IDENTIFICACIN BIOQUMICA DE ESPECIES BACTERIANAS

PRACTICA 7
INTRODUCCIN
Las pruebas bioqumicas consisten en distintos test qumicos aplicados a medios
biolgicos, los cuales, conocida su reaccin, nos permiten identificar distintos
microorganismos presentes.
Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad
de una va metablica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de
cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no; junto con un sistema indicador
que puede detectar ya sea la declinacin del sustrato o la presencia de productos
metablicos especficos.
Para realizar las pruebas bioqumicas se dispone de mltiples medios, los cuales
se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio.
MARCO TERICO
Prueba de la Oxidasa
El objetivo de la prueba Oxidasa es buscar la presencia de la enzima Citocromo
C oxidasa. Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena
transportadora de e- . Este se detecta utilizando el tetra para fenilendiamina: el
reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la
citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a
prpura.
Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo
respiratorio oxidativo. Se considera positiva esta prueba cuando toma un color
prpura la muestra.
Prueba de la Catalasa
El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa El perxido de hidrgeno
se produce al utilizar la bacteria el azcar por va oxidativa. Al ser ste un
compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la produccin de la
enzima catalasa (H2O2 -> H2O + O2).
Prueba de la Coagulasa
La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. El
objetivo es buscar en factor de aglutinacin de los microorganismos cuando estos
se mezclan con el plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar microorganismos
del genero Staphylococcus.

Prueba MIO (Motility-Indole-Ornitine o Motilidad-Indol-Ornitina)

Esta prueba bioqumica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la
reaccin de Indol a la descarboxilacin de la ornitina.
Prueba TSI (Triple Sugar Iron o Triple Azcar Hierro)
El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de
produccin de cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un nico
medio. Tambin permite la identificacin de la produccin de SH2.
Esta es una prueba especfica para la identificacin a nivel de gnero en la familia
Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre:

bacterias fermentadoras de la glucosa.

bacterias fermentadoras de la lactosa.
bacterias fermentadoras de sacarosa.
bacterias aerognicas
bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgnicas que
contengan azufre.

Prueba LIA (Lysine Iron Agar o Agar Lisina Hierro)

Esta prueba permite diferenciar los microrganismo que producen descarboxilacin
o desafinacin de la lisina. Se pude detectar adems la produccin de SH2 y es
ms sensible que el TSI para la deteccin de SH2. Es muy utilizado para descartar
Salmonella de aislamientos primaros.
Agar Citrato
La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en la
identificacin de enterobacterias. La utilizacin de citrato como nica fuente de
carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como nica fuente de
carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. Este aumento de pH
se visualiza con el indicador azul de bromo timol que vira al alcalino a pH 7,6.
Indol
El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido
triptfano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y
desaminar el triptfano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La
produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de
muchas especies de microorganismos. La prueba de indol est basada en la
formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del

p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs

y Erlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptfano.
Rojo Metilo
Una de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los
diferentes gneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de
productos de fermentacin que se originan por la fermentacin de la glucosa. Se
conocen 2 tipos generales: La fermentacin cido-mixta y la fermentacin del 2,3
butanodiol. En la fermentacin cido mixta se forman fundamentalmente lctico,
actico y succnico, adems de etanol, H2 y CO2. En la va del butanodiol se
forman cantidades menores de cido (acetato y succinato) y los principales
productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de
pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la
produccin de cidos por la va de fermentacin cido mixto.
Vogues Proskauer
En la prueba de Voges-Proskauer se determina la va de fermentacin del
butanodiol descripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o
acetona) es un producto intermediario en la produccin de butanodiol. En medio
alcalino y en presencia de oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo. Este se
revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia.
OBJETIVOS
aprender a interpretar algunas de las pruebas bioqumicas de identificacin
bacteriana de mayor utilidad.
Aplicar la tcnica de agotamiento por estras para la obtencin de cultivos
puros.
Practicar las tcnicas de trasferencia de cultivos puros.
Identificar y conocer algunos medios tiles para la identificacin bioqumica
de bacterias.
Distinguir las diferentes pruebas bioqumicas y las caractersticas
principales que las diferencia.
Aprender a interpretar las pruebas bacterianas aplicadas y en que campos
profesionales son utilizadas.
Reconocer bacterias por sus actividades metablicas.
Materiales

microscopio
bacteria: salmonella thypi
agar SIM
agar TSA
caldo lactosado

agar TSI
caldo peptonado
Caldo glucosado (aceite)
Caldo glucosado (campana)
Cajas de Petri
Tubos de ensayo
Asas de siembra
Mechero

Resultados observados en el laboratorio

M.O

gram

Pruebas bioqumicas

Morfologa

TS
I

cat
ala
sa

coco

TS
I

Bacilo 3

TS
I

TS
I

Bacilo 2

TS
I

Bacilo 1

12

indol

11

PH lactico

10

gelatina

almidon

movilidad

azufre

Ondular

Entero

Convexo

plana

Amebo

1
Circular

S.
Thypi
E.
Coli
S.
Aureus
B.
Cereus

Colonia (TSA)

Tabla de resultados consultados

coco

otra

12
Bacilo 3

11

Bacilo 2

10

Bacilo 1

indol

PH lactico

gelatina

almidon

Cereus

movilidad

B.

azufre

Aureus

Ondu

S.

