En este contexto si se usa un inhibidor o
un estimulante antes de agregar Ca2+ siempre va a tener efecto aunque se
ilumine la muestra despus, ya que va a actuar desde el principio. En cambio
cuando se agrega despus de adicionar el Ca2+, se preparar la maquinaria de
fusin hasta la salida de Ca2+ acrosomal, por lo tanto el inhibidor o
estimulante slo va a tener efecto si est regulando alguna va que se active

Figura 13 Esquema del experimento realizado con NP-EGTA-AM para determinar si CyD y CyDC actan
antes o despus de la salida de Ca2+ acrosomal.

52

despus de la salida de Ca2+ acrosomal. En la Figura 13 se esquematiza la

estrategia de NP-EGTA-AM usada, como se va a explicar a continuacin,
para estudiar el rol de colesterol en la reaccin acrosomal.
Usamos CyD y CyDC para extraer o agregar colesterol a las membranas
en el contexto de experimentos con NP-EGTA-AM. Esta estrategia nos
permite saber si colesterol regula una etapa anterior o posterior a la salida de
Ca2+ acrosomal. Tanto la prdida como el aumento de colesterol en las
membranas tienen efecto cuando CyD o CyDC se agregan antes que Ca2+
(Figura 14, NP CyD Ca2+ h y NP CyDC Ca2+ h), pero

control

**
ns

2+

Ca

Ca2+
NP

NP
Ca h

2+

CyD
Ca2+ h
NP

**

Ca CyD
h

NP

ns

2+

NP
CyDC
Ca2+ h

NP
Ca2+ CyDC
h

ns
0

50

100

150

200

% reaccin acrosomal relativa

Figura 14 Colesterol regula una etapa anterior a la salida de Ca2+ acrosomal. Se trataron espermatozoides
permeabilizados con NP-EGTA-AM 10M durante 15 minutos a 37C en la oscuridad. Luego se
incubaron con CyD o CyDC 1mM durante 15 minutos seguida de una estimulacin con Ca2+ equilibrado a
10 M durante 15 minutos ms. Se iluminaron con luz UV para destruir el quelante y luego se incubaron
durante 15 minutos (NP CyD Ca2+ h, NP CyDC Ca2+ h). De manera alternativa se
incubaron primero con Ca2+ y luego con CyD o CyDC antes de iluminarlos con luz UV (NP Ca2+
CyD h, NP Ca2+ CyDC h). Se utilizaron como control negativo espermatozoides cargados
con NP-EGTA-AM e incubado con Ca2+ mantenidos en la oscuridad (NP Ca2+). Como control positivo
se utilizaron espermatozoides cargados con NP-EGTA-AM, incubados con Ca2+ e iluminados con luz UV
(NP Ca2+ h). Los valores estn referidos a espermatozoides permeabilizados sin estimular (control,
0%) y a espermatozoides permeabilizados estimulados con Ca2+ (Ca2+, 100%). Las barras de error
corresponden al error standard de la media (SEM). Los grupos se compararon con NP Ca2+ h
utilizando el test de Dunnet y se clasificaron como no significativos (ns) (p>0,05), significativos (p< 0,05, *)
y altamente significativos (p<0,01, **).

53

no cuando se agregan despus (Figura 14, NP Ca2+ CyD h y NP

Ca2+ CyDC h). Esto nos indica que su efecto es anterior a la salida
de Ca2+ acrosomal. Se haba propuesto que el efecto de la prdida de
colesterol en la exocitosis acrosomal se deba a un aumento en la fluidez de la
membrana que hara que fuera ms fusognica (147). Si bien este experimento
no descarta el efecto de la fluidez en la fusin de membranas en la exocitosis
acrosomal s nos indica que colesterol est regulando una etapa anterior a la
salida de Ca2+ acrosomal (152).
Utilizando esta estrategia experimental hemos caracterizado la funcin de
diversas protenas implicadas en el ensamblaje de la maquinaria de fusin de
membranas. As determinamos que las protenas implicadas en el
reconocimiento y acercamiento de las membranas y en el ensamblaje del
complejo SNARE (trans flojo) actan antes de la salida de Ca2+ acrosomal.
Entre estas protenas podemos encontrar a Epac, Rab3A, -SNAP y NSF
(19;128). En cambio las protenas que controlan que se complete el
ensamblaje del complejo SNARE (trans apretado), como sinaptotagmina VI y
complexina, actan despus de la salida de Ca2+ acrosomal (123;126). Una
protena que acta antes de la salida de Ca2+ acrosomal es Rab3A y tiene un
rol fundamental en el ensamblaje de la maquinaria de fusin. Por esa razn
quisimos averiguar si existe alguna relacin entre la cantidad de colesterol en la
membrana plasmtica y el funcionamiento de Rab3A. Realizamos una curva
de concentracin de Rab3A recombinante prenilada y cargada con GTPS en
espermatozoides control, tratados con CyD o CyDC. Como vemos en la
Figura 15 la prdida de colesterol provoca que los espermatozoides
respondan ms a la estimulacin con Rab3A, mientras que el aumento de
colesterol los hace menos reactivos. A altas concentraciones de Rab3A no hay
diferencia en el porcentaje de reaccin acrosomal.

54

Figura 15 El contenido de colesterol de la membrana regula la estimulacin de la reaccin acrosomal

mediada por Rab3A. Se trataron espermatozoides permeabilizados con CyD o CyDC 1mM durante 15
minutos a 37C. Luego se estimul la reaccin acrosomal con cantidades crecientes de Rab3A prenilada y
cargada con GTPS durante 15 minutos ms. Las barras de error corresponden al error standard de la
media (SEM).

Resultados:
Hasta el momento tenamos evidencias de que colesterol afectaba la reaccin
acrosomal en espermatozoides humanos y que esa regulacin tena que ver
con Rab3A. Esto nos llev a hipotetizar que las membranas cambian su
capacidad para anclar Rab3A cuando vara su concentracin de colesterol.
Para probar esta hiptesis aislamos membranas de espermatozoides control o
tratados con CyD y las incubamos con Rab3A recombinante prenilada y
cargada con GTPS. Separamos las membranas y realizamos Western blot
contra Rab3A. Observamos que la prdida de colesterol produjo un aumento
del anclaje a membranas de Rab3A recombinante prenilada y activada (Figura
16 A y Figura 16 B). Se utiliz como control de carga el receptor a manosa-6fosfato (M6PR), que es una protena transmembrana presente en la membrana
del espermatozoide y su marca es proporcional a la cantidad de membranas
sembradas.
55

Durante la capacitacin se pierde colesterol de la membrana, por lo que

pensamos que durante este proceso podra estar afectada la capacidad de
Rab3A de anclarse a membranas. Realizamos un procedimiento similar en
espermatozoides

no

capacitados.

Como

puede

observarse,

en

espermatozoides no capacitados el anclaje de Rab3A a membranas es menor

que en espermatozoides capacitados. Cuando se trata espermatozoides no
capacitados con CyD se alcanzan los niveles de Rab3A asociada a membrana
que se observan en espermatozoides capacitados (Figura 16 C). Esto puede
deberse a que la concentracin de colesterol en espermatozoides no
capacitados y tratados con CyD es similar a la de espermatozoides capacitados
sin tratar con CyD (datos no mostrados, ver (152)). Se utiliz la tincin de
protenas con rojo Ponceau como control de carga.

Figura 16 La concentracin de colesterol en membranas afecta el anclaje de Rab3A. A) Se extrajeron

membranas de espermatozoides capacitados tratados o no con CyD durante 15 minutos a 37C. Luego se
incubaron con GST-Rab3A recombinante prenilada y cargada con GTPS, se lavaron y se realiz Western
blot con un anticuerpo anti-Rab3A. Como control de carga se utiliz el receptor de manosa-6-fosfato
(M6PR). B) Se extrajeron membranas de espermatozoides no capacitados tratados o no con CyD durante
15 minutos a 37C y de espermatozoides capacitados no tratados con CyD. Se incubaron las membranas
con GST-Rab3A recombinante prenilada y cargada con GTPS, se lavaron y se realiz Western blot con un
anticuerpo anti-Rab3A. Como control de carga se utiliz la tincin con rojo Ponceau. C) Se midi la
intensidad de la marca de GST-Rab3A en membranas de espermatozoides no capacitados tratados o no con
CyD y de espermatozoides capacitados tratados o no con CyD. Los valores se normalizaron con respecto a
espermatozoides capacitados no tratados con CyD. Las barras de error corresponden al error standard de la
media (SEM) de 3 experimentos independientes, *: p<0,05; **: p<0,01.

56

Si la prdida de colesterol afecta la capacidad de la membrana para que se

ancle Rab3A, debera verse la misma regulacin con la protena endgena.
Como puede observarse en la Figura 17, la prdida de colesterol, ya sea por
capacitacin o tratamiento con ciclodextrina, lleva a que aumente la cantidad
de Rab3A endgena asociada a membranas. Como la cantidad de Rab3A
presente en los extractos totales de espermatozoides es similar tanto en
espermatozoides capacitados como no capacitados (Figura 17 A, ext no cap,
ext cap), el efecto que vemos en las membranas slo se debe a la asociacin de
Rab3A a membranas y no a un aumento de la cantidad total de Rab3A
presente en espermatozoide. En la Figura 17 B se midi la densitometra de
las bandas de la Figura 17 A y se calcul la intensidad relativa, proporcional a
la cantidad de Rab3A asociada a membranas. Es interesante destacar que la
cantidad de Rab3A asociada a membranas de espermatozoides no capacitados
tratados con CyD es similar a la de membranas de espermatozoides
capacitados no tratados con CyD.

Figura 17 - El contenido de colesterol de las membranas regula el anclaje de Rab3A endgena. A) Se

extrajeron membranas de espermatozoides capacitados o no y tratados o no con CyD durante 15 minutos a
37C. Luego se realiz Western blot contra Rab3A. Se sembraron tambin extractos totales de
espermatozoides capacitados y no capacitados. Se utiliz un extracto de cerebro de rata como control
positivo. Se utiliz la tincin con Rojo Ponceau como control de carga. B) Se midi la intensidad de la
marca de Rab3A. Los valores se normalizaron con respecto a membranas de espermatozoides capacitados
sin tratar con CyD. Las barras de error correspondes al error standard de la media (SEM) de 3
experimentos independientes, *: p<0,05; **: p<0,01.

57

Estos resultados son muy interesantes, porque si bien la prdida de

colesterol no es suficiente para que se produzca el proceso de capacitacin s
es necesaria para que se ancle Rab3A a la membrana, un requisito para la
reaccin acrosomal. Tambin pudimos ver que el anclaje de Rab3A slo est
regulado por la prdida de colesterol y no por otros cambios que suceden en
la capacitacin, como el aumento de la fosforilacin de protenas en serina y
treonina o en tirosina, ya que en espermatozoides no capacitados tratados con
CyD tambin aument la asociacin de Rab3A a membranas.
Durante la capacitacin la prdida de colesterol est altamente regulada y
slo se produce en un pequeo porcentaje de clulas. Slo ocurre en clulas
en las que previamente se activ la adenilato ciclasa soluble y se movilizaron
los lpidos entre la hemicapa interna y externa (66). Se ha descrito que las
protenas SNAREs sufren una redistribucin despus de la prdida de
colesterol (149).
Las protenas SNAREs normalmente estn asociadas a microdominios
ricos en colesterol por medio de residuos palmitoilo presentes en cistenas de
SNAP-25 o alguna protena homloga (148). Los microdominios ricos en
colesterol tienen alta afinidad por cidos grasos saturados, pero excluyen a los
cidos grasos insaturados (142). El grupo geranil-geranilo presente en Rab3A
es un sistema conjugado altamente insaturado, por lo que es de esperar que
quede excluido de los microdominios ricos en colesterol. Nuestros resultados
concuerdan con esta suposicin, ya que la prdida de colesterol de la
membrana del espermatozoide induce un aumento del anclaje de Rab3A a
membranas.
Debido a que las protenas SNAREs tienen afinidad por microdominios
ricos en colesterol y Rab3A queda excluida, el contenido de colesterol en la
membrana debe estar altamente regulado para que se formen los complejos
proteicos que conducen a la fusin de las membranas. Estos resultados nos
inducen a pensar que una de las ltimas etapas del proceso de capacitacin es

58

la preparacin de la maquinaria proteica implicada en la fusin de membranas

durante la reaccin acrosomal donde Rab3A y las protenas SNAREs se
localizan en la misma regin de la membrana. Luego Rab3A se activa en
respuesta al ingreso de Ca2+ extracelular y dispara una cascada que finalmente
producir el ensamblaje del complejo SNARE y la fusin de membranas.

