Anda di halaman 1dari 22

1.

TUJUAN PRAKTIKUM
Tujuan dilakukannya praktikum ini adalah untuk mengetahui cara menghitung jumlah
koloni mikroba dengan metode hitungan cawan (HC terdiri dari pour palte dan spread
plate) dan most probable number (MPN), mengetahui perbedaan antara metode HC dan
MPN, mengetahui perbedaan antara metode pour plate dan spread plate, mengetahui
fungsi dari tabung Durham, mengetahui apa itu spreader, mengetahui mikroorganisme
yang dapat memecah LB.
2. TINJAUAN PUSTAKA
Jumlah mikroba yang terdapat pada suatu bahan dapat dihitung dengan berbagai macam
cara tergantung dari bahan dan jenis mikroba yang ditentukan. Jenis mikroba pada
tanah, air, dan lainnya tergantung pada susunan medium tempat mikroba tersebut
tinggal. Pada umumnya ada 3 cara penghitungan jumlah mikroba yakni dengan
perhitungan jumlah sel, perhitungan massa sel secara langsung, serta perhitungan massa
sel secara tidak langsung. (Waluyo, 2008, 205-206:305)
Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme seringkali diperlukan dalam berbagai
penelitian tentang mikrobiologi. Pada umumnya pengukuran dasar populasi
mikroorganisme dengan perhitungan jumlah sel dan massa sel dari mikroorganisme
tersebut. Perhitungan jumlah sel biasanya dilakukan untuk mikroorganisme yang bersel
tunggal, namun perhitungan massa sel dapat dilakukan tidak hanya pada mikroba bersel
satu tetapi juga untuk mikroorganisme yang berfilamen seperti jamur. (Waluyo, 2008,
205-206:305)
Beberapa cara yang dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroorganisme dalam
suatu bahan, yaitu:
a.
-

Perhitungan jumlah sel


Hitungan mikroskopik
Hitungan cawan
MPN (Most Prodable Number)

b. Perhitungan massa sel secara langsung


- Volumetric
- Gravimetric
1

Kekeruhan (turbidimetri)

c.
-

Perhitungan massa sel secara tidak langsung


Analisis komponen sel (protein, DNA, ATP, dll)
Analisis produk katabolisme (metabolit primer atau sekunder dan panas)
Analisis konsumsi nutrient (karbon, nitrogen, oksigen, AA, mineral, dll)

(Fardiaz, 1992, 118:320)


Cara lain untuk mengukur jumlah sel selain dengan menggunakan hitungan cawan
(Plate Count) yang terdiri dari 2 jenis cara pemupukan yakni pour plate dan spread
plate, dan hitungan mikroskopis langsung (Direct Microscopic Count) adalah dengan
menyaring sampel dengan suatu saringan membran. Saringan tersebut kemudian
diinkubasikan pada permukaan medium yang sesuai. Jasad-jasad renik yang tertahan
pada permukaan saringan menyerap nutrien dari medium lain dan menghasilkan kolonikoloni, masing-masinf berasal dari satu sel tunggal yang dapat hidup. (Hadioetomo,
1993, 72:163)
Nutrient Agar (NA) adalah media yang paling baik jika digunakan untuk media
pertumbuhan khamir dan bakteri. NA memiliki kemampuan untuk menghambat
bergerombolnya koloni dari mikroba yang diinokulasi ke dalamnya sehingga
memungkinkan untuk mengisolasi koloni individu dari bahan yang mengandung spesies
Proteus. NA juga dapat digunakan untuk mengisolasi bakteri koliform. Komposisi
penyusun NA antara lain: pepton dari daging sebesar 10 g/ liter, ekstrak daging dengan
komposisi 3 g/ liter, natrium klorida sebesar 5 g/ liter, pril sebesar 1 g/ liter dan juga
tersusun atas agar sebesar 15 g/ liter. (Merck, et al., 1998, 73: 133).
Hitungan cawan adalah cara yang paling sensitif untuk menentukan jumlah
mikroorganisme karena:
1. Hanya mikroorganisme yang masih hidup dapat dihitung.
2. Beberapa jenis mikroorganisme dapat dihitung sekaligus.
3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroorganisme karena koloni yang
terbentuk mungkin berasal dari suatu mikroorganisme yang mempunyai penampakan
pertumbuhan spesifik.

(Fardiaz, 1992, 123-124 : 320)


Keuntungann metode hitungan mikroskopis langsung adalah pelaksanaannya cepat dan
tidak memerlukan banyak peralatan. Namun metode ini juga memiliki kelemahan
seperti tidak dapat dibedakannya sel yang hidup dan yang mati. Dengan kata lain hasil
yang diperoleh adalah jumlah total sel yang ada di dalam populasi mikroba tersebut.
Pada beberapa sel eukariotik, penambahan zat warna tertentu seperti biru metilen
sebanyak 0,1% pada sampel yang akan dihitung dapat digunakan untuk membedakan
sel yang hidup dan sel yang mati. (Hadioetomo, 1993, 72-73 : 163)
Kelemahan lainnya dari metode hitungan mikroskopis langsung adalah sulitnya
menghitng sel yang berukuran sangat kecil seperti bakteri karena ketebalan dari
hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa objektif celup minuak. Hal ini
biasanya ditanggulangi dengan cara mewarnai sel sehingga menjadi mudah dilihat.
Selain itu, hitungan mikroskopis langung juga kadang-kadang sel cenderung
bergerombol sehingga sukar membedakan sel-sel individu. Cara mengatasi kondisi
seperti ini adalah dengan cara mencerai-beraikan gerombolan sel-sel tersebut dengan
menambahkan bahan anti gumpal seperti dinamtrium etilena diaminatetraasetat dan
Tween 80 sebanyak 0,1%. (Hadioetomo, 1993, 73:163)
Medium merupakan bahan yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme, baik
di atas atau di dalamnya. Pembuatan medium sebaiknya menggunakan air sulng atau
aquades karena air atau aquades merupakan salah satu faktor kebutuhan dasar dari
mikroorganisme disamping karbon, energi, mineral dan faktor-faktor lainnya.
(Hadioetomo, 1993, 44-45:163). Media sendiri dibagi menjadi 3 macam yakni media
padat, cair, dan semi padat atau semi cair. (Suriawiria, 2005, 75:172)
Massa sel dapat ditentukan dengan beberapa metode. Salah satu cara umum yang paling
sering digunakan adalah dengan pengukuran kekeruhan suspense sel. Cara lain ialah
mengukur berat kering sel (filament miselium) sampel di dalam suatu volume tertentu.
Dalam penentuan, pertama-tama sampel disentrifugasi atau disarng, kemudian dicuci,
dikeringkan dan beratnya ditimbang setelahnya. (Hadioetomo, 1993, 72:163)