Entero

Coli

Morfologa

Conv

E.

Pruebas bioqumicas

plana

Thypi

gram

Amebo

S.

Colonia (TSA)
Circular

M.O

+ +

ca
TS TS TS TS TS tal
I
I
I
I
I as
a

PRACTICA 7
IDENTIFICACIN BIOQUMICA DE ESPECIES BACTERIANAS. SALMONELLA THYPI

MEDIO

INOCULAR CON:

RESULTADO ESPERADO

AGAR SIM

Con una asa recta, inocular

por puncin en el medio del
agar

Se observa un color negro ante la

presencia de H2S.
si el microorganismo crece por fuera de la
puncin se considera que es mvil

AGAR TSA

Siembra por agotamiento

Colonias aisladas

AGAR ALMIDN

Sembrar varias estras en el

centro de la caja de Petri.
Despus de 24 horas de
incubacin agregar gotas de
lugol

El Lugol reacciona y da un color morado

donde existe Almidn, si el lugol no tie el
agar donde creci la colonia se considera
amilasa positivo.

Las colonia de
lugol no cambio
almido

AGAR GELATINA

Tomar una muestra con el asa

y realizar una siembra por
puncin en el agar si este est
dispuesto en tubos.

Despus de 24 horas de incubacin pase

el tubo a la nevera (5C) y espere 1Hora.
Luego agite suavemente la gelatina, si le
medio se torn lquido se considera que el
microoganismo es gelatiniza +

Salmonella es g
torno liquida.

La salmonella p
por lo que se dic
puncion po

Salmo

CALDO
LACTOSADO

Inocular con el asa en argolla

El caldo lactosado tiene el indicador rojo

de fenol que se torna de color amarillo
cuando el medio se vuelve cido,
indicando la presencia de cido lctico,
tambin tiene un tubo invertido de Durham
que hace las veces de campana para
atrapar los gases producidos.

El rojo fenol cam

acido lctico por

AGAR TSI

Inocular con el asa recta

hasta la mitad del tubo.
La lactosa, sacarosa y
glucosa son los hidratos de
carbono fermentables. Por
fermentacin de azcares, se
producen cidos, que se
detectan por medio del
indicador rojo de fenol, el cual
vira al color amarillo en medio
cido. El tiosulfato de sodio se
reduce a sulfuro de hidrgeno
el que reacciona luego con
una
sal
de
hierro
proporcionando
el
tpico
sulfuro de hierro de color
negro.

1-Pico alcalino/fondo cido (pico rojo/fondo

amarillo): el M.O solamente fermenta la
glucosa.
2-Pico
cido/fondo
cido
(pico
amarillo/fondo amarillo): el M.O fermenta
glucosa, lactosa y/o sacarosa.
3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo
fondo rojo): el M.O es no fermentador de
azcares.
4-La presencia de burbujas, o ruptura del
medio de cultivo, indica que el M.O
produce gas.
5-El ennegrecimiento del medio indica que
el M.O produce cido sulfhdrico.

Salmonella en
produce gas p
espacio

PRUEBA Disolver una colonia La aparicin de espuma En la colonia disuelt

CATALASA en una gota de agua al contacto de la de catalasa por la pr
oxigenada al 30%.

colonia con el agua al contacto con agua

oxigenada revela la
presencia de catalasa.

OXIDACI
N
AEROBIA
DE
GLUCOSA
FERMENT
ACIN
ANAEROB
IA DE
GLUCOSA

Inocular con el asa en Se observa la aparicin Salmonella no oxida

argolla
de gas en la campana en la campana de
de Durhan.
presencia de gases
Viraje del medio.

Inocular con el asa en Se observa la aparicin Si hay presencia de

argolla
de gas por debajo del salmonella fermenta
tapn de vas-par que
muchas
veces
lo
desplaza hacia arriba

Comparacion de los resultados obtenidos en laboratorio y los consultados

Comparando los resultados obtenidos en laboratorio y los consultados tenemos
que para salmonella Thypi coisiden los dos resultados es decir:
Salmonella typhi pertenece a la familia de enterobacteriaceae, formado por basilos
gram negativos anaerobios facultativos, no desarrolan capsulas ni esporas, son
bacterias moviles que prodicen sulfuro de hidrogeno, fermentan glucosa esto se
debe a que posee una enzima especializada, pero no fermenata lactosa ni
ureasa. Es una bacilo primario.