59

Desarrollo de tcnicas que permitan producir

protenas

recombinantes

permeables

membranas Estudio de la funcin de Rab3A en

espermatozoides no permeabilizados
Como ya mencionamos previamente, el espermatozoide es una clula
transcripcionalmente inactiva (13) y a pesar de que se haya descrito sntesis de
protenas en las mitocondrias (15) no es algo que est bien caracterizado y
todava hay muchas controversias al respecto. Estas caractersticas hacen que
no sea posible usar tcnicas como la transfeccin y sobrexpresin para
estudiar el rol de distintas protenas en las vas de transduccin de seales que
disparan la reaccin acrosomal. Si bien se pueden usar agonistas y antagonistas
farmacolgicos de las protenas implicadas para analizar cascadas de
sealizacin, estamos limitados a la disponibilidad de drogas permeables a
membrana. Una metodologa que nos permiti solucionar este problema fue
la permeabilizacin con SLO (118;119). Con esta tcnica se generan poros en
la membrana por donde pueden ingresar protenas u otros reactivos
impermeables a membranas. El principal inconveniente de esta tcnica es la
prdida de caractersticas propias del espermatozoide como la motilidad y los
gradientes de membranas. Es por eso que si bien podemos sacar mucha
informacin utilizando espermatozoides permeabilizados se vuelve necesario
el uso de tcnicas que permitan trabajar en condiciones ms cercanas a las
fisiolgicas.
Una alternativa en la que pensamos fue el uso de pptidos ricos en
arginina. Estos pptidos tienen la capacidad de transportarse a travs de las
membranas

pueden

transportar

protenas

unidas

covalentemente

(150;153;154). En un principio se propuso un mecanismo de translocacin a

60

travs de la membrana plasmtica (153-157). Luego se determin que muchos

de los casos ocurra en realidad un artificio de la fijacin que internalizaba las
protenas que estaban unidas extracelularmente a la membrana plasmtica
(158;159). En varios tipos celulares el mecanismo de internalizacin ocurre
por medio de macropinocitosis y los pptidos translocaban a partir de los
endosomas, aunque no se descarta que haya algo de translocacin a travs de
la membrana plasmtica (158;159). Esto sera un problema en el caso del
espermatozoide ya que no se ha descrito que haya endocitosis (160;161), por
lo que no es posible que la internalizacin sea por macropinocitosis. Como no
est descartado que haya translocacin a travs de la membrana plasmtica
decidimos probar esta metodologa en espermatozoide.
Utilizamos dos protenas unidas al pptido RRRQRRKRRRQ: GST-R
que tiene el pptido en el extremo C-terminal y His6-R-Rab3A que tiene el
pptido en el extremo N-terminal. La protena GST no tiene ninguna funcin
en el mecanismo de reaccin acrosomal, mientras que Rab3A est presente en
espermatozoides y es capaz de disparar la reaccin acrosomal (119).
Lo primero que probamos fue que estas protenas pudieran ingresar a
espermatozoides. En un primer experimento utilizamos GST o GST-R

Figura 18 GST-R ingresa al citosol de espermatozoides humanos. Se trataron espermatozoides

con GST o GST-R marcadas con tetrametilrodamina, se lavaron, se fijaron y se observaron por
microscopa confocal. Barra, 10m.

61

marcadas con tetrametilrodamina. Despus de incubar las clulas con las

protenas, se lavaron y se fijaron para observarlas por microscopa confocal.
Como puede observarse en la Figura 18 slo las clulas incubadas con GST-R
presentan marca mientras que las clulas que fueron incubadas con GST no
unida al pptido RRRQRRKRRRQ no se marcaron.
Tambin quisimos determinar si His6-R-Rab3A era capaz de ingresar a
las clulas. Incubamos las clulas con His6-R-Rab3A o como control con His6-SNAP, una protena no permeable que contiene His6. Luego realizamos
inmunofluorescencia indirecta con un anticuerpo anti-His6. Como podemos
notar en la Figura 19, slo His6-R-Rab3A puede ingresar a los
espermatozoides, mientras que las clulas incubadas con His6--SNAP no
presentan marca.

Figura 19 His6-R-Rab3A ingresa en espermatozoides humanos. Se trataron espermatozoides con His6-SNAP o His6-R-Rab3A, se lavaron y se fijaron. Luego se realiz inmunofluorescencia indirecta con un
anticuerpo anti-His6 y un anticuerpo secundario marcado con tetrametilrodamina. Barra, 10m.

Hasta el momento nuestros resultados parecen sugerir que los pptidos

ricos en R pueden usarse para translocar protenas a espermatozoides. Pero,
como ya lo mencion, hay reportes que indican que la fijacin puede causar el

62

ingreso de estas protenas a las clulas (158). Otro artificio que podra ocurrir
sera que las protenas estuvieran unidas externamente a las membranas. Dado
el pequeo volumen del espermatozoide no podemos distinguir si la protena
ingresa a las clulas o si se encuentra unida externamente a la membrana. Por
lo que fue necesario realizar controles que nos permitieran saber si realmente
estas protenas estaban ingresando en espermatozoides vivos.
Para averiguar si las protenas se encontraban dentro de las clulas o
simplemente unidas a las membranas por el lado externo incubamos las
clulas con His6-R-Rab3A y luego realizamos inmunofluorescencia indirecta
permeabilizando o no con Triton X-100. Como puede observarse en la
Figura 20 las clulas permeabilizadas con Triton X-100 presentan mayor
marca que las clulas no permeabilizadas, lo que indica que, si bien puede
haber protena unida externamente a membranas, la mayor parte se encuentra
dentro de las clulas.

Figura
20

Se
trataron
espermatozoides con His6-R-Rab3A,
se lavaron, se fijaron y se realiz
inmunofluorescencia indirecta con
anti-His6 en clulas permeabilizadas
con
Triton
X-100
o
no
permeabilizadas. Barra, 10 m.

Para descartar que la marca fuera un artificio de la fijacin utilizamos

tripsina, una proteasa. Despus de incubar las clulas con GST o GST-R se las
trat con 1 mg/ml de tripsina durante 20 minutos y se fren la reaccin con
2 mg/ml de inhibidor de tripsina. En estas condiciones las protenas que se

63

encontraran fuera de las clulas seran degradadas aun cuando estuvieran

unidas fuertemente a la membrana. En cambio las protenas que ingresaran a
las clulas estaran protegidas por la membrana plasmtica. Luego del
tratamiento hicimos inmunofluorescencia indirecta (Figura 21 A) y Western
blot anti-GST (Figura 21 B). Como podemos apreciar en la Figura 21 slo
las

clulas

tratadas

con

GST-R

presentan

marca

tanto

por

inmunofluorescencia indirecta como por Western blot, lo que indica que las
protenas que contienen el pptido RRRQRRKRRRQ pueden ingresar a los
espermatozoides y los resultados observados no constituyen un artificio de la
fijacin.
A

Figura 21 Se incubaron espermatozoides con GST o GST-R, luego se trataron con 1 mg/ml de tripsina y
se fren la protelisis con 2 mg/ml de inhibidor de tripsina. A) Se tom una alcuota de cada condicin y se
realiz inmunofluorescencia indirecta con un anticuerpo anti-GST y un anticuerpo secundario marcado con
Alexa Fluor 488. Barra, 10m. B) Al resto de las clulas se les extrajo las protenas y se realiz Western blot
con un anticuerpo anti-GST. Ext GTR-R: extracto de espermatozoides tratados con GST-R; ext GST:
extracto de espermatozoides tratados con GST; GST-R: 100ng de GST-R.

Los resultados anteriores sugieren que estas protenas no son txicas para
las clulas, ya que si las clulas perdieran la integridad de las membranas la
tripsina degradara las protenas permeables. De todas maneras controlamos
con eosina la viabilidad de espermatozoides tratados con His6-R-Rab3A y no
se vio afectada (control 77,4% 6,4%; His6-R-Rab3A 83,8% 1%; n=5). La

64

motilidad tampoco se vio afectada (control 66,7% 7,3%; His6-R-Rab3A

75,6% 1,5%; n=5). Probamos tambin GST-R marcada con Oregon green
488 y se incorpor en espermatozoides vivos sin afectar la motilidad (no
mostrado).
Hasta el momento todo indicaba que los pptidos ricos en arginina
ingresaban al citosol de espermatozoides a pesar de que no realizaran
endocitosis. Esto favorecera la hiptesis de que His6-R-Rab3A podra usarse
en ensayos funcionales de reaccin acrosomal. Sabiendo que Rab3A puede
disparar la reaccin acrosomal en espermatozoides permeabilizados (119),
quisimos averiguar si His6-R-Rab3A poda ejercer el mismo efecto en
espermatozoides vivos. Como podemos observar en la Figura 22, His6-RRab3A estimul la reaccin acrosomal, mientras que GST-Rab3A y His6Rab3A (protenas sin el pptido RRRQRRKRRRQ) no pudieron disparar la
reaccin acrosomal. Esto indica que el pptido rico en arginina es necesario
para que la protena pueda ingresar a la clula y tener un efecto biolgico.
Tampoco se trata de un artificio causado por el pptido RRRQRRKRRRQ ya
que GST-R no tuvo ningn efecto sobre la reaccin acrosomal.
a

control

A23187

GST-R

GST-Rab3A
His6-Rab3A

His6-R-Rab3A

b
0

20

40

60

80

100

% reaccin acrosomal relativa

Figura 22 His6-R-Rab3A dispara la reaccin acrosomal en espermatozoides vivos. Se incubaron
espermatozoides vivos en condiciones control, o tratados con A23187 10M, GST-R 1M, GST-Rab3A
1M, His6-Rab3A 1M y His6-R-Rab3A 1M durante 15 minutos a 37C. Las barras de error representan
el error standard de la media (SEM). Las medias de los grupos que llevan la misma letra no difieren
significativamente entre s (p>0,05) de acuerdo al test de Tukey-Kramer.

65

Como ya lo mencionamos previamente, las protenas Rab ciclan entre un

estado activo cuando estn unidas a GTP y un estado inactivo cuando estn
unidas a GDP y se unen a membranas por medio de dos grupos geranilgeranilo unidos a dos residuos de cistena (129). Decidimos estudiar la
regulacin de Rab3A en espermatozoides vivos. Primero determinamos si
His6-R-Rab3A era capaz de disparar la reaccin acrosomal sin estar prenilada y
activada. Como lo demuestra la Figura 23, His6-R-Rab3A solo pudo disparar
la reaccin acrosomal cuando estaba prenilada y cargada con GTPS (pHis6R-RabGTPS), un anlogo no hidrolizable de GTP. No pudo generar el
mismo efecto cuando estaba prenilada y cargada con GDPS (pHis6-RRabGDPS), un anlogo no fosforilable de GDP. La protena sin prenilar, ya
sea cargada con GTPS (s/pHis6-R-RabGTPS) o con GDPS (s/pHis6-RRabGDPS) tampoco pudo disparar la reaccin acrosomal. Esto nos llev a
concluir que His6-R-Rab3A necesita estar prenilada y activada para disparar la
reaccin acrosomal.

control

A23187
pHis6-R-RabGTPS

pHis6-R-RabGDPS

s/pHis6-R-RabGTPS

s/pHis6-R-RabGDPS

a
0

20

40

60

80

100

% reaccin acrosomal relativa

Figura 23 His6-R-Rab3A debe estar prenilada y activada para disparar la reaccin acrosomal. Se incub
espermatozoides en condiciones control o tratados con A23187 10M, His6-R-Rab3A 1M prenilada y
cargada con GTPS (pHis6-R-RabGTPS), His6-R-Rab3A 1M prenilada y cargada con GDPS (pHis6-RRabGDPS), His6-R-Rab3A 1M sin prenilar cargada con GTPS (s/pHis6-R-RabGTPS) o His6-RRab3A 1M sin prenilar cargada con GDPS (s/pHis6-R-RabGDPS) durante 15 minutos a 37C. Las
barras de error representan el error standard de la media (SEM). Las medias de los grupos que llevan la
misma letra no difieren significativamente entre s (p>0,05) de acuerdo al test de Tukey-Kramer.