Dalam membuat kurva pertumbuhan mikroba diperlukan perhitungan jumlah sel. Cara
perhitungan yang paling sering digunakan adalah:

Pengenceran
Penggunaan ruang penghitungan
Penggunaan turbidometer atau nefelometer.

(Suriawiria, 2005, 98:172)


Pengenceran disiapkan beberapa tabung reaksi yang berisi aquades steril sebanyak 9 ml.
Lalu pada setiap tabung reaksi ditambahkan 1 ml sampel yang akan diperiksa secara
bertahap. Tahapannya adalah :
1. 1 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung pertama sehingga konsentrasi larutan
di dalam tabung pertama menjadi 10-1
2. 1 ml dari tabung pertama diambil dan dimasukkan ke dalam tabung kedua
sehingga konsentrasi larutan di dalam tabung kedua menjadi 10-2
Tahapan ini dilakukan sampai mencapai konsentrasi larutan terendah sesuai dengan
konsentrasi larutan awal. Dengan konsentrasi larutan terendah, maka besar
kemungkinan pertumbuhan mikroba pada media akan jarang dapat dihitung.
(Suriawiria, 2005, 101:172)
Cara menghitung secara tidak langsung dibagi menjadi 3 jenis:

Penentuan volum total


Merupakan modifikasi penetuan hematokrit pada pengukuran volum total butirbutir darah organisme dipadatkan dengan sentrifus pada kecepatan baku dan
waktu yang tepat menurut ukurannya. Lalu volum totalnya dapat dibaca pada
skala silinder itu. Dengan adanya volum rata-rata masing-masing sel dapat

ditentukan jumlah sel.


Metode turbidiometri
Teknik ini digunakan untuk megukur kekeruhan suspensi atas dasar penyerapan
dan pemencaran cahaya yang dilintaskan sehingga yang mengandung lebih dari
108 sel per millimeter tamapak keruh oleh mata telanjang. Tabung ini diletakkan
antara suatu sumber cahaya dan satuan fotoelektrik yang disambung dengan
galvanometer.

Perhitungan bakteri hidup


Perhitungan bakteri hidup dilakukan dengan cara seri pengenceran. Cara ini
digunakan untuk menghitung bakteri hidup dalam berbagai cairan seperti air,
susu, biakan cair dan sebagainya. Serentetan pengenceran dibuat dengan tujuan
untuk kemudian ditanam dalam medium pembiakan bulyon agar dan setelah
inkubasi jumlah kolini dihitung.

(Irianto, 2006, 145-146:256)


Pada metode tuang, sejumlah sampel dari pengenceran yang diingini, dimasukkan ke
dalam cawan petri, lalu ditambah agar-agar cair steril yang telah didinginkan sampai
mencapai suhu 47-500C sebanyak 15-20 ml dan digoyangkan supaya sampelnya
menyebar. Pada pemupukan dengan metode permukaan, terlebih dahulu dibuat agar
cawan lalu sebanyak 0,1 ml sampel yang telah diencerkan sebelumnya dipipet pada
permukaan agar-agar tersebut. Kemudian diratakan dengan batang gela melengkung
yang steril. Jumlah koloni dalam sampel dapat dihitung sebagai berikut :
Koloni per ml atau per gram = jumlah koloni per cawan x 1
Faktor pengenceran
Laporan hasil menghitung dengan cara hitungan cawan menggunakan suatu standar
-

yang disebut Standard Palte Counts (SPC) memiliki berbagai ketentuan yaitu :
Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni 30-300, jika

tidak ada yang memenuhi syarat dipilih yang jumlahnya mendekati 300.
Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu yang merupakan satu koloni yang besar

dimana jumlah koloninya diragukan dianggap sebagai satu koloni.


Satu deretan rantai koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dianggap sebagai satu

koloni.
Koloni yang menutup lebih besar dari setengah luas cawan petri dinamakan spreader.
Perbandingan jumlah bakteri hasil pengenceran yang berturut-turut antara pengenceran
yang lebih besar dengan pengenceran sebelumnya, jika sama atau lebih kecil dari 2
hasilnya dirata-rata. Tetapi jika lebih besar dari 2 yang dipakai jumlah mikroba dari

hasil pengenceran sebelumnya.