Concluciones

Es importante resaltar que la prueba SIM permite mirar si un microrganismo es

mvil, si produce azufre y la produccin o la presencia de triptofanasa. El agar
TSA permite observar la morfologa de las colonias. El caldo lactosado permite
saber que bacterias producen acido lctico y cuales producen gases. el agar TSI
permite saber si alguna bacterias solamente fermenta glucosa, fermenta glucosa,
lactosa y / o sacarosa, es no fermentador de azucares, es productor de gas o
produce acido sulfhdrico. EL caldo peptonado es un indicador de crecimiento
bacteriano. la prueba catalasa permite ver la presencia de la enzima catalasa. La
prueba de oxidacin aerobica de glucosa permite saber si algn microrganismo
es oxidativo y la prueba de fermentacin anaerobia de glucosa que permite
saber si algn microrganismo es fermentativo
Para poder interpretar cada tipo de pruebas es necesario identificar que
caractersticas tiene la prueba como un indicador, la aparicin de algn tipo se
estructura (natas, velos), aparicin de espuma, aparicin de gas, aparicin de
algn anillo etc, ya que todas estas son especificas e identifican cada tipo de
prueba bioqumica.
Hay una gran variedad de pruebas bioqumicas que permiten el estudio de
microrganismos, las cuales se diferencian tanto por el principio que utilizan como
la fermentacin o la oxidacin o por los indicadores como en la prueba de indol, o
la produccin de gas como en el caldo lactosado.

Preguntas de consulta
1. Por qu es importante trabajar con cultivos puros?
En los ambientes naturales los microorganismos se encuentran usualmente como
poblaciones mixtas, pero si se necesita estudiarlos, caracterizarlos e identificarlos,
es fundamental tenerlos como cultivos puros.
2. qu reactivos utiliza la prueba de citocromo oxidasa?
El reactivo de la oxidasa ms recomendado es la solucin acuosa al 1% de
diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina.
3. En qu bacterias es til la prueba de reduccin de nitratos?
En bacterias capaces de reducir el nitrato en nitritos , que poseen la enzima
nitrato-reductasa
4. Para qu sirve el medio semislido de agar-indol-movilidad-acido
sulfhdrico?
El medio semislido de agar-indol-movilidad-acido sulfhdrico es un medio
semi-slido transparente que pone en evidencia la movilidad, la produccin de
triptofanasa y de SH2. Contiene:

Triptofano: la enzima triptofanasa, lo desdobla, produce indol, que se pone

de manifiesto con el reactivo de Erlich o Kovac
Citrato de hierro y amonio: los microorganismos productores de SH2
ennegrecen el medio de cultivo

Si los microorganismos son mviles, al ser ste un medio semi-slido se produce

enturbiamiento del medio de cultivo, caso contrario solo crece en la puncin.
5. Cul es la importancia del medio Hugh-leifson?
La importancia es que permite la determinacin del metabolismo oxidativo o
fermentativo de los carbohidratos. El medio de Hugh y Leifson contiene peptonas
e hidratos de carbono en una relacin 1:5. Al ser menor la concentracin de
peptonas, hay menor produccin de productos de oxidacin a partir de los AA que
tienden a elevar el pH y pueden neutralizar los cidos dbiles producidos por los
microorganismos no fermentadores.

6. Explique la importancia de la enzima coagulasa

la coagulasa es una enzima termoestable, que tiene la capacidad de convertir el
fibringeno del plasma en fibrina y es importante para diferenciar las especies del
gnero staphylococus.
7. Explique la reaccin enzima-sustrato, que es especificidad?
Las enzimas logran la disminucin de la energa de activacin de la reaccin, la
enzima adquiere las transformaciones qumicas y energticas que tiene lugar en
cada celula pero para realizar estas funciones bsicas debe tener una capacidad
de interaccionar de una forma especifica y reversible con liandos para que la
enzima modifique el sustrato, sta debe encajar en el lugar de la unin de la
enzima , es decir hay complementariedad geomtrica entre enzima sustrato, las
enzimas suelen ser muy especificas tanto de tipo de reaccin como de sustrato
involucrado
8. Porqu las pruebas bioqumicas guardan una relacin con los genes?
Las pruebas bioqumicas guardan una relacin con los genes por la presencia del
ADN, es decir en las diferentes pruebas bioqumicas se mantiene una relacin
con el ADN patrn de la herencia.

Bibliografia
BROCK BIOLOGIA DE LOS MICROORGANISMOS. 10 Edicion, Michaelt.Madigan, Jhon
M. Martinko, Jack Parker
http://britanialab.com.ar/esp/productos/b02/simedio.htm

http://www.laanunciataikerketa.com/trabajos/fregasuelos/medios.pdf
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/tsiagar.htm