66

Nos preguntamos si His6-R-Rab3A sin prenilar y unida a GDPS ejerca

un efecto inhibitorio sobre la exocitosis acrosomal disparada por progesterona
o por A23187. Esta idea surgi porque en otros modelos celulares las
protenas Rab mutantes de baja afinidad por GTP suelen tener efecto
dominante negativo (162-164). Adems est descrito que pptidos derivados
de Rab3A tienen efecto inhibitorio en espermatozoides (165). Como se
muestra en la Figura 24, His6-R-Rab3A sin prenilar y unida a GDPS inhibe
tanto la reaccin acrosomal disparada por progesterona (s/pHis6-RRabGDPS Pg) como la reaccin acrosomal disparada por el ionforo de
Ca2+ A23187 (s/pHis6-R-Rab3AGDPS A23187); mientras que la protena
no permeable no tuvo efecto inhibitorio (s/pHis6-RabGDPS Pg, s/pHis6RabGDPS A23187). El mecanismo por el cual His6-R-Rab3A inhibe la
reaccin acrosomal disparada por progesterona y por A23187 no est
caracterizado. Suponemos que Rab3A es parte de las vas disparadas por
ambos agonistas y que la protena cargada con GDPS est secuestrando a la
protena GEF, lo que impide que se realice en intercambio de GDP por GTP
control

Pg
s/pHis6-R-RabGDPS

s/pHis6-R-RabGDPSPg

s/pHis6-RabGDPSPg

c
a

control
A23187
s/pHis6-R-RabGDPSA23187

c
b

s/pHis6-RabGDPSA23187

c
0

20

40

60

80

100

120

% reaccin acrosomal relativa

Figura 24 His6-Rab3A inactiva inhibe la reaccin acrosomal disparada por progesterona y Ca2+.
Incubamos espermatozoides con la protena His6-R-Rab3A sin prenilar y cargada con GDPS (s/pHis6-RRabGDPS) 1M o con His6-Rab3A sin prenilar cargada con GDPS (s/pHis6-RabGDPS) 1M durante
15 minutos y luego estimulamos con progesterona (Pg) 15M o A23187 10M. Como controles utilizamos
clulas sin estimular (control), o estimuladas con progesterona (Pg) 15M o A23187 10M. Las barras de
error representan el error standard de la media (SEM). Las medias de los grupos que llevan la misma letra
no difieren significativamente entre s (p>0,05) de acuerdo al test de Tukey-Kramer.

67

en la protena endgena.
Como vimos anteriormente la prdida de colesterol de las membranas
aumenta el porcentaje de reaccin acrosomal disparada por Rab3A en
espermatozoides permeabilizados, mientras que el aumento de colesterol en
las membranas lo disminuye (152). Quisimos saber si His6-R-Rab3A estaba
sometida a la misma regulacin que observamos en la protena endgena y
GST-Rab3A recombinante en espermatozoides permeabilizados (152).
Tratamos espermatozoides no permeabilizados con CyD o CyDC y luego
estimulamos con His6-R-Rab3A prenilada y activada con GTPS. Como
puede observarse en la Figura 25 el contenido de colesterol de la membrana
plasmtica regula la reaccin acrosomal disparada por His6-R-Rab3A. El
tratamiento con CyD produce una salida de colesterol en la membrana y
aumenta el porcentaje de espermatozoides que sufren la reaccin acrosomal
tras la estimulacin con His6-R-Rab3A (Figura 25 A, CyD pHis-RRabGTPS). Por el contrario, el tratamiento con CyDC, que aumenta la
concentracin de colesterol en la membrana plasmtica, produjo una
inhibicin de la reaccin acrosomal disparada por His6-R-Rab3A (Figura 25
A, CyDC pHis-R-RabGTPS). Cuando se trataron los espermatozoides
con anfotericina B, un antibitico que acta como disruptor de colesterol
(152), se inhibi la reaccin acrosomal disparada por la protena (Figura 25 A,
Amph pHis-R-RabGTPS). Esto concuerda con lo que se haba observado
previamente en espermatozoides permeabilizados, donde vimos que se
requiere una concentracin de colesterol ptima en la membrana para que se
produzca la reaccin acrosomal.
Se realiz tambin una curva de concentracin de His6-R-Rab3A
prenilada y cargada con GTPS en espermatozoides control, tratados con
CyD o con CyDC. Como se observa en la Figura 25 B, cuando tratamos con
CyD obtuvimos el mismo efecto observado previamente en espermatozoides
permeabilizados: aumento de la estimulacin de la reaccin acrosomal a bajas
68

control

A23187

pHis-R-RabGTPS

CyDpHis-R-RabGTPS

CyDCpHis-R-RabGTPS

AmphpHis-R-RabGTPS
0

30

60

90

120 150

% reaccin acrosomal relativa

% reaccin acrosomal relativa

150
120
90
60
control
+CyD

30
0
0

0,5

1,5

pHis-R-RabGTPS (M)
Figura 25 La estimulacin de la reaccin acrosomal disparada por His6-R-Rab3A est regulada por el
contenido de colesterol de la membrana. A) Se trat espermatozoides con CyD 1mM, CyDC 1mM o
anfotericina B (Amph) 12,5g/ml durante 15 minutos y luego se estimul con His6-R-Rab3A prenilada y
cargada con GTPS (pHis-R-RabGTPS) 1M. B) Curva de estimulacin de la reaccin acrosomal
disparada por His6-R-Rab3A (pHis-R-RabGTPS) en condiciones control y en espermatozoides tratados
previamente con CyD 1mM. Las barras de error representan el error standard de la media (SEM). En A)
las medias de los grupos que llevan la misma letra no difieren significativamente entre s (p>0,05) de
acuerdo al test de Tukey-Kramer.

concentraciones de la protena (Figura 25 B). Sin embargo cuando se utiliz

CyDC no se estimula la reaccin acrosomal con altas concentraciones de His6R-Rab3A como sucede en espermatozoides permeabilizados (datos no
mostrados). Esta diferencia puede deberse a que la entrada de His6-R-Rab3A a
travs de las membranas no sea suficientemente alta como para rescatar la
inhibicin producida por un exceso de colesterol en la membrana.

69

Hasta el momento hemos determinado que las protenas unidas al

pptido RRRQRRKRRRQ pueden ingresar a espermatozoides vivos y que
His6-R-Rab3A es capaz de disparar la reaccin acrosomal cuando est
prenilada y activada. Hemos estudiado tambin el efecto de la protena cuando
est sin prenilar o cargada con GDPS y su regulacin por colesterol. Nuestro
siguiente propsito fue establecer dnde se ubicaba Rab3A en la cascada de
sealizacin con respecto a Ca2+. Los experimentos realizados en
espermatozoides permeabilizados sugieren que Rab3A se activa despus de la
apertura de los SOCCs y antes de la salida de Ca2+ acrosomal (19), pero nunca
se haba caracterizado en un contexto fisiolgico. El objetivo de los siguientes
experimentos fue determinar en qu punto de todas las movilizaciones de
Ca2+ se activa Rab3A.
En primera instancia probamos inhibidores que actan antes de la
apertura de los SOCCs. Usamos nifedipina (Figura 26, Nf Pg y Nf
pHis6-R-RabGTPS), verapamilo (Figura 26, Vp Pg y Vp pHis6-RRabGTPS) y Ni2+ (Figura 26, Ni Pg y Ni pHis6-R-RabGTPS), que
inhiben los canales de Ca2+ dependientes de voltaje y H89 que inhibe PKA
(Figura 26, H89 Pg y H89 pHis6-R-RabGTPS), una protena que se
activa antes de la apertura de los SOCCs. Todos estos inhibidores pudieron
evitar que se produzca la reaccin acrosomal en espermatozoides estimulados
con progesterona, pero no tuvieron efecto en la reaccin acrosomal disparada
por His6-R-Rab3A. Esto implicara que Rab3A no necesita Ca2+ extracelular
cuando ya est activada, o que produce un ingreso de Ca2+ independiente de
esos canales. En cambio como progesterona requiere de estas vas para
disparar la reaccin acrosomal, todos estos inhibidores bloquearon la
exocitosis cuando se estimul con progesterona.
En los siguientes experimentos quisimos caracterizar mejor la funcin de
Rab3A con respecto a las movilizaciones de Ca2+. Para eso utilizamos
quelantes de Ca2+ extracelulares, quelantes de Ca2+ permeables e inhibidores
70

control
A23187
pHis6-R-RabGTPS
NfpHis6 -R-RabGTPS

ns
ns

VppHis6 -R-RabGTPS
NipHis6 -R-RabGTPS

ns
ns

H89pHis6 -R-RabGTPS
Pg
s

NfPg
s

VpPg
s

NiPg

H89Pg
-20

20

40

60

80

100

120

% reaccin acrosomal relativa

Figura 26 Inhibidores de las vas de sealizacin anteriores a la apertura de los SOCCs no tienen
efecto sobre la estimulacin con His6-R-Rab3A. Se trataron espermatozoides con nifedipina 120M
(Nf), verapamilo 100 M (Vp), Ni2+ 100M (Ni) o H89 10M (H89) durante 15 minutos. Luego se
estimularon con His6-R-Rab3A prenilada y cargada con GTPS 1M (pHis6-R-RabGTPS) o
progesterona 15 M (Pg) durante 15 minutos ms. Las barras de error representan el error standard
de la media (SEM). Las medias de los grupos tratadas con inhibidores se compararon con las medias
de los grupos sin inhibidores por medio del test de Dunnet. Las medias se clasificaron como
significativas (s, p<0,05) o no significativas (ns, p>0,05).

de los canales de Ca2+ dependientes de IP3 presentes en el acrosoma (19;102).