Jika dengan ulangan stelah memenuhi syarat hasilnya dirata-rata.
Dalam SPC ditentukan cara pelaporan dan perhitungan koloni sebagai berikut :

Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari 2 angka yakni angka pertama (satuan) dan
angka kedua (desimal) jika angka ketiga sama dengan atau lebih besar daripada 5, harus

dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka kedua.


Jika pada semua pengenceran yang dihasilkan kurang dari 30 koloni per cawan petri
berarti pengenceran yang dilakukan terlalu tinggi. Karena itu, jumlah koloni pada
pengenceran yang terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30
dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus

dicantumkan di dalam tanda kurung.


Jika pada semua pengenceran dihasilkan lebih dari 300 koloni pada cawan petri, berarti
pengenceran yang dilakukan terlalu rendah. Karena itu, jumlah koloni pada pengenceran
yang tertinggi yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300 dikalikan
dengan faktor pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan di dalam

tanda kurung.
Jika jumlah cawan dari dua tingkat pengenceran dihasilkan koloni dengan jumlah antara
30 dan 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua
pengenceran tersebut lebih kecil atau sama dengan dua, dilaporkan rata-rata dari kedua

nilai tersebut dengan memperhitungkan faktor pengencerannya.


Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah lebih besar daripada 2, yang

dilaporkan hanya hasil yang terkecil.


Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, data yang diambil harus dari
kedua cawan tersebut, tidak boleh dari satu. Oleh karena itu, harus dipilih tingkat
pengenceran yang menghasilkan kedua cawan duplo dengan koloni antara 30 dan 300.
(Waluyo, 2008, 210-211:305)

Metode sebar / Surface spread plate memiliki langkah-langkah sebagai berikut:


3 tabung PCA (Plate Count Agar) diencerkan dalam air mendidih.
Agar didinginkan dalam penangas air (500C) selama 5-10 nmenit.
Agar dituangkan ke cawan petri dan membiarkan membeku (10-15 menit). Tandai

cawan dengan kode dan tingkat pengenceran (missal 10-1, 10-2, dan seterusnya).
Membuat pengenceran dari sampel, mulai dari kecil sampai besar.
Gunakan alat penyebar untuk meratakan suspensi di atas permukaan lempengan agar.
Cawan petri dibalik dan dimasukkan almari pengeram dengan suhu tertentu selama 1-2

hari.
Menghitung koloni pada cawan yang mempunyai jumlah 30-300 koloni.

Jumlah mikroba hidup dihitung dengan cara mengalikan faktor pengenceran yang
digunakan dikalikan 10 karena hanya 0,1 ml suspensi yang digunakan memperoleh
CFU/ml (Colony Forming Units).
(Waluyo, 2008, 212-213:305)
Dalam metode MPN, pengenceran sampel harus lebih tinggi daripada pengenceran pada
hitungan cawan, sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang
diinokulasikan

dengan

larutan

hasil

pengenceran

tersebut

mengandung

mikroorganisme, beberapa tabung mungkin mengandung lebih dari 1 sel, sedangkan


tabung yang lain memungkinkan jika tidak mengandung sel sama sekali. Dengan
demikian, setelah inkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa tabung, yang
dinyatakan sebagai tabung positif sedangkan tabung lainnya negatif. Metode MPN
sering digunakan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam sampel yang berbentuk
cair, meskipun dapat juga digunakan untuk sampel yang tidak berbentuk cair dengan
cara membuat suspens 1:10 dari sampel tersebut terlebih dahulu. Kelompok
mikroorganisme yang dapat dihitung dengan metode MPN juga bervariasi tergantung
dari medium yang digunakan untuk pertumbuhan. Dari setiap pengenceran masingmasing dimasukkan 1 ml ke dalam tabung yang berisi medium, dimana untuk setiap
pengenceran digunakan 3 atau 5 deri tabung. Setelah inkubasi pada suhu dan waktu
tertentu dihitung jumlah tabung yang positif. Kriteria tabung positif atau tidak ditandai
dengan timbulnya kekeruhan atau gas pada tabung durham. Misalnya, pada pengenceran
pertama 3 tabung menghasilkan pertumbuhan positif, pada pengencera n kedua tabung 2
tabung positif, pada pengenceran ketiga 1 tabung positif, dan pada pengenceran terakhir
tidak ada tabung yang positif. Kombinasinya menjadi 3,2,1,0 dan jika diambil 3
pengenceran pertama kombinasinya menjadi 3,2,1. Angka kombinasi ini kemudian
dicocokkan dengan Tabel MPN. Tabel tersebut misalnya Daftar Hoskins atau daftar
Mc.Grady kemudian niali MPN sampel dapat dihitung sebagai berikut :
MPN sampel = Nilai MPN dari table x
1
Pengenceran tabung tengah
Metode MPN digunakan untuk menghitung jumlah mikroba tertentu yang terdapat di
antara campuran mikroba lain. Cara ini dapat digunakan untuk menentukan MPN

kelompok

bakteri

koliform,

termasuk

juga

bakteri-bakteri

yang

dapat

memfermentasikan laktosa.
(Waluyo, 2008, 213-214:305)

Lactose Broth (LB) adalah media yang biasa digunakan untuk melihat pertumbuhan
mikroba yang di dalam pertumbuhan melibatkan gas. Karena media ini membuat kita
dapat melihat keberadaan gas yang dihasilkan oleh koliform (Bartam, 1996). LB yang di
dalamnya harus diletakkan tabung durham dapat digunakan untuk mendeteksi
kerusakan mikroba laktosa. Dalam analisis bakteriologis air kaldu, LB terutama
digunakan untuk mendeteksi bakteri koliform. Komposisi penyusun LB antara lain:
natrium klorida sebanyak 5 g/ liter, ekstrak daging sebesar 3 g/ liter, laktosa sebesar 10
g/ liter, pepton dari daging sebesar 10 g/ liter, dan juga bromocresol ungu sebanyak 0,02
g/ liter (Merck, et al., 1998, 70: 133).

3. MATERI METODE
3.1. Materi
3.1.1. Alat
4.
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah tabung durham, cawan
petri steril, tabung reaksi, rak tabung reaksi, pemanas elektrik, jarum ose, vortex, kertas
pembungkus, label, pipet, tissue, kapas, Bunsen, korek api, serbet, masker, colony
counter, inkubator 30-32oC, Erlenmeyer, neraca, aquades dan alkohol.
5.
5.1.1. Bahan
6. Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah kultur Acetobacter
xylinum, dan media (NA cair untuk metode hitungan cawan dan Lactose Broth untuk
metode MPN) dan air sawah.
7.
7.1.

Metode

8. 3.2.1. Pengenceran Klutur


9.

Mula-mula kultur Acetobacter xylinum (untuk metode hitungan cawan) dan air

sawah (untuk metode MPN) yang telah ditambah 10 ml aquades dituang ke dalam
tabung reaksi. Setelah itu tabung reaksi divortex sehingga diperoleh pengenceran 10 -1.
Setelah itu 1 ml larutan tersebut dimasukan ke dalam tabung reaksi ditambah dengan 9

ml aquades steril. Setelah itu tabung reaksi divortex sehingga diperoleh pengenceran 10 2

. Setelah itu 1 ml larutan tersebut dimasukan ke dalam tabung reaksi ditambah dengan

9 ml aquades steril. Setelah itu tabung reaksi divortex sehingga diperoleh pengenceran
10-3. Perlakuan tersebut dilakukan hingga didapat pengenceran 10-6.
10.
3.2.2. Metode Hitungan Cawan
3.2.2.1.
Metode Pour Plate
11.
Mula-mula 1 ml sampel diambil dari tiap-tiap pengenceran dan dimasukan ke
dalam cawan petri lalu diputar-putar agar merata. Setelah itu media yang sudah
disterilkan didinginkan lalu dituang ke dalam masing-masing cawan dan diputar-putar
agar merata. Setelah itu media dibiarkan memadat. Cawan petri dibungkus kembali dan
diinkubasi 24 jam lalu siamati, dihitung jumlah koloninya dan jumlah koloni per mlnya.
12.
3.2.2.2.
Metode Spread Plate
13.
Mula-mula media dituang ke dalam cawan dan dibiarkan membeku. Setelah itu
1 ml sampel diambil dari tiap-tiap pengenceran dan dimasukan ke dalam cawan petri
lalu diputar-putar agar merata. Setelah itu cawan petri dibungkus kembali dan
diinkubasi 24 jam lalu siamati, dihitung jumlah koloninya dan jumlah koloni per mlnya.
14.
3.2.2.3.
Metode Most Probably Number (MPN)
15.
Mula-mula media LB dimasukan ke dalam 9 tabung rekasi dan diberi tabung
Durham. Setelah itu media disterilisasi dan diturunkan suhunya. Tiap tabung reaksi
ditambahkan 1 ml sampel air sawah yang sudah diencerkan, tiga tabung pertama diberi
1 ml sampel dengan pengenceran 10-1, tiga tabung pertama diberi 1 ml sampel dengan
pengenceran 10-2, tiga tabung pertama diberi 1 ml sampel dengan pengenceran 10-3 lalu
9 tabung tersebut diinkubasi selama 3 hari. Setelah itu diamati dan dihitung jumlah
koloninya.
16.
4.
HASIL PENGAMATAN
5.

Hasil pengamatan jumlah koloni dengan metode Pour plate dan Spread plate
dapat dilihat di tabel 1.

6.
7.

Tabel 1. Hasil pengamatan jumlah koloni dengan metode Pour plate dan Spread
Plate

8.
Kel

9.

Metode

10.

Pengen

11.

Gambar

12.

Jumlah koloni

10

ceran
16.

14. Pour Plate

15.

10-1

13.
A1

22.

25. Pour Plate


31. Spread
Plate

37. Pour Plate

21.

26.

32.

38.

10-1

43. Spread
Plate

49. Pour Plate

44.

50.

23.

spreader

10

27.
28.

29.

134

10-2

33.
34.

35.

288

41.

122

47.

242

53.

120

59.

150

65.

95

-2

10-3

36.
A3
10-3

10-4

48.
A4

60.
A5

148

17.

20. Spread
Plate

24.
A2

18.

55. Spread
Plate

56.

10-4

61. Pour Plate

62.

10-5

39.
40.

45.
46.

51.
52.

57.
58.

63.
64.

11

67. Spread
Plate

73. Pour Plate

68.

74.

10-5

10-6

72.
A6
79. Spread
Plate

80.

10-6

69.
70.

75.
76.

81.
82.

71.

110

77.

52

83.

80

84.
85.