Cuando utilizamos BAPTA, un quelante de Ca2+ extracelular, se evita la
entrada de Ca2+ a travs de canales. En esas condiciones se inhibi tanto la
reaccin acrosomal disparada por progesterona (Figura 27 A, BAPTA Pg)
como por A23187 (Figura 27 A, BAPTA A23187). En cambio cuando
estimulamos con His6-R-Rab3A no se produjo inhibicin de la reaccin
acrosomal (Figura 27 A, BAPTA pHis6-R-RabGTPS). Esto nos indica
que una vez que Rab3A se activa no es necesario el Ca2+ citoslico. Utilizando
BAPTA-AM, un quelante permeable a membranas, podemos secuestrar el
Ca2+ citoslico y estudiar su funcin en la exocitosis. En estas condiciones
tampoco se vio afectada la reaccin acrosomal disparada por His6-R-Rab3A

71

(Figura 27 A, BAPTA-AM pHis6-R-RabGTPS), mientras que la reaccin

acrosomal disparada por progesterona s se inhibi (Figura 27 A, BAPTAAM Pg). Como ya se describi previamente despus de a la apertura de los
SOCCs se produce una salida de Ca2+ acrosomal dependiente de IP3 (19).
Nuestro siguiente objetivo fue estudiar qu relacin tiene Rab3A con respecto
a la salida de Ca2+ acrosomal. En primera instancia utilizamos dos inhibidores
de canales de Ca2+ dependientes de IP3, xestospongina C y 2-APB. Los dos
inhibidores evitaron que se produjera la reaccin acrosomal tanto cuando se
estimul con progesterona (Figura 27 A, Xp Pg y 2-APB Pg) como
cuando se utiliz His6-R-Rab3A (Figura 27 A, Xp pHis6-R-RabGTPS y
2-APB pHis6-R-RabGTPS). Esto nos indica que la salida de Ca2+
acrosomal es necesaria para que se produzca la exocitosis acrosomal disparada
por His6-R-Rab3A. Otra estrategia que tambin utilizamos para abordar este
tema fue vaciar de Ca2+ el acrosoma. Para eso utilizamos tapsigargina, un
inhibidor de la ATPasa acrosomal que carga de Ca2+ el acrosoma. Cuando se
usa tapsigargina en espermatozoides vivos la disminucin de la concentracin
de Ca2+ acrosomal desencadena la apertura de los SOCCs y el ingreso masivo
de Ca2+ extracelular desencadena la reaccin acrosomal. Sin embargo nosotros
utilizamos tapsigargina en presencia de BAPTA, un quelante de Ca2+
extracelular para evitar la entrada de Ca2+ extracelular. En estas condiciones a
pesar de que se dispare la apertura de los SOCCs no se produce la reaccin
acrosomal. As podemos investigar si es necesario el Ca2+ acrosomal cuando
disparamos la reaccin acrosomal con His6-R-Rab3A. Como podemos
observar en la Figura 27 A este tratamiento inhibi tanto la reaccin
acrosomal disparada por progesterona (Figura 27 A, BAPTA + Tg Pg)
como por His6-R-Rab3A (Figura 27 A, BAPTA + Tg pHis6-RRabGTPS). Tambin se inhibi la reaccin acrosomal cuando se utilizaron
concentraciones de BAPTA-AM suficientemente altas como para que el
quelante ingrese al acrosoma y secuestre el Ca2+ acrosomal (Figura 27 B).
72

A
A23187
BAPTAA23187

Pg
BAPTAPg
BAPTA+TgPg
BAPTA-AMPg
XpPg
2APBPg

s
s
s
s
s

pHis6 -R-RabGTPS
BAPTApHis6-R-RabGTPS
BAPTA+TgpHis6-R-RabGTPS
BAPTA-AMpHis6 -R-RabGTPS
XppHis6 -R-RabGTPS
2APBpHis6-R-RabGTPS

ns
s
ns
s
s

-20 0 20 40 60 80 100 120

% reaccin acrosomal relativa

B
% reaccin acrosomal relativa

120

pHis6-R-RabGTPS
Pg

100
80
60
40
20
0
-20
0

10

30

BAPTA-AM (M)

Figura 27 La reaccin acrosomal disparada por His6-R-Rab3A es independiente del Ca2+

extracelular. A) Se incubaron espermatozoides con BAPTA 5mM (BAPTA), BAPTA 5mM +
tapsigargina 1M (BAPTA + Tg), BAPTA-AM 2,5M (BAPTA-AM), xestospongina C 2,2M (Xp)
o 2-APB 100M (2APB) durante 15 minutos. Luego se estimul con A23187 10M, progesterona
15M (Pg) o His6-R-Rab3A 1M prenilada y cargada con GTPS (pHis6-R-RabGTPS) durante 15
minutos ms. B) Curva de inhibicin con BAPTA-AM de la estimulacin con progesterona 15M o
His6-R-Rab3A 1M prenilada y cargada con GTPS. Las barras de error representan el error
standard de la media (SEM). En A) las medias de los grupos tratadas con inhibidires se compararon
con las medias de los grupos sin inhibidores por medio del test de Dunnet y se clasificaron como
significativas (s, p<0,05) o no significativas (ns, p>0,05).

Todos estos resultados nos indican que Rab3A se activa despus de la

entrada de Ca2+ extracelular a travs de los SOCCs. Como utilizamos la
protena ya activada con GTPS la reaccin acrosomal procede de manera

73

independiente del Ca2+ extracelular y citoslico. Sin embargo es necesario que

se produzca la salida de Ca2+ acrosomal para que se complete el proceso de
exocitosis acrosomal y cuando est bloqueada de diversas formas se inhibe la
reaccin acrosomal.
En esta parte del trabajo hemos utilizado un pptido rico en arginina para
translocar protenas al espermatozoide. Esta metodologa hasta el momento
no haba sido utilizada en espermatozoides. Hay mucha controversia acerca
del mecanismo por el cual estas protenas ingresan a las clulas. Aunque casi
todos estn de acuerdo en que hace falta endocitosis y que se transportan al
citosol a partir del endosoma, no se descarta que paralelamente se est
produciendo translocacin a travs de la membrana plasmtica (159;166). Si
bien en este trabajo no se ha profundizado el mecanismo de ingreso de los
pptidos ricos en arginina, todo nos lleva a pensar que se estn transportando
a travs de la membrana plasmtica, ya que el espermatozoide no realiza
endocitosis (160;161).
El uso de pptidos ricos en arginina nos permiti estudiar el rol de
Rab3A en espermatozoides intactos. Pudimos inhibir la reaccin acrosomal
disparada por progesterona y por A23187 utilizando His6-R-Rab3A sin
prenilar cargada con GDPS. Esta es la primera evidencia directa de que
Rab3A est en la va de sealizacin disparada por progesterona. Tambin
estudiamos la regulacin por colesterol de la reaccin acrosomal disparada por
His6-R-Rab3A. Llegamos a conclusiones similares a las que habamos llegado
en espermatozoides permeabilizados. Por primera vez pudimos utilizar
inhibidores de las vas anteriores a la apertura de los SOCCs sin el
inconveniente de que el espermatozoide permeabilizado haya perdido los
gradientes de membrana. De esta manera comprobamos que Rab3A se activa
despus de la apertura de los SOCCs pero antes de la salida de Ca2+
acrosomal. Esta metodologa nos permite una infinidad de posibilidades para
ver el rol de protenas en espermatozoides vivos y estudiar los mecanismos

74

moleculares que se activan antes de la apertura de los SOCCs en condiciones

fisiolgicas con estimulantes como progesterona o ZP3.

75

Rol de lpidos como segundos mensajeros en la

reaccin acrosomal
Los lpidos son fundamentales para toda clula viva, forman la membrana
plasmtica, que adems de mantener separado el citoplasma del entorno,
permite que la clula se comunique. La composicin lipdica de la membrana
es muy importante y determina las caractersticas propias de cada membrana
como la fluidez. Adems de tener una funcin estructural importante los
lpidos pueden ser segundos mensajeros. Es de nuestro inters estudiar este
rol en los fosfoinostidos y DAG durante la reaccin acrosomal.
Los fosfoinostidos son fosfolpidos que estn unidos por un enlace
fosfodiester al carbono 1 de inositol. Se sintetizan en el retculo
endoplasmtico (167) y se encuentran en la hemicapa interna de la membrana
plasmtica. Como el espermatozoide no tiene retculo endoplasmtico (1;2) es
probable que los lpidos se sinteticen durante las espermatognesis y slo
puedan sufrir modificaciones. Existe una gran batera de enzimas quinasas y
fosfatasas que actan sobre los grupos OH del inositol de estos fosfolpidos
(168;169). Si bien la molcula de inositol en teora podra fosforilarse en
cualquier posicin, en los fosfoinostidos slo se ha visto fosforilaciones en las
posiciones 3, 4 y 5 dando lugar a diferentes ismeros. En la Figura 28 A se
esquematiza la molcula de inositol y las posiciones de los OH que
eventualmente pueden fosforilarse (170). En la Figura 28 B se esquematizan
las modificaciones que sufren los fosfoinostidos descritas en otros tipos
celulares.
En esta parte de la tesis nos vamos a centrar en el rol de fosfatidilinositol
4,5-bifosfato (PI(4,5)P2) durante la exocitosis acrosomal. Este fosfolpido
puede producir dos segundos mensajeros al ser hidrolizado por PLC: DAG e

76

IP3 (168). Pero tambin puede actuar como segundo mensajero per se o incluso
fosforilarse y producir fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato PI(3,4,5)P3 que dispara
A

PI(3)P

PI(3,4)P2

PI(3,4,5)P3
PI3K
3-Pasa

PI

PI4K

PI(4)P

PI5K

PI(4,5)P2

5-Pasa

PI(3,5)P2

DAG
PLC

PI4K
4-Pasa

PI(5)P

IP3

Figura 28 Esquema de la molcula de inositol y de las vas de sealizacin por fosfoinostidos. A) Se

esquematiza una molcula de inositol con las posiciones de los OH. En los fosfoinostidos el inositol se
encuentra unido a un fosfolpidos por medio de un enlace fosfodiester en la posicin 1. Figura tomada de
Azevedo et al 2006, (referencia 170) B) Vas de fosforilacin y desfosforilacin de fosfoinostidos
encontradas en clulas. Slo pueden fosforilarse en las posiciones 3, 4 y 5. Figura tomada de Toker et al
1998, (referencia 168).

otras vas de sealizacin. PI(4,5)P2 est involucrado en numerosos procesos

biolgicos, como el funcionamiento de canales inicos (171), la organizacin
del citosqueleto (168;172;173), endocitosis (172) y exocitosis (174;175).
Existen numerosos dominios proteicos que se unen a lpidos (145). En el
caso de la unin a PI(4,5)P2 se han descrito dos clases de dominios que se
unen especficamente, PH y dominios polibsicos ricos en R y K
(145;168;176). Existen 4 clases de dominios PH que tienen afinidad por
distintos fosfoinostidos. Los dominios PH de clase I se unen con alta

77

especificidad a fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PI(3,4,5)P3); los de clase II

tienen afinidad por fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PI(4,5)P2) y por
fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PI(3,4,5)P3) in vitro, aunque in vivo slo se
unen a PI(4,5)P2. Los dominios PH de clase III tienen alta afinidad por el
fosfato en la posiscin 3 y se unen tanto a fosfatildilinositol 3,4-bifosfato
(PI(3,4)P2) como a PI(3,4,5)P3, mientras que los de clase IV tienen baja
afinidad y especificidad por los fosfoinostidos y slo se unen a ellos de
manera inespecfica. A pesar de la variedad de ismeros de fosfoinostidos
dependientes de las posiciones fosforiladas (Figura 28 B) en adelante para
simplificar slo voy a especificar el nmero de fosfatos y no la posicin.
Siempre que hable de PIP2 estar refirindome a PI(4,5)P2. Otros dominios
proteicos tambin pueden unirse a fosfoinostidos, uno de ellos es C2 que se
unen inespecficamente a lpidos con carga negativa, entre los que se
encuentran los fosfoinostidos (la referencia (145) describe dominios de unin
a membranas). Cuando se producen estos lpidos se reclutan a membrana
protenas que contienen estos dominios y disparan cascadas de sealizacin.
Entre las protenas efectoras de PIP2 podemos encontrar a PLD1 y
PLD2, GTPasas monomricas de las familias de Rho, Rac y Arf y sus
protenas reguladoras (177;178). PLD hidroliza PC para producir PA y colina.
Las pequeas GTPasas monomricas o sus protenas efectoras al igual que PA
activan una quinasa que fosforila fosfatidilinositol 4-fosfato (PI(4)P o PIP) en
la posicin 5 (fosfatidilinositol 4-fosfato 5-quinasa, PI(4)P5K) para producir
PIP2. Esto indica que PIP2 dispara una cascada de retroalimentacin positiva
en la que participan pequeas GTPasas monomricas, PLD y PI(4)P5K
(177;178). Esta va se encuentra esquematizada en la Figura 29.
Est descrito que las enzimas PLD1 y PLD2 poseen varios dominios
conservados (179-181). En el extremo N-terminal poseen un dominio PX y
un dominio PH, ambos tienen afinidad por fosfoinostidos. El dominio PX

78

Figura 29 Esquema de la cascada de retroalimentacin positiva disparada por PIP2.

tiene afinidad por fosfatidilinositol 5-fosfato (PI(5)P) mientras que el dominio

PH tiene afinidad por PIP2 (182). Tambin tienen cuatro motivos conservados
que forman el sitio cataltico. Entre los motivos II y III PLD1 presenta un
loop con un dominio polibsico que constituye otro sitio de interaccin con
PIP2. Tanto PLD1 como PLD2 presentan dos sitios de interaccin con
PKC, uno en el extremo N-terminal y otro en el extremo C-terminal. En la
Figura 30 se muestra un esquema de los dominios de PLD1 y PLD2 y sus
sitios de regulacin (183). Se sabe que PKC es activador alostrico de PLD1
y PLD2. Hay publicaciones que afirman que la activacin es independiente de
fosforilacin (179-181), mientras que otros autores sostienen que es necesaria
la fosforilacin de PLD (184). En mastocitos se ha reportado que la actividad
de PLD es necesaria para la translocacin y activacin de varias isoformas de
PKC cuando las clulas estn expuestas a estmulos fisiolgicos, mientras que

Figura 30 Esquema de los dominios proteicos de PLD1 y PLD2. Los motivos proteicos conservados
se representan como una caja. Los dominios PX y PH le permiten unirse a membranas en respuesta a
fosfoinostidos. PLD1 presenta un sitio adicional de unin a PIP2 ubicado dentro del dominio cataltico.
Los sitios de unin a PKC se representan con una lnea. Figura tomada de Cockcroft S 2001 (referencia
183) y modificada.