Dari tabel diatas kelompok A1 dengan metode Pour Plate serta pengenceran 10-1
jumlah koloninya 148. Sedangkan dengan metode Spread Plate serta pengenceran
10-1 jumlah koloninya spreader. Sedangkan kelompok A2 dengan metode Pour
Plate dan pengenceran 10-2 jumlah koloninya 134. Dan yang menggunakan metode
Spread Plate dan pengenceran 10-2 jumlah koloninya 288. Kelompok A3 dengan
metode Pour Plate serta pengenceran 10-3 jumlah koloninya 122. Dengan metode
Spread Plate serta pengenceran 10-3 jumlah koloninya 242. Sedangkan kelompok
A4 dengan metode Pour Plate dan pengenceran 10 -4 jumlah koloninya 120.
Sedangkan yang menggunakan metode Spread Plate dan pengenceran 10 -4 jumlah
koloninya 150. Dari kelompok A5 hasil pengamatan dengan metode Pour Plate
serta pengenceran 10-5 jumlah koloninya 95. Dan hasil pengamatan yang
menggunakan metode Spread Plate dan pengenceran 10-5 jumlah koloninya 110.
Sedangkan hasil pengamatan kelompok A6 dengan metode Pour Plate serta
pengenceran 10-6 jumlah koloninya 52. Sedangkan dengan metode Spread Plate
serta pengenceran 10-6 jumlah koloninya 80. Dari data yang tertera pada tabel di
atas dapat disimpulkan jika semakin encer suatu sampel maka jumlah koloni yang
muncul juga akan semakin sedikit.

86.
86.2. Pengamatan MPN
87.
88.
89.
90.

Hasil pengamatan MPN dapat dilihat ditabel 2.

12

91.
92.

Tabel 2. Hasil pengamatan MPN


Kelomp
ok

93.
-1

94.

Jumlah Tabung Positif


-2

96.
10
97.
10
100. A1
101. 2
102. 3
105. A2
106. 2
107. 1
110. A3
111. 1
112. 2
115. A4
116. 2
117. 3
120. A5
121. 1
122. 3
125. A6
126. 1
127. 1
130.
131. Dari hasil pengamatan dapat dilihat hasil MPN

MPN
Count

-3

98.
10
103. 0
108. 2
113. 0
118. 1
123. 3
128. 0

99.
104.
109.
114.
119.
124.
129.

29
27
11
36
7,4

count kelompok A1 adalah 29.

Sedangkan hasil MPN count kelompok A2 adalah 27. Hasil MPN count kelompok A3
adalah 11. Sedangkan hasil MPN count kelompok A4 adalah 36. Hasil MPN count
kelompok A5 tidak diketahui karena kombinasi yang didapat tidak tertera di tabel.
Sedangkan hasil MPN count kelompok A6 adalah 7,4.
132.
133.
134.
135.
136. PEMBAHASAN
137.
138. Jumlah koloni dapat dihitung dengna menggunakan beberapa metode. Metode
yang paling sering digunakan adalah metode perhitungan mikroskopik langsung,
metode hitungan cawan, dan hitungan Most Probable Number (MPN) (Fardiaz,
1992, 118:320). Dalam praktikum kali ini, jumlah koloni dihitung dengan
menggunakan hitungan cawan yang terdiri dari pour plate dan spread plate serta
dengan metode Most Probable Number (MPN).
139.
140. 5.1. Pengenceran Kultur
141. Pada percobaan pengenceran kultur, pertama kali kultur yang akan digunakan
yakni Acetobacter xylinum ditambah dengan 10 ml aquades dan dituang ke dalam
tabung reaksi. Setealh itu, tabung reaksi di vortex sehingga di dapatkan
pengenceran 10-1. Selanjutnya dari pengenceran pertama (10-1) diambil 1 ml dan
dimasukkan ke dalam tabung reaksi untuk ditambah dengan 9 ml aquades steril

13

dan divortex sehingga mendapatkan pengenceran 10-2. Setelah itu, 1 ml dari


pengeceran kedua diambil dan di masukkan ke tabung reaksi yang lain untuk
ditambah dengan 9 ml aquades steril dan divortex untuk mendapatkan
pengenceran 10-3. Hal ini dilakukan hingga didapatkan larutan dengan
pengenceran 10-6. Aquades steril digunakan dengan tujuan sebagai larutan
pengencer (Suriawiria, 2005, 101:172).
142.
143. Hal yang paling penting di dalam metode hitungan cawan adalah teknik
pengenceran. Cawan yang dipilih untuk dihitung sebaiknya mengandung jumlah
koloni antara 30 sampai 300 koloni. Maka dari itu, untuk memenuhi hal tersebut,
proses pengenceran harus dilakukan. Jumlah mikroba di dalam sampel dapat
dihitung dengan cara mengalikan jumlah koloni dengan faktor pengenceran pada
cawan yang bersangkutan (Waluyo, 2008, 209:305).
144.
145. Dari tabel hasil pengamatan dapat dilhat jika setiap pengeceran yang bereda maka
jumlah koloni yang terdapat juga berbeda-beda. Hal ini dikarenakan
mikroorganisme sendiri mempunyai faktor-faktor dasar yang harus dipenuhi agar
dapat hidup seperti air, karbon, energi, mineral, dan faktor-faktor tumbuh lainnya
(Hadioetomo, 1993, 44-45:163). Dan karena mikroba sendiri lebih mudah
beradaptasi di medium cair yang memiliki kerapatan lebih rendah dibanding
dengan medium padat yang disebabkan mikroba lebih mudah melakukan
mobilisasi jika berada di medium yang kerapatannya rendah sehingga dapat
mencari nutrisi untuk mempercepat proses pertumbuhannya. Oleh karena itu,
jumlah koloni yang terbentuk pada masing-masing pengeceran akan berbeda-beda.
Semakin tinggi pengencerannya, maka semakin kecil kerapatan larutan tersebut
dan semakin mempermudah mikroorganisme tersebut membetuk koloni.
146.
146.2. Metode Hitungan Cawan
147. Metode hitungan cawan digunakan dengan dasar anggapan bahwa setiap sel yang
dapat hidup dan berkembang biak membentuk suatu koloni dalam jangka waktu
tertentu. Prinsip dari hitungan cawan sendiri adalah jika mikroorganisme yang
masih hidup ditumbuhkan pada media agar, maka sel mikroorganisme tersebut

14

akan berkembang biak dan membentuk suatu koloni yang dapat dilihat langsung
dan dihitung dengan mata tanpa harus menggunakan mikroskop. Metode hitungan
cawan atau plate count sendiri paling sensitif jika digunakan untuk menentukan
jumlah mikroorganisme. Hal ini disebabkan karena hitungan cawan hanya dapat
digunakan untuk menghitung mikroorganisme yang masih hidup, selain itu
beberapa jenis mikroorganisme dapat dihitung sekaligus dan dapat digunakan
untuk mengisolasi dan mengidentifikasi mikroorganisme

karena koloni yang

dibentuk oleh mikroorganisme tersebut memungkinkan jika berasa dari suatu


mikroorganisme yang mempunyai penampakan pertumbuhan spesifik (Fardiaz,
1992, 123-124 : 320).
148.
149. Metode hitungan cawan sendiri memiliki dua tipe cara pemupukan yakni pour
plate dan spread plate (Hadioetomo, 1993, 72:163). Hasil yang didapat dari
metode hitungan cawan dihitung dengan suatu standar yang disebut dengan
Standart Plate Counts (SPC). SPC sendiri memiliki syarat-syarat ketentuan yang
berlaku antara lain:
-

Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni 30-300, jika

tidak ada yang memenuhi syarat dipilih yang jumlahnya mendekati 300.
Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu yang merupakan satu koloni yang besar

dimana jumlah koloninya diragukan dianggap sebagai satu koloni.


Satu deretan rantai koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dianggap sebagai satu

koloni.
Koloni yang menutup lebih besar dari setengah luas cawan petri dinamakan spreader.
Perbandingan jumlah bakteri hasil pengenceran yang berturut-turut antara pengenceran
yang lebih besar dengan pengenceran sebelumnya, jika sama atau lebih kecil dari 2
hasilnya dirata-rata. Tetapi jika lebih besar dari 2 yang dipakai jumlah mikroba dari

hasil pengenceran sebelumnya.


Jika dengan ulangan stelah memenuhi syarat hasilnya dirata-rata.
150. Dalam SPC ditentukan cara pelaporan dan perhitungan koloni sebagai berikut :
151.

Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari 2 angka yakni angka pertama (satuan) dan
angka kedua (desimal) jika angka ketiga sama dengan atau lebih besar daripada 5, harus
dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka kedua.

15

Jika pada semua pengenceran yang dihasilkan kurang dari 30 koloni per cawan petri
berarti pengenceran yang dilakukan terlalu tinggi. Karena itu, jumlah koloni pada
pengenceran yang terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30
dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus

dicantumkan di dalam tanda kurung.


Jika pada semua pengenceran dihasilkan lebih dari 300 koloni pada cawan petri, berarti
pengenceran yang dilakukan terlalu rendah. Karena itu, jumlah koloni pada pengenceran
yang tertinggi yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300 dikalikan
dengan faktor pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan di dalam

tanda kurung.
Jika jumlah cawan dari dua tingkat pengenceran dihasilkan koloni dengan jumlah antara
30 dan 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua
pengenceran tersebut lebih kecil atau sama dengan dua, dilaporkan rata-rata dari kedua

nilai tersebut dengan memperhitungkan faktor pengencerannya.


Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah lebih besar daripada 2, yang

dilaporkan hanya hasil yang terkecil.


Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, data yang diambil harus dari
kedua cawan tersebut, tidak boleh dari satu. Oleh karena itu, harus dipilih tingkat
pengenceran yang menghasilkan kedua cawan duplo dengan koloni antara 30 dan 300.
152. (Waluyo, 2008, 210-211:305)
153.
154. 5.2.1.

Pour Plate

155. Pertama-tama 1 ml kultur Acetobacter xylinum diambil dan dimasukan ke dalam


cawan petri. Kemudian, cawan petri tersebut diputar-putar sehingga kultur tadi
merata di dalam cawan petri tersebut. Media yang sudah ada di sterilkan dan
didinginkan lalu dituang ke dalam masing-masing cawan kemudian diputar-putar
lagi sampai merata. Setelah itu, media dibiarkan hingga memadat sebelum cawan
petri dibungkus dan diinkubasi selama 24 jam dan diamati untuk dihitung
setelahnya.
156.
157. 5.2.2.