79

cuando se estimulan con PMA la regulacin es inversa (185). PKC, al igual

que otras PKC, contiene un dominio C1 que se une a membrana en presencia
de DAG y un dominio C2 que se une a membranas en respuesta a Ca2+ (181).
DAG se puede producir a partir de la hidrlisis de fosfoinostidos mediada
por PLC, por hidrlisis de PC o por desfosforilacin de PA. Todas estas vas
que llevan a un aumento de DAG activan PKC y pueden llegar a activar
PLD. Esto nos indica que las vas de sealizacin dependientes de PIP2 y de
DAG, uno de los productos de su hidrlisis, estn ntimamente relacionadas.
Si queremos caracterizar las vas de sealizacin dependientes de lpidos
en la reaccin acrosomal no podemos pasar por alto el rol de DAG y de PKC.
Est descrito que los steres de forbol como PMA pueden disparar la reaccin
acrosomal en espermatozoides vivos (186) y que DAG aumenta por medio de
varios estmulos (111-113), pero todava no hay un consenso sobre cmo
acta. La manera en que estimula podra deberse a la activacin de alguna
isoforma de PKC o munc-13, debido a que poseen dominios C1. Sin embargo
no est caracterizado el mecanismo.
Para abordar este problema utilizamos el modelo de espermatozoides
permeabilizados. Si DAG o PMA pueden disparar la reaccin acrosomal en
estas condiciones nos indica que el mecanismo por el que actan no depende
del ingreso de Ca2+ extracelular, ya que el medio en el que se encuentran los
espermatozoides (HB-EGTA) no contiene Ca2+. Por otro lado demuestra que
el espermatozoide permeabilizado es un modelo vlido para estudiar su
funcin. En la Figura 31 se trataron espermatozoides permeabilizados con
PMA o con DAG. Como puede observarse ambos disparan la reaccin
acrosomal (Figura 31, PMA y DAG) y tienen este efecto an en presencia de
agentes quelantes de Ca2+ (datos no mostrados). Esto nos indica que el
mecanismo por el cual DAG dispara la reaccin acrosomal no depende de que
se produzca un aumento masivo de Ca2+ citoslico.

80

Est reportado que el ingreso de Ca2+ extracelular produce un aumento

de DAG (113). Adems en espermatozoides permeabilizados hemos
observado que se produce una salida de Ca2+ acrosomal dependiente de IP3
(19), lo que nos lleva a pensar que se est produciendo DAG tambin.
Tenemos evidencias de que PKC tiene un rol inhibitorio sobre sinaptotagmina
VI y que su desfosforilacin permite que se complete la fusin de membranas
despus de la salida de Ca2+ acrosomal (125). Ahora bien nos preguntamos si
PKC podra ser el efector de DAG en la exocitosis acrosomal. Para estudiar
su funcin utilizamos dos inhibidores generales de la actividad cataltica de
PKC, queleritrina y Ro-31-7549. Los inhibidores bloquearon eficientemente la
reaccin acrosomal disparada por PMA (Figura 31, Chel PMA y Ro
PMA). Como Ca2+ tambin puede regular a PKC a travs de su dominio C2
supusimos que tanto Ca2+ como DAG podran llevar a la activacin de PKC,
aunque no podemos determinar si se trata de la misma va o de vas
independientes. Como puede observarse los inhibidores de PKC bloquearon
tambin la reaccin acrosomal disparada por Ca2+ (Figura 31, Chel Ca2+ y

control
calcio
PMA

DAG

Chel Ca2+

Ro Ca2+

Chel PMA

Ro PMA
-20

b
0

20

40

60

80

100

% reaccin acrosomal relativa

Figura 31 Tanto DAG como Ca2+ disparan la reaccin acrosomal por una va dependiente de PKC.
Donde indica la Figura se trataron espermatozoides con queleritrina 10 M (Chel) o Ro-31-7549 10
M (Ro) durante 15 minutos a 37 C. Luego se estimul la reaccin acrosomal con Ca2+ 10 M, DAG
10 M o PMA 200 nM durante 15 minutos adicionales. Las barras de error representan el error
standard de la media (SEM). Las medias de los grupos que llevan la misma letra no difieren
significativamente (p>0,05) entre s de acuerdo al test de Tukey-Kramer.

81

Ro Ca2+). Todos estos resultados nos indican que PKC es fundamental para
la exocitosis acrosomal y tanto Ca2+ como DAG producen su activacin.
Se ha descrito que PKC interacta tanto con PLD1 (180;181) como
con PLD2 (179). Debido a que PLD1 est asociada a procesos de exocitosis
(187) mientras que PLD2 est asociada a endocitosis (188;189) pensamos que
PLD1 podra estar involucrada en la reaccin acrosomal. Es controversial el
rol de PLD en el espermatozoide. Hay publicaciones que sugieren que acta
en la capacitacin (67). Algunos sostienen que es necesaria para la reaccin
acrosomal (115), mientras que otros aseguran que no tiene una funcin
importante en el espermatozoide (190).
Para determinar si PLD tiene alguna funcin en la reaccin acrosomal
realizamos ensayos funcionales utilizando inhibidores. En primera instancia
utilizamos 1-butanol para inhibir PLD. PLD produce transfosforilacin en
presencia de alcoholes primarios, por lo que en presencia de 1-butanol se
produce fosfatidilbutanol en lugar de PA. Como puede observarse en la
Figura 31 1-butanol inhibe tanto la reaccin acrosomal disparada por Ca2+
(Figura 32 A, butanol Ca2+) como por PMA (Figura 32 B, butanol
PMA). Como 1-butanol puede tener otros efectos inespecficos en la clula
realizamos un control para ver si PA revierte la inhibicin de la reaccin
acrosomal producida por 1-butanol. Como puede observarse PA revirti la
inhibicin (Figura 32 A, butanol PA + Ca2+; Figura 32 B, butanol PA
+ PMA). Esto nos indica que PLD est involucrada en la reaccin acrosomal
disparada por Ca2+ y por PMA. Para determinar si el efecto se debe a PLD1, la
isoforma de PLD asociada a exocitosis, utilizamos un anticuerpo especfico
anti-PLD1 para determinar si se requiere durante la exocitosis acrosomal. El
anticuerpo inhibi tanto la reaccin acrosomal disparada por Ca2+ (Figura 32
A, anti-PLD1 Ca2+) como por PMA (Figura 32 B, anti-PLD1 PMA) y
PA revirti la inhibicin (Figura 32 A, anti-PLD1 PA + Ca2+; Figura 32
B, anti-PLD1 PA + PMA). Si bien este experimento no descarta la
82

posibilidad de que PLD2 est implicada en alguna va de sealizacin de la

exocitosis acrosomal, s nos indica que PLD1 es necesaria. Para ver si el efecto
inhibitorio depende directamente de PA utilizamos un dominio de unin a PA
(PABD: phosphatidic acid binding domain). Este dominio es un pptido de
19 aminocidos proveniente de la protena Spo20p, una SNARE de levadura
(187;191). Como los dominios pequeos suelen presentar problemas para
adquirir la conformacin adecuada lo utilizamos unido a GST. Como puede
observarse PABD inhibi la reaccin acrosomal disparada por Ca2+ (Figura
32 A, PABD Ca2+) y por PMA (Figura 32 B, PABD PMA) y PA la
A
control
Ca2+
butanol + Ca2+

***

butanol PA + Ca2+
anti-PLD1 Ca2+

***

anti-PLD1 PA + Ca2+
PABD Ca2+

***

PABD PA + Ca2+
-20

20

40

60

80

100

120

% reaccin acrosomal relativa

B
control
Ca2+

ns

PMA
butanol PMA

butanol PA + PMA

ns

anti-PLD1 PMA

anti-PLD1 PA + PMA

ns

PABD PMA

PABD PA + PMA
-50

s
0

50

100

150

***

200

% reaccin acrosomal relativa

Figura 32 PLD1 es necesaria para que se produzca la reaccin acrosomal. A) Se trataron

espermatozoides permeabilizados con 1-butanol 0,5%, anti-PLD1 20 g/ml o PABD 10 g/ml durante 15
minutos a 37C. Luego se trataron con Ca2+ 10 M o con PA 10 M + Ca2+ 10 M durante 15 minutos
ms. B) Se trataron o no espermatozoides permeabilizados con 1-butanol 0,5%, anti-PLD1 20 g/ml o
PABD 10 g/ml durante 15 minutos a 37C. Luego se estimul con PMA 200 nM o con PA 10 M +
PMA 200 nM durante 15 minutos ms. Las barras de error representan el error standard de la media (SEM).
En A) se realiz test de Tukey-Kramer para comparar las medias entre s, ***: p <0,001. En B) se realiz
test de Dunnet para comparar todas las medias con respecto a PMA, ns: p>0,05; s: p<0,05. Las ltimas dos
medias se compararon entre s por test de Student apareado, ***: p. <0,001.

83

revirti (Figura 32 A, PABD PA + Ca2+; Figura 32 B, PABD PA +

PMA). Como control se utiliz la protena GST sin el pptido y no se
produjo inhibicin de la reaccin acrosomal (datos no mostrados).
Si bien los ensayos funcionales sugieren que PLD1 est presente en
espermatozoides humanos quisimos determinar su presencia y localizacin.
Realizamos inmunofluorescencia indirecta utilizando un anticuerpo especfico
anti-PLD1. Como puede observarse en la Figura 33 PLD1 est presente en
espermatozoides humanos y se localiza principalmente en la regin acrosomal.

Figura 33 PLD1 est presente en espermatozoides humanos y se encuentra principalmente en la regin

acrosomal. Se realiz inmunofluorescencia indirecta utilizando un anticuerpo anti-PLD1 y un anticuerpo
secundario marcado con Alexa Fluor 546.

Todos estos datos nos indican que PLD1 se activa durante la exocitosis
acrosomal. Cuando PLD1 se activa transloca desde el citosol a la membrana
plasmtica donde interacta con su sustrato. Para comprobar que PLD1 se
activa cuando se estimula la reaccin acrosomal extrajimos membranas de
espermatozoides no permeabilizados en condiciones control o estimulados

84

con el ionforo de Ca2+ A23187 o PMA. Para evitar que estos

espermatozoides pierdan membranas al producirse la reaccin acrosomal por
el estmulo, se trataron previamente con 2-APB. Se realiz Western Blot antisinaptotagmina VI como control de carga (datos no mostrados). Como puede
observarse en la Figura 34, tanto la estimulacin con A23187 como con PMA

PLD1

A23187

PMA

control

producen un aumento de la asociacin de PLD1 a membranas.

Figura 34 Ca2+ y PMA promueven la activacin de

PLD1. Se trataron espermatozoides no permeabilizados
con 2-APB 100 M durante 15 minutos a 37C. Luego
se estimul con A23187 10 M o con PMA 200 nM. El
control se incub 15 minutos sin estmulo. Se extrajeron
las membranas como est explicado en Materiales y
Mtodos. Se resuspendieron en sample buffer, se realiz
electroforesis en gel de poliacrilamida y Western Blot
anti-PLD1.

Ahora que ya habamos visto que tanto PKC como PLD1 son necesarias
para la reaccin acrosomal. A pesar de que la bibliografa reporta interaccin
entre estas protenas, no hemos determinado si forman parte de una misma
va. Como ya se discuti, hay reportes que indican que PKC activa a PLD1
(180;181), mientras que otros afirman que es al revs (185). Adems podra
ocurrir que los estmulos fisiolgicos o Ca2+ activaran estas enzimas en
distinto orden como sucede en mastocitos (185) o incluso de manera
independiente. Para ver qu relacin exista entre PLD1 y PKC utilizamos
inhibidores de PKC y tratamos de rescatar la exocitosis acrosomal en
presencia de PA. La Figura 35 A esquematiza el modelo de trabajo. Como
puede observarse en la Figura 35 B, PA rescata la inhibicin de PKC tanto

85

cuando se inhibe con queleritrina (Figura 35 B, Chel Ca2+ y Chel PMA,

comparar con Chel PA + Ca2+ y Chel PA + PMA) como con Ro-317549 (Figura 35 B, Ro Ca2+ y Ro PMA comparar con Ro PA +
Ca2+ y Ro PA + PMA). Como PA rescat la inhibicin de PKC
concluimos que PLD1 se activa por una va dependiente de PKC. El hecho de
que se produzca la misma regulacin cuando estimulamos con Ca2+ como con
PMA nos indica que ambos son parte de la misma va de sealizacin.
A

B
control
Ca2+
PMA
Chel Ca2+
Chel PA + Ca2+
Ro Ca2+
Ro PA + Ca2+
Chel PMA
Chel PA + PMA
Ro PMA
Ro PA + PMA
-20

**
*
**
**
0

20

40

60

80

100

% reaccin acrosomal relativa

Figura 35 PLD se activa despus de PKC en la cascada de sealizacin que conduce a la reaccin
acrosomal. A) Esquema del diseo experimental. Se inhibi la reaccin acrosomal disparada por Ca2+ o
por PMA utilizando inhibidores de PKC. Si la va es en realidad como est planteada debera rescatarse la
estimulacin de la reaccin acrosomal en presencia de PA. B) Se incubaron espermatozoides
permeabilizados sin inhibidor o en presencia de queleritrina 10 M o Ro-31-7549 10 M durante 15
minutos a 37C. Luego se estimul con Ca2+ 10 M o con PMA 200 nM durante 15 minutos ms; o
alternativamente con Ca2+ 10 M + PA 10 M o PMA 200 nM + PA 10 M. Las barras de error
representan el error standard de la media (SEM). Los valores de las medias se compararon mediante el
test de Tukey-Kramer. *: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001.

Como ya se mencion PLD1 y PIP2 estn ntimamente relacionados y

forman parte de una cascada de sealizacin que lleva al aumento y/o al
mantenimiento de PIP2 en las membranas en otros tipos celulares. Esto nos
86

llev a pensar que PIP2 podra ser parte de la cascada de sealizacin que
estbamos estudiando. Para determinar si PIP2 era necesario en las vas de
sealizacin disparadas por Ca2+ o por DAG o PMA se utiliz el dominio PH
de PLC4 (PLC4-PH), que es un dominio PH de clase II y une
especficamente PIP2, para capturar el lpido y ver si se inhiba la reaccin
acrosomal disparada por Ca2+ o por PMA. Tambin se utiliz un anticuerpo
especfico anti-PIP2. Como ambos inhibieron la reaccin acrosomal disparada
por Ca2+ (Figura 36, PLC4-PH Ca2+ y anti-PIP2 Ca2+) y por DAG
(Figura 36, anti-PIP2 DAG) o PMA (Figura 36, PLC4-PH PMA)
podemos concluir que PIP2 tiene un papel importante en la exocitosis
acrosomal. Para asegurarnos que la inhibicin era especfica, incubamos con
PIP2 durante la estimulacin con Ca2+ o con DAG o PMA. Como PIP2
revierte la inhibicin tanto de PLC4-PH (Figura 36, PLC4-PH PIP2 +
Ca2+ y PLC4-PH PIP2 + PMA) como de anti-PIP2 (Figura 36, anti-PIP2
PIP2 + Ca2+ y anti-PIP2 PIP2 + DAG) podemos concluir que la
inhibicin fue especfica.
control
Ca2+
PMA
anti-PIP2Ca2+
anti-PIP2PIP2 + Ca2+
anti-PIP2DAG
anti-PIP2PIP2 + DAG
PLC4-PHCa2+
PLC4-PHPIP2 + Ca2+
PLC4-PHPMA
PLC4-PHPIP2 + PMA

***
***
***
*
0

20

40

60

80

100

120

% reaccin acrosomal relativa

Figura 36 PIP2 es necesario en la va de transduccin de seales disparada por Ca2+ y por DAG
durante la exocitosis acrosomal. Se incubaron espermatozoides permeabilizados sin inhibidores o en
presencia de PLC4-PH 20 g/ml o anti-PIP2 10 g/ml. Luego se estimul con Ca2+ 10 M, DAG 10
M o PMA 200 nM durante 15 minutos ms. En otras condiciones se estimul con Ca2+ 10 M + PIP2 1
M, DAG 10 M + PIP2 1 M o PMA 200 nM + PIP2 1 M. Las barras de error corresponden al error
standard de la media (SEM). Las medias se compararon mediante test de Tukey-Kramer, *: p<0,05; ***:
p<0,001.

87

Hasta ahora todo parece indicar que existe un accin concertada de PKC
y PLD1 que finalmente lleva a que se produzca un aumento de PIP2. Si esto es
as deberamos poder rescatar la inhibicin de PKC y de PLD1 agregando
PIP2 durante la estimulacin (Figura 37 A). Como puede observarse en la
Figura 37 B PIP2 fue capaz de rescatar la inhibicin de PKC (Chel PIP2 +
Ca2+ y Ro PIP2 + Ca2+), de PLD1 (butanol PIP2 + Ca2+ y anti-PLD1
PIP2 + Ca2+) y el secuestro de PA (PABD PIP2 + Ca2+) cuando se estimul
la reaccin acrosomal con Ca2+. En la Figura 37 C se puede observar que
PIP2 rescat la inhibicin de PKC (Chel PIP2 + PMA y Ro PIP2 +
PMA), PLD (butanol PIP2 + PMA y anti-PLD1 PIP2 + PMA) y el
secuestro de PA (PABD PIP2 + PMA) cuando se estimul con PMA. Esto
nos permite concluir que PKC y PLD1 de alguna manera producen un
aumento de PIP2 durante la exocitosis acrosomal.
Todos los ensayos funcionales nos indicaban que durante la estimulacin
de la reaccin acrosomal se produce un aumento de PIP2. Para demostrar su
incremento marcamos los fosfolpidos con 32P durante la exocitosis acrosomal
para luego visualizarlos por cromatografa en capa delgada.
Utilizamos espermatozoides permeabilizados, inhibimos primero PLC
con U73122 para evitar la hidrlisis de PIP2 y luego estimulamos con Ca2+,
PMA o PA en presencia de ATP32P. Si ocurrieran fosforilaciones en los
fosfolpidos durante la estimulacin deberan marcarse con

32

P. Luego

extrajimos los lpidos neutros y realizamos cromatografa en capa delgada.

Para visualizar los lpidos marcados con 32P expusimos una placa fotogrfica
con la cromatografa en capa delgada y luego determinamos a qu
fosfoinostido corresponde cada mancha de acuerdo al grado de avance.
Como observamos en la Figura 38, la estimulacin con PMA o con PA
produjo un aumento de PIP2 y PIP3. Por otro lado Ca2+ no provoc un
incremento significativo de PIP2 pero s de PIP3.

88

B
control
Ca2+
Chel Ca2+
Chel PIP2 + Ca2+
Ro Ca2+
Ro PIP2 + Ca2+
butan-1-ol Ca2+
butan-1-ol PIP2 + Ca2+
anti-PLD1 Ca2+
anti-PLD1 PIP2 + Ca2+
PABD Ca2+
PABD PIP2 + Ca2+
-20

***
**
**
**
***
0

20

40

60

80

100

120

% reaccin acrosomal relativa

control
Ca2+
PMA
Chel PMA
Chel PIP2 + PMA
Ro PMA
Ro PIP2 + PMA
butanol PMA
butanol PIP2 + PMA
anti-PLD1 PMA
anti-PLD1 PIP2 + PMA
PABD PMA
PABD PIP2 + PMA

ns

ns
s
ns
s
ns
s
ns
s
ns
0

20

40

60

80

100

120

% reaccin acrosomal relativa

Figura 37 PIP2 tiene una funcin posterior a PKC, PLD1 y PA en la cascada de sealizacin que dispara
la reaccin acrosomal. A) Esquema del diseo experimental. Se inhibe PKC, PLD1 o se secuestra PA y
luego se estimula en presencia de PIP2. Si se produce estimulacin de la reaccin acrosomal es porque PKC,
PLD1 y PA son necesarios para la produccin de PIP2. B) Se incubaron espermatozoides permeabilizados
en ausencia de inhibidores o en presencia de queleritrina 10 M, Ro-31-7549 10 M, butan-1-ol 0,005%,
anti-PLD1 20 g/ml o PABD 10 g/ml durante 15 minutos a 37C. Luego se estimul con Ca2+ 10 M
durante 15 minutos ms o con Ca2+ 10 M + PIP2 1 M. C) Se incub con los inhibidores de la misma
manera que en B. Luego se estimul con PMA 200 nM durante 15 minutos a 37C o alternativamente con
PMA 200 nM + PIP2 1 M. Las barras de error corresponden al error standard de la media (SEM). En B
las medias se compararon mediante test de Tukey-Kramer, **: p<0,01; ***p<0,001. En C las medias se
compararon con respecto al estmulo con PMA por medio del test de Dunnet, ns: p>0,05; s: p<0,05.

89

PIP2
PIP3

intensidad relativa

1,5

0,5

0
n
co

l
t ro

2+

Ca

PM

PA

Figura 38 La estimulacin con Ca2+, PMA y PA

producen un aumento de PIP2 y PIP3 en espermatozoides
permeabilizados. A) Se trataron espermatozoides
permeabilizados con U73122 15 M durante 15 minutos a
37C. Luego se aadieron 0,075 Ci de ATP32P y se
estimul con Ca2+ equilibrado a 10 M, PMA 200 nM o
PA 10 M durante 15 minutos ms. Luego se extrajeron
los fosfolpidos neutros y se realiz cromatografa en capa
fina. Se determin a qu fosfolpido corresponde cada
mancha de acuerdo al grado de avance. B) Se cuantific la
intensidad de marca de tres experimentos separados. Los
valores se normalizaron con respecto al control. Las barras
de error corresponden al error standard (SEM).

PIP2

PA

PMA

Ca2+

Control

PIP3

Estos resultados nos llevaron a plantearnos qu funcin lleva a cabo PIP2

adems de su propia sntesis. Como mencion previamente PIP2 es sustrato de
PLC y tras su hidrlisis produce dos segundos mensajeros, DAG e IP3. La
pregunta que nos hicimos fue si PIP2 ejerca su efecto a travs de alguno de
estos segundos mensajeros. En nuestro laboratorio hemos demostrado que
para que se complete la fusin de membranas durante la exocitosis acrosomal
hace falta que ocurra una salida de Ca2+ acrosomal posterior a la apertura de
los SOCCS que no es sustituble por el Ca2+ citoslico (19;123;126). En este
contexto cabe plantearse que PIP2 puede ser necesario para producir IP3 y
permitir la salida de Ca2+ acrosomal. De ser as utilizando un anlogo de IP3,
adenofostina, deberamos poder rescatar la inhibicin de cualquiera de las

90

etapas anteriores. En cambio, si adenofostina no pudiera rescatar esta

inhibicin significa o bien que estas enzimas no son parte de la va que lleva a
la salida de Ca2+ acrosomal, o que tienen alguna otra funcin en la cascada de
transduccin de seales que lleva a la exocitosis acrosomal. En la Figura 39 A
se esquematiza el diseo de este experimento.
A

B
control
Ca2+
Chel Ca2+
Chel Ad + Ca2+
Ro Ca2+
Ro Ad + Ca2+
PABD Ca2+
PABD Ad + Ca2+
PLC4-PH Ca2+
PLC4-PH Ad + Ca2+
anti-PIP2 Ca2+
anti-PIP2 Ad + Ca2+

**
**
*
*
***

Figura 39 La salida de Ca2+ acrosomal rescata la inhibicin de las etapas anteriores. A) Esquema del diseo
experimental para ver si el rol del aumento de PIP2 es la produccin de IP3. Si se utiliza inhibidores de PKC o
protenas que secuestran PA o PIP2 y luego se estimula con Ca2+ en presencia de adenofostina debera
recuperarse la reaccin acrosomal. B) Se incubaron espermatozoides permeabilizados en ausencia de
inhibidores o en presencia de queleritrina 10 M, Ro-31-7549 10 M, PABD 10 g/ml, PLC4-PH 20 g/ml
o anti-PIP2 10 g/ml durante 15 minutos a 37C. Luego se estimul con Ca2+ equilibrado a 10 M o bien con
Ca2+ equilibrado 10 M + adenofostina 5 M durante 15 minutos ms. Las barras de error corresponden al
error standard de la media (SEM). Las medias se compararon entre s por medio del test de Tuckey-Kramer,
*: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001.