Spread Plate

16

158. Pertama-tama media dituang ke dalam cawan dan dibiarkan mengeras. Setelah itu
1 ml sampel dari kultur Acetobacter xylinum diambil dari tiap pengenceran dan
dimasukan ke dalam cawan petri kemudian diputar-putar hingga merata.
Selanjutnya cawan petri dibungkus kembali dan diinkubasi selama 24 jam
sebelum diamati dan dihitung jumlah koloni dari Acetobacter xylinum setelahnya.
159.
160. Melihat cara kerja kedua jenis pemupukan dari hitungan cawan ini dapat
menjawab mengapa hasil dari kedua jenis pemupukan hitungan cawan ini
memperoleh hasil yang berbeda walaupun pengencerannya sama. Pada metode
spread palte, koloni yang dibentuk oleh kultur lebih mudah diamati karena sampel
yang mengadung mikroorganisme dituangkan setelah medium yang digunakan
benar-benar memadat sehingga medium dam sampel yang akan diamati tidak
bercampur satu sama lain. Hal ini mengakibatkan koloni yang muncul hanya
berada dipermukaan medium yang digunakan. Sedangkan pada metode pour plate,
sampel yang mengandung kultur tersebut di campur dengan medium yang belum
benar-benar memadat sehingga sampel yang ada bercampur dengan medium
sehingga koloni yang tercipta sulit untuk diamati. Sehingga metode spread plate
cenderung memiliki hasil yang lebih besar dalam penghitungan jumlah koloni
dibandingkan dengan metode pour plate karena metode spread plate menghasilkan
koloni yang lebih mudah diamati daripada metode pour plate. Hal ini membuat
metode spread plate lebih efektif jika dibandingkan dengan metode pour plate.
160.2. Metode Most Probably Number (MPN)
161. Disamping metode hitungan cawan, metode lain yang digunakan dalam
penghitungan jumlah koloni adalah metode Most Probably Number (MPN). Beda
dengan metode hitungan cawan yang menggunakan medium padat dalam
prosesnya, MPN menggunakan medium cair dalam prosesnya. Dalam hal ini
digunakan medium Lactose Broth (LB). Perhitungan dilakukan dengan
berdasarkan jumlah tabung yang ditumbuhi oleh mikroorganisme setela diinkubasi
pada suhu dan waktu tertentu. Tabung yang ditumbuhi oleh mikroorganise setelah
diinkubasi dinamakan tabung positif yang ditandai dengan munculnya gas pada
tabung durham dan timbulnya kekeruhan. Untuk setiap pengenceran pada
umumnya digunakan tiga atau lima seri tabung. Semakin banyak tabung yang

17

digunakan makan ketelitian yang diperoleh akan semakin tinggi (Fardiaz, 1992,
126 : 320).
162.
163.

Langkah-langkah yang dilakukan dalam metode MPN adalah pertama kali

media LB dimasukkan ke dalam 9 tabung reaksi yang diberi tabung durham dalam
keadaan terbalik tanpa adanya gelembung gas yang muncul. Tabung durham digunakan
untuk mengetahui keberadaan mikroorganisme penghasil gas. Lactose Broth (LB)
adalah media yang biasa digunakan untuk melihat pertumbuhan mikroba yang di dalam
pertumbuhan melibatkan gas. Karena media ini membuat kita dapat melihat keberadaan
gas yang dihasilkan oleh koliform (Bartam, 1996). LB yang di dalamnya harus
diletakkan tabung durham dapat digunakan untuk mendeteksi kerusakan mikroba
laktosa. Dalam analisis bakteriologis air kaldu, LB terutama digunakan untuk
mendeteksi bakteri koliform. Komposisi penyusun LB antara lain: natrium klorida
sebanyak 5 g/ liter, ekstrak daging sebesar 3 g/ liter, laktosa sebesar 10 g/ liter, pepton
dari daging sebesar 10 g/ liter, dan juga bromocresol ungu sebanyak 0,02 g/ liter
(Merck, et al., 1998, 70: 133). Kemudian, media itu disterilisasi dan suhunya
diturunkan. Setelah itu, pada setiap tabung reaksi diberi 1 ml sampel air sawah yang
sudah diencerkan. 3 tabung pertama diberi 1 ml sampel dengan pengenceran 10 -1, 3
tabung kedua diberi 1 ml sampel dengan pengenceran 10-2, dan 3 tabung ketiga diberi 1
ml sampel dengan pengeceran 10-3 dan ke-9 tabung tadi diinkubasi selam 72 jam.
Setelah 3 hari, medium dapat diketahui ditumbuhi dengan mikroorganisme atau tidak
dengan melihat timbulnya kekeruhan dan munculnya gas pada tabung durham. Masingmasing pengenceran dihitung jumlah gelembung yang muncul sehingga didapat 3
kombinasi angka yang kemudian dilihat dalam tabel MPN nilai yang sesuai dengan
kombinasi tadi lalu dihitung dengan menggunakan rumus (Waluyo, 2008, 213-214:305).
164.
Pengenceran yang berbeda dapat menghasilkan koloni yang berbeda pula dikarenakan
mikroorganisme mempunyai faktor-faktor dasar yang harus dipenuhi agar dapat hidup
seperti air, karbon, energi, mineral, dan faktor-faktor tumbuh lainnya (Hadioetomo,
1993, 44-45:163). Dan karena mikroorganisme juga lebih mudah beradaptasi di medium
cair yang memiliki kerapatan lebih rendah dibandingkan dengan medium padat sebab
mikroorganisme juga lebih mudah bergerak untuk mencari nutrisi untuk mempercepat
proses pertumbuhannya. Maka dari itu, jumlah koloni pada setiap pengenceran juga

18

berbeda karena semakin tinggi pengencerannya maka semakin kecil kerapatan larutan
tersebut dan semakin mempermudah mikroorganisme tersebut membentuk koloni.
165. KESIMPULAN

Perhitungan jumlah suatu mikroba dapat dilakukan dengan teknik enumerasi.

Pengenceran ini perlu dilakukan untuk membatasi jumlah koloni yang tumbuh.

Metode-metode yang dapat digunakan dalam penghitungan jumlah koloni adalah


metode hitungan mikroskopik langsung, metode hitungan cawan, dan metode MPN.

Metode hitungan cawan dapat dibedakan menjadi dua jenis pemupukan, yaitu
metode pour plate dan metode spread plate.

Pada metode pour plate, sebelum media dituang ke cawan petri, harus ditunggu
beberapa saat agar suhunya tidak terlalu panas.

Sedangkan pada metode spread plate, media agar ditunggu sampai memadat, lalu
dimasukkan suspensi yang akan dihitung jumlahnya ke dalam petridish dan
diratakan dengan batang gelas melengkung yang telah disterilkan.