91

Como puede observarse en la Figura 39 B adenofostina rescata la

inhibicin de PKC (Chel Ad + Ca2+ y Ro Ad + Ca2+) y el secuestro de
PA (PABD Ad + Ca2+) y de PIP2 (PLC4-PH Ad + Ca2+ y anti-PIP2
Ad + Ca2+). Esto nos indica que la funcin biolgica del aumento de PIP2
durante la reaccin acrosomal principalmente es la produccin de IP3 para que
se produzca la salida de Ca2+ acrosomal.
Todos estos resultados nos llevan a plantear un modelo sobre esta va de
sealizacin en espermatozoides. En la Figura 40 se esquematiza este
modelo. Al estimularse la reaccin acrosomal se activa PLC y se produce
DAG. DAG activa PKC a travs de su dominio C1. PKC interacta con
PLD1 activndola. PLD1 produce PA y colina al hidrolizar PC. PA activa
PI4P5K que fosforila PIP en la posicin 5. PIP2 ahora puede activar a PLD1 y
a GTPasas monomricas. Tenemos evidencias de que Arf6 est implicada en
esta va (trabajo en preparacin). Dados nuestros resultados preliminares
consideramos que Arf6 podra estar estimulando PLD1 y PI4P5K. As se
produce un ciclo de retroalimentacin positiva que lleva a un aumento
sostenido de PIP2. Cuando PLC hidroliza PIP2 se produce DAG que tambin
puede retroalimentar positivamente este ciclo pero adems aumenta la

Figura 40 Esquema del rol de los lpidos en la reaccin acrosomal. DAG activa PKC que a su vez activa
PLD1. PLD1 produce PA y colina. PA activa PI4P5K que fosforila PIP en la posicin 5 para producir PIP2.
PIP2 puede a su vez activar PLD1 y Arf6. Arf6 tambin puede regular PI4P5K por lo que tambin favorece
un aumento de PIP2. La activacin de PLC hidroliza PIP2 y produce un aumentos de IP3 finalmente abre los
canales de Ca2+ del acrosoma y se completa la fusin de membranas.

92

concentracin de IP3 que finalmente desencadena la salida de Ca2+ acrosomal

necesaria para que se produzca la fusin de membranas.

93

DISCUSIN

94

Aporte original de la tesis

En esta tesis investigamos varios aspectos del proceso de exocitosis
acrosomal del espermatozoide humano. En esta seccin tratar de integrar los
resultados con el modelo general de reaccin acrosomal y proponer un nuevo
modelo que abarque ms aspectos del proceso, aunque algunos puntos no
estn basados en datos experimentales.
Uno de los objetivos en los que trabaj en esta tesis fue caracterizar el rol
de colesterol en la reaccin acrosomal. Hay mucha controversia alrededor de
la existencia de microdominios ricos en colesterol en membranas.
Principalmente se deben a que son muy difciles de ver y, si bien hay modelos
biofsicos y bioqumicos que respaldan su existencia, los mtodos son
indirectos y tienen sus limitaciones. Los modelos biofsicos, basados en
monocapas y liposomas formados por pocos lpidos, carecen de la
complejidad de las membranas biolgicas (144;192), aunque en los ltimos
aos se han publicado trabajos con liposomas gigantes hechos con
membranas de clulas donde se ha observado la coexistencia de fases
(142;193). Los datos obtenidos de modelos bioqumicos se basan
principalmente en la extraccin de la fraccin de membrana resistente a la
solubilizacin con Triton X-100. Estas tcnicas introducen muchas variables
no fisiolgicas a las membranas, pero nos pueden dar una idea sobre la
afinidad de las protenas por una u otra fase (las referencias (144;192) resumen
lo que se sabe hasta el momento sobre los microdominios de membrana ricos
en colesterol). A pesar de las limitaciones de cada enfoque en el estudio de los
microdominios, tanto los modelos biofsicos como los modelos bioqumicos
se usan ampliamente en el estudio de las propiedades de las membranas
biolgicas. En los ltimos aos las tcnicas de microscopa han avanzado
notablemente y ahora es posible contar con diversas tcnicas que permiten
95

estudiar mejor los dominios y microdominios de membrana en condiciones

ms cercanas a las fisiolgicas (29;32;193;194).
En este trabajo no estudiamos de manera directa la presencia de
microdominios sino que estudiamos el efecto del aumento o la disminucin de
colesterol en la membrana sobre la reaccin acrosomal, un proceso biolgico.
El efecto principal que observamos fue que la cantidad de colesterol de la
membrana afecta la capacidad de los espermatozoides de reaccionar frente a
un estmulo que dispara la reaccin acrosomal. Cuando se pierde colesterol de
la membrana aumenta el porcentaje de clulas que reaccionan (147), mientras
que cuando aumenta el colesterol en la membrana disminuye el porcentaje de
clulas que reaccionan. Lo ms notable que observamos fue que la
disminucin de la concentracin de colesterol produce un aumento en el
anclaje de Rab3A a membranas (152), una protena involucrada en el
reclutamiento de protenas efectoras que disparan el ensamblaje del complejo
SNARE y la fusin de membranas.
Hay numerosas publicaciones que indican que las protenas SNAREs se
encuentran en microdominios ricos en colesterol (195;196). Se ha descrito que
durante la capacitacin se produce una redistribucin de colesterol hacia la
parte apical de la membrana formando un dominio rico en colesterol (66). Las
protenas SNAREs tambin se redistribuyen de la misma manera durante la
capacitacin (149). La protena Rab3A, al tener una cola de geranil-geranilo
queda excluida de los microdominios ricos en colesterol. Es de vital
importacia que todas las protenas necesarias para la fusin se encuentren en
el mismo lugar de la membrana para que se complete el proceso. El hecho de
que la prdida de colesterol favorezca el anclaje de Rab3A y defina su
localizacin junto a las protenas SNAREs concuerda con esto. Todos estos
datos nos indican que colesterol regula de manera directa la maquinaria de
fusin de membranas y que ese puede ser su rol principal durante la
capacitacin.

96

Otro tema en que se trabaj fue en desarrollar un mtodo que nos

permitiera utilizar protenas en espermatozoides no permeabilizados. La
estrategia que elegida fue producir protenas recombinantes unidas un pptido
rico en arginina para que puedan atravesar la membrana plasmtica e ingresar
a la clula. Existe mucha bibliografa sobre los pptidos ricos en arginina y su
mecanismo de ingreso a las clulas (150;153;154;156;157;197). Si bien en un
primer momento se postul que ingresaban a travs de la membrana por un
mecanismo independiente de endocitosis, de caveloas y de ATP, luego se vio
que muchos de estos resultados se deban a un artificio generado por el
proceso de fijacin de las clulas (158). En trabajos posteriores, llevados a
cabo con ms precaucin en cuanto al diseo experimental, se vio que si bien
no poda descartarse que hubiera transporte de estos pptidos a travs de la
membrana plasmtica, la principal va de ingreso a las clulas era por
macropinocitosis o por endocitosis y que se translocaban al citosol a partir de
los endosomas (159;166). A pesar de toda la controversia alrededor del
mecanismo de internalizacin de los pptidos ricos en arginina hay numerosos
trabajos que los utilizan para transportar protenas al citoplasma de las clulas
y estudiar su efecto biolgico (198;199).
En el caso del espermatozoide resulta un desafo trabajar con protenas
permeables, ya que se trata de una clula en la que no est descrito que haya
endocitosis ni macropinocitosis. Esto significa que si no hay transporte a
travs de la membrana no se van a internalizar las protenas. Para demostrar
que las protenas unidas a pptidos ricos en arginina realmente se internalizan
en espermatozoides llevamos a cabo varios experimentos destinados a
descartar que se tratara de artificios. Todos estos experimentos nos
demostraron que efectivamente estas protenas ingresan al espermatozoide a
travs de la membrana y pueden utilizarse en experimentos con
espermatozoides no permeabilizados.

97

Utilizando esta metodologa caracterizamos la funcin de Rab3A en la

reaccin acrosomal. A travs de experimentos realizados en espermatozoides
permeabilizados sabamos que Rab3A era capaz de disparar la reaccin
acrosomal en ausencia de Ca2+, que actuaba antes de la salida de Ca2+
acrosomal y que era capaz de disparar la salida de Ca2+ acrosomal
(19;119;120). Si bien todo eso nos sugera que Rab3A se activaba despus de
la apertura de los SOCCs, nunca se haba demostrado en espermatozoides
vivos. Los experimentos en los que utilizamos agentes quelantes de Ca2+
extracelular e inhibidores de canales nos demuestran que Rab3A en efecto est
actuando despus de la apertura de los SOCCs. Adems pudimos demostrar
que Rab3A es parte de la va de sealizacin disparada por progesterona, ya
que R-Rab3A prenilada y cargada con GDPS inhibi la reaccin acrosomal
disparada por progesterona, algo que antes podamos suponer, pero que no
haba sido demostrado hasta el momento. Otro resultado interesante fue que
colesterol tambin regula la reaccin acrosomal cuando se dispara con RRab3A en espermatozoides no permeabilizados. Esto por un lado nos ayuda a
corroborar los resultados obtenidos en espermatozoides permeabilizados,
pero tambin nos indica que se pueden utilizar estas protenas para estudiar el
rol del Ca2+ extracelular (200).
En cuanto al rol de los lpidos como segundos mensajeros hemos
caracterizado una va que vincula DAG, PA y PIP2 con la va de sealizacin
que lleva a la salida de Ca2+ acrosomal. Es complejo caracterizar las vas
dependientes de lpidos, ya que generalmente los segundos mensajeros
lipdicos se producen de manera muy transitoria lo que hace difcil su
visualizacin (201). Si adems tenemos en cuenta que muchos de estos lpidos
estn en muy baja proporcin en la membrana del espermatozoide y que para
poder detectarlos hay que combinar tcnicas de muy alta sensibilidad con
grandes cantidades de muestra podemos ver que no se trata de una tarea
sencilla.

98

En este trabajo proponemos una va en la cual estn presentes varias

protenas y varios lpidos. En sntesis, DAG activa PKC que a su vez activa a
PLD1 que produce PA. PA junto con Arf6 activan PI4P5K que fosforila PIP
produciendo PIP2 que queda disponible para ser hidrolizado por PLC. Esta
va se puede retroalimentar positivamente, ya que PIP2 puede activar a PLD1
a travs de su dominio PH y adems cuando se hidroliza PIP2 se produce
DAG. No hemos determinado exactamente en qu momento se activa este
ciclo. Podra activarse cada vez que se produzca DAG y tratarse de una va
que permita a la clula mantener una concentracin de PIP2 suficiente para
producir IP3 o para cumplir con otras funciones biolgicas.
Integrando estos resultados con el modelo del laboratorio (Figura 11) y
algunos datos publicados en la bibliografa podramos proponer la exocitosis
acrosomal ocurre como se esquematiza en la Figura 41. ZP3 o progesterona
provocan la apertura de canales dependientes de voltaje. El ingreso de Ca2+
activa PLC4 que hidroliza PIP2 y produce DAG e IP3. DAG entre otros
efectos, causa la activacin de la va que lleva a un aumento de PIP2, mientras
que IP3 abre canales de Ca2+ del acrosoma lo que produce un aumento del
Ca2+ citoslico. La prdida de Ca2+ acrosomal lleva a la apertura de los SOCCs
y a la entrada masiva de Ca2+. La apertura de los SOCCs permite por un lado
que se vuelva a cargar de Ca2+ el acrosoma y por otro lado tambin activa las
vas de sealizacin que desencadenan el ensamblaje de las SNAREs y una
salida tarda de Ca2+ del acrosoma. En la va de sealizacin que lleva al
ensamblaje del complejo SNARE estn involucradas la protena Epac, Rim y
Rab3A, mientras que en la va que lleva a la salida de Ca2+ acrosomal actan
PLC y se activa la va de los lpidos que lleva al aumento de PIP2 y a la
produccin de IP3. En este punto es fundamental el efecto de la prdida de
colesterol durante la capacitacin. Slo en aquellos espermatozoides que
hayan completado el proceso de capacitacin y hayan perdido colesterol se va
a poder anclar Rab3A activada a la membrana y las protenas SNAREs estarn

99

en la localizacin adecuada como para que se desencadene la cascada que lleva

su ensamblaje. Lo que quiere decir que slo los espermatozoides que hayan
llegado a formar complejos SNAREs trans flojo van a completar la fusin de
membranas cuando se produzca la salida de Ca2+ del acrosoma y esos son los
que han perdido colesterol de la membrana. En el resto de los
espermatozoides me arriesgo a creer que se va a producir un ciclo futil de
mltiples salidas de Ca2+ del acrosoma, apertura de los canales SOCCs y
rellenado del acrosoma. Dado que el ciclo que lleva al aumento de PIP2 se
retroalimenta positivamente, es posible que se puedan repetir estas
movilizaciones de Ca2+ dependientes de IP3 hasta que se consuman todos los
fosfoinostidos de la membrana.

100

Figura 41 Esquema del proceso de reaccin acrosomal. Este esquema integra el modelo del laboratorio con los resultados obtenidos en esta tesis. La descripcin
detallada de este modelo figura en el texto. Las flechas llenas representan procesos directos. Las flechas punteadas representan procesos indirectos. El espiral representa el
ciclo que lleva a un aumento de PIP2. La lnea punteada cortada perpendicularmente representa regulacin.

101

Perspectivas

Esta tesis abre un abanico de posibilidades para seguir investigando los temas
aqu tratados. Con respecto al papel de colesterol en la regulacin de la
reaccin acrosomal, los resultados obtenidos son muy interesantes y abren
interrogantes que podran ser investigados. Uno es el rol del geranil-geranilo
en la regulacin por colesterol. El geranil-geranilo es un terpeno
polinsaturado, por lo que estructuralmente no debera tener afinidad por los
dominios ricos en colesterol y de hecho la prdida de colesterol de la
membrana produce un aumento del anclaje de Rab3A a membranas (152).
Sera interesante ver cmo est regulado el anclaje a membranas de protenas
con otros lpidos. Tambin se podra hacer mutagnesis dirigida sobre Rab3A
para cambiar el geranil-geranilo por otros lpidos de anclaje, como puede ser
farnesilo, miristoilo o palmitato, y ver si cambia su regulacin por colesterol.
Si la regulacin por colesterol de Rab3A cambiara el principal interrogante es
si en esas condiciones sera posible que se produzca la reaccin acrosomal, ya
que las protenas SNAREs tambin estn reguladas por colesterol.
Tambin sera interesante utilizar tcnicas de microscopa para visualizar
dominios o microdominios de membrana y estudiar su regulacin. Es mucho
lo que se ha avanzado en los ltimos aos en el campo de la microscopa y
ahora son posibles tcnicas que pueden darnos informacin muy precisa
acerca del comportamiento de las membranas celulares (29;32). Una sonda
que puede llegar a ser muy til es Laurdan, un colorante fluorescente que
cambia su fluorescencia dependiendo de la fase en que se encuentre la
membrana. Tambin pueden utilizarse lpidos fluorescentes que marcan fases
para estudiarlas. Estos marcadores con tcnicas poderosas como TIRF o
FRAP pueden permitirnos avanzar mucho en el entendimiento de lo que
ocurre a nivel de la membrana del espermatozoide (29;32). Sera interesante

102

ver cmo se ve afectada la distribucin de los dominios lipdicos durante la

estimulacin de la reaccin acrosomal.
El segundo objetivo de esta tesis fue desarrollar tcnicas que nos
permitan producir protenas permeables a membranas y utilizarlas para
estudiar la reaccin acrosomal. Con esta metodologa es innumerable la
cantidad de posibilidades que se abren. Podra estudiarse qu mecanismos se
desencadenan antes de la apertura de los SOCCs, ya que al usar
espermatozoides no permeabilizados los gradientes de membrana no se ven
afectados. Sera interesante corroborar si las vas que nosotros suponemos que
ocurren despus de la apertura de los SOCCs pueden llegar a activarse antes
en condiciones fisiolgicas. El hecho de poder contar con esta tcnica nos
puede dar una idea mucho ms completa de la dinmica de los procesos
moleculares de la reaccin acrosomal.
En cuanto al rol de los lpidos como segundo mensajeros todava queda
mucho por hacer. Hasta ahora hemos caracterizado la funcin de tres lpidos,
DAG, PA y PIP2, y una enzima modificadora de lpidos, PLD1. Sera
interesante abarcar las vas completas que llevan a la formacin de estos y
otros lpidos.
Un punto clave, no slo para el estudio de los lpidos, sino para el
modelo general de reaccin acrosomal sera introducir la variable tiempo. Una
posibilidad puede ser el uso de sensores que nos permitan hacer un
seguimiento en tiempo real de algunos de los procesos que ocurren durante la
reaccin acrosomal, como produccin de lpidos, movilizaciones de iones,
fosforilaciones, etc. En el mercado existen numerosos sensores para visualizar
las movilizaciones de iones, pero no para ver otros procesos. Aunque s
existen fluorforos sensibles al ambiente, que cambian su fluorescencia
dependiendo de la hidrofobicidad de sus alrededores, de fosforiliaciones, etc.
Estos fluorforos pueden utilizarse para marcar protenas, ya sean permeables

103

o no, y utilizarlas para hacer un seguimiento en el tiempo de lo que ocurre en

el espermatozoide cuando se dispara la reaccin acrosomal.
Otro aspecto general del proceso de reaccin acrosomal que merece ser
estudiado es la comunicacin entre las distintas vas. Es sabido que hay vas
que pueden desencadenar la activacin de otras de manera indirecta. Por
ejemplo Rab3A, que est en la va que lleva al ensamblaje de las protenas
SNAREs, puede disparar la salida de Ca2+ acrosomal. Por otro lado DAG, que
est en la va que lleva a la salida de Ca2+ acrosomal, puede disparar por s
mismo la reaccin acrosomal en ausencia de Ca2+. Estos resultados nos
indican que existe comunicacin entre las vas y que de alguna manera una
puede activar a la otra.
Como se pudo ver a lo largo de todo este trabajo el proceso de reaccin
acrosomal es un proceso muy complejo y altamente regulado. Estudiarlo es
fundamental para entender el proceso de fertilizacin y puede abrir
perspectivas en el tratamiento de la infertilidad masculina.

104

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129

APNDICE:

130

Abreviaturas utilizadas
2-APB: 2-amino-ethoxydiphenylborate: 2-amino-etoxidifenilborato.
AA: arachidonic acid: cido araquidnico.
C1: dominio homlogo al dominio de unin a DAG de PKC.
C2: dominio de unin a membranas regulado por Ca2+.
CFTR: cystic fibrosis transmembrane conductance regulador: regulador de la
conductancia transmembrana de la fibrosis qustica.
COX: cycloxigenase: cicloxigenasa.
CRV: calreticulin containig vesicles: vesculas que contienen calreticulina
CyD: methyl--cyclodextrin: metil--ciclodextrina.
CyDC: cholesterol loaded methyl--cyclodextrin: metil--ciclodextrina
cargada con colesterol.
DAG: diacylglycerol: diacilglicerol.
ENaC: epithelial Na+ channel: canal de sodio epithelial.
Epac: exchange protein directly activated by cAMP: protena de intercambio
directamente activada por cAMP.
FRAP: fluorescence recovery alter photobleaching: recuperacin de la
fluorescencia despus de photobleaching.
GAP: GTPase activating protein: protena activadora de GTPasa.
GDF: GDI dissociation factor: factor de disociacin de GDI.
GDI: GDP dissociation inhibitor: inhibidor de la disociacin de GDP.
GEF: guanine nucleotide exchange factor: factor intercambiador de
nucletidos de guanina.
GST: glutathion S-transferase: glutation S-transferasa.
HDL: high density lipoprotein: lipoprotena de alta densidad.
HTF: human tubal fluid: fluido tubal humano
IP3: inositol trisphosphate: inositol trifosfato.
131

LOX: lypoxigenase: lipoxigenasa.

LPA: lysophosphatidic acid: cido lisofosfatdico.
M6PR: manose 6-phosphate receptor: receptor a manosa 6-fosfato.
NSF: N-ethylmaleimide sensitive factor: factor sensible a N-etilmaleimida.
PA: phosphatidic acid: cido fosfatdico.
PABD: phosphatidic acid binding domain: dominio de unin a cido
fosfatdico.
PC: phosphatidycoline: fosfatidilcolina.
PH: pleckstrin homology domain: dominio homlogo a pleckstrina, hace
referencia a la primera protena en que se encontr ese dominio.
PI(3,4)P2: phosphatidyl 3,4-bisphosphate: fosfatidil 3,4-bifosfato.
PI(3,4,5)P3: phosphatidyl 3,4,5-trisphosphate: fosfatidil 3,4,5-trifosfato.
PI(4)P: phosphatidyl 4-phosphate: fosfatidil 4-fosfato.
PI(4,5)P2: phosphatidyl 4,5-bisphosphate: fosfatidil 4,5-bifosfato.
PI3K: phosphatidylinositol 3-kinase: fosfatidilinositol 3-quinasa.
PI4K: phosphatidylinositol 4-kinase: fosfatidilinositol 4-quinasa.
PIP: phosphatidylinositol monophosphate: fosfatidilinositol monofosfato.
PIP2: phosphstidylinositol bisphosphate: fosfatidilinositol bifosfato.
PIP3: phosphatidylinositol trisphosphate: fosfatidilinositol trifosfato.
PKA: protein kinase A: protenas quinasa A.
PKC: protein kinase C: protena quinasa C. En el texto se menciona PKC.
PKD: protein kinase D: protena quinasa D.
PLA2: phospholipase A 2: fosfolipasa A 2.
PLC: phospholipase C: fosfolipasa C. Puede haber subclases de PLC como
por ejemplo PLC4.
PLD: phospholipase D: fosfolipasa D. En el texto se menciona PLD1 y
PLD2.
PMA: phorbol myristoyl acetate: acetato de miristoil forbol.
PX: phox homology domain: dominio homlogo a phox.

132

RNE: redundant nuclear envelope: envoltura nuclear redundante.

ROS: reactive oxigen species: especies reactivas del oxgeno.
SLO: streptolysin O: estreptolisina O.
SNAP25: synaptosome-associated protein of 25kDa: protena asociada a
sinaptosomas de 25 kDa.
SNAREs: SNAP receptor: receptor de SNAP.
SOCCs: store operated calcium channels: canales de calcio operados por
reservorio.
Trp: transient receptor potencial: potencial de receptor transitorio.
VAMP: vesicle-associated membrane protein: protena de membrana asociada
a vesculas.
SNAP: soluble NSF attachment protein alpha: protena soluble de unin a
NSF alfa.

133