Mikroba dapat terletak di permukaan, tengah, atau seluruh bagian medium, jika
dilakukan penghitungan dengan metode pour plate.

Sedangkan dengan metode spread plate, mikroba hanya dapat berada / terletak pada
bagian permukaan medium saja.

Metode MPN digunakan untuk mengindikasikan jumlah tabung yang positif dengan
bantuan tabung durham sehingga jumlah koloni mikroba dapat dihitung.

Tabung durham diletakkan terbalik untuk menampung gas yang dihasilkan koliform
sehingga nantinya larutan akan tampak keruh karena timbulnya gelembung gas.

Pada metode hitungan cawan digunakan media agar padat berupa NA.

Sedangkam pada metode MPN digunakan media cair, berupa LB.

Keuntungan metode hitungan cawan adalah hanya sel hidup yang dapat dihitung,
jumlah koloni dapat dilihat dengan mata telanjang, beberapa jenis mikroorganisme
dapat dihitung sekaligus, dan dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi
mikroorganisme.

166.
167. Semarang, 5 Juni 2011

Assisten dosen :

19

Ruth Monalisa

168. Alvin Arienata H.


169. 10. 70. 0090
170. DAFTAR PUSTAKA
171. Bartram, Jammie & Balance, Richard., (1996). Water Quality Monitoring - A
Practical Guide to the Design and Implementation of Freshwater Quality Studies
and Monitoring Programmes.
http://www.who.int/water_sanitation_health/resourcesquality/wqmchap10.pdf.
172.
173. Fardiaz, S. (1992). Mikrobiologi Pangan I. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
174.
175. Hadioetomo, R. S., 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. PT Gramedia
Pustaka. Jakarta.
176.
177. Irianto, K. 2006. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme. CV Yrama
Media. Bandung.
178.
179. Merck, E. & Darmstadt. (1998).Handbook of microbiology 1st supplement.
Federal Republic Germany. Germany.
180.
181. Suriawiria, H.U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti. Jakarta.
182.
183. Waluyo, L. 2008. Teknik dan Metode Dasar dalam Mikrobiologi. UMM Press.
Malang
184. LAMPIRAN
185. 8.1. Perhitungan
186.
187. 8.1.1. Pour Plate
1
faktor pengencera n

188. Jumlah koloni per ml = jumlah koloni x


189. Kelompok A1 : Jumlah koloni per ml = 148 x
190.

= 1,48 x103

= 1,34 x104

10-1

191. Kelompok A2 : Jumlah koloni per ml = 134 x

20

10-2

192.

= 1,22 x105

= 1,2 x106

193. Kelompok A3 : Jumlah koloni per ml = 122 x


10-3

194.

195. Kelompok A4 : Jumlah koloni per ml = 120 x


10-4

196.

197. Kelompok A5 : Jumlah koloni per ml = 95 x

= 9,5 x106

= 5,2 x107

10-5

198.

199. Kelompok A6 : Jumlah koloni per ml = 52 x


10-6

200.
201.
202. 8.1.2. Spread plate

1
faktor pengencera n

203. Jumlah koloni per ml = jumlah koloni x

x 10

204.
205. Kelompok A1 : Jumlah koloni per ml = spreader
206.
207. Kelompok A2 : Jumlah koloni per ml = 288 x
1
208.
10-2
1

= 2,42 x105

= 1,5 x106

= 1,1 x107

209. Kelompok A3 : Jumlah koloni per ml = 242 x


10-3

210.

211. Kelompok A4 : Jumlah koloni per ml = 150 x


10-4

212.

213. Kelompok A5 : Jumlah koloni per ml = 110 x


10-5

214.
215.

= 2,88 x 104

Kelompok A6 : Jumlah koloni per ml = 80 x


216.

217. 8.1.3. Metode Most Probable Number (MPN)


218. Kelompok A1
219. Tabung yang positif = 2, 3, 0
220. Nilai MPN = 0,29

= 8 x107

10-6

21

1
faktor pengencera n yang ada di tengah
221. Jumlah koloni = nilai MPN x
1
10- 2
222.
= 0,29 x
223.
= 29
224.
225. Kelompok A2
226. Tabung yang positif = 2, 1, 2
227. Nilai MPN = 0,27

1
faktor pengencera n yang ada di tengah
228. Jumlah koloni = nilai MPN x
1
10- 2
229.
= 0,27 x
230.
= 27
231.
232. Kelompok A3
233. Tabung yang positif = 1, 2, 0
234. Nilai MPN = 0,11

1
faktor pengencera n yang ada di tengah
235. Jumlah koloni = nilai MPN x
1
10- 2
236.
= 0,11 x
237.
= 11
238.
239. Kelompok A4
240. Tabung yang positif = 2, 3, 1
241. Nilai MPN = 0,36

1
faktor pengencera n yang ada di tengah
242. Jumlah koloni = nilai MPN x
1
10- 2
243.
= 0,36 x
244.
= 36

22

245.
246. Kelompok A5
247. Tabung yang positif = 1, 3, 0
248. Nilai MPN = 0,16

1
faktor pengencera n yang ada di tengah
249. Jumlah koloni = nilai MPN x
1
10- 2
250.
= 0,16 x
251.
= 16
252. Kelompok A6
253. Tabung yang positif = 1, 1, 0
254. Nilai MPN = 0,074

1
faktor pengencera n yang ada di tengah
255. Jumlah koloni = nilai MPN x
1
10- 2
256.
= 0,074 x
257.
= 7,4
258.
258.2. Laporan Sementara