Anda di halaman 1dari 35

Kromatografi kolom

Kromatografi kolom merupakan suatu metode pemisahan preparatif. Metode ini memungkinkan untuk melakukan
pemisahan suatu sampel yang berupa campuran dengan berat beberapa g. Pada prinsipnya kromatografi kolom adalah
suatu teknik pemisahan yang didasarkan pada peristiwa adsorpsi. Sampel yang biasanya berupa larutan pekat
diletakkan pada ujung atas kolom. Eluen atau pelarut dialirkan secara kontinyu ke dalam kolom. Dengan adanya
gravitasi atau karena bantuan tekanan, maka eluen/pelarut akan melewati kolom dan proses pemisahan akan terjadi.
Pelarut (fase gerak) yang paling cocok untuk pemisahan harus ditentukan melalui cara kromatografi lapis tipis terlebih
dahulu. Kecepatan pergerakan suatu komponen tergantung pada kemampuannya untuk tertahan atau terhambat oleh
penyerap di dalam kolom. Jadi suatu senyawa yang diserap lemah akan bergerak lebih cepat daripada yang diserap
kuat (Sastrohamidjojo, 1991)..
Kecepatan elusi sebaiknya dibuat konstan. Jika kecepatan elusi terlalu kecil maka senyawa-senyawa akan terdifusi ke
dalam eluen dan akan menyebabkan pita makin melebar yang akibatnya pemisahan tidak dapat berlangsung dengan
baik. Pada kromatografi kolom, tahap pengisian kolom dengan adsorben biasanya merupakan tahapan yang paling
sulit. Pengisian ini harus sehomogen mungkin dan harus benar-benar bebas dari gelembung udara. Permukaan
adsorben harus benar-benar horizontal, hal ini dilakukan untuk menghindari terjadinya cacat yang dapat terjadi selama
proses elusi berjalan (Sastrohamidjojo, 1991).
Pelarut pengelusi dibiarkan mengalir melalui kolom hingga terbentuk jalur-jalur serapan atau pita dari senyawasenyawa yang merupakan komponen suatu campuran. Setiap pita yang terlihat dikumpulkan dalam wadah yang
terpisah-pisah. Jika pita tidak kelihatan maka semua fraksinya harus ditampung pada selang waktu yang teratur. Setiap
fraksi dianalisis secara kromatografi kertas atau kromatografi lapis tipis untuk menentukan fraksi mana yang dapat
digabung (Sastrohamidjojo, 1991).
BAB I
PENDAHULUAN
A.

Latar Belakang

Kromatografi merupakan metode analisis campuran atau larutan senyawa kimia dengan absorpsi memilih
pada zat penyerap, zat cair dibiarkan mengalir melalui kolom zat penyerap, misalnya kapur, alumina dan semacamnya
sehingga penyusunnya terpisah menurut bobot molekulnya, mula-mula memang fraksi-fraksi dicirikan oleh warnawarnanya (Puspasari, 2010, hal: 159).
Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk memisahkan komponenkomponen dalam campuran. Alat tersebut berupa pipa gelas yang dilengkapi suatu kran di bagian bawah kolom untuk
mengendalikan aliran zat cair (Yazid, 2005, hal: 198).
Resin penukar ion adalah suatu senyawa polimer tinggi organik dimana terdapat gugusan fungsional yang
mengandung ion-ion yang dapat ditukar. Bila ion-ion yang dapat ditukar adalah anion maka disebut resin penukar
anion. Resin penukar ion tersebut biasanya dibuat berupa butir-butir bulat berupa ukuran (mesh) (Tim Dosen, 2012).
Berdasarkan uraian di atas, maka pembahasan berikut akan membahas tentang cara pemisahan dengan metode
kromatografi kolom.

B.

Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas, maka rumusan masalah pada percobaan ini adalah:
1.

Bagaimana cara pemisahan dengan metode kromatografi kolom?

2.
C.

Bagaimana menentukan nilai kapasitas resin penukar anion dalam sampel dengan metode kromatografi kolom?
Tujuan Percobaan

Tujuan pada percobaan ini adalah:


1.

Mengetahui cara pemisahan dengan metode kromatografi kolom

2.

Menentukan nilai kapasitas resin penukar anion dalam sampel dengan metode kromatografi kolom.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Istilah kromatografi berasal dari kata latin chroma berarti warna dan graphien berarti menulis. Kromatografi
pertama kali diperkenalkan oleh Michael Tsweet (1903) seorang ahli botani dari Rusia. Michael Tsweet dalam
percobaannya ia berhasil memisahkan klorofil dan pigmen-pigmen warna lain dalam ekstrak tumbuhan dengan
menggunakan serbuk kalsium karbonat yang diisikan ke dalam kolom kaca dan petroleum eter sebagai pelarut. Proses
pemisahan itu diawali dengan menempatkan larutan cuplikan pada permukaan atas kalsium karbonat, kemudian
dialirkan pelarut petroleum eter. Hasilnya berupa pita-pita berwarna yang terlihat sepanjang kolom sebagai hasil
pemisahan komponen-komponen dalam ekstrak tumbuhan (Alimin, 2007, hal: 73).
Kromatografi adalah proses melewatkan sampel melalui suatu kolom, perbedaan kemampuan adsorpsi
terhadap zat-zat yang sangat mirip mempengaruhi resolusi zat terlarut dan menghasilkan apa yang disebut
kromatogram (Khopkar, 2008, hal: 137).
Pemisahan kromatografi kolom adsorpsi didasarkan pada adsorpsi komponen-komponen campuran dengan
afinitas berbeda-beda terhadap permukaan fase diam. Kromatografi kolom adsorpsi termasuk pada cara pemisahan
cair-padat. Substrat padat (adsorben) bertindak sebagai fase diam yang sifatnya tidak larut dalam fase cair. Fase
bergeraknya adalah cairan (pelarut) yang mengalir membawa komponen campuran sepanjang kolom. Pemisahan
tergantung pada kesetimbangan yang terbentuk pada bidang antarmuka di antara butiran-butiran adsorben dan fase
bergerak serta kelarutan relatif komponen pada fase bergeraknya. Antara molekul-molekul komponen dan pelarut
terjadi kompetisi untuk teradsorpsi pada permukaan adsorben sehingga menimbulkan proses dinamis. Keduanya
secara bergantian tertahan beberapa saat di permukaan adsorben dan masuk kembali pada fase bergerak. Pada saat
teradsorpsi komponen dipaksa untuk berpindah oleh aliran fase bergerak yang ditambahkan secara kontinyu.
Akibatnya hanya komponen yang mempunyai afinitas lebih besar terhadap adsorben akan secara selektif tertahan.
Komponen dengan afinitas paling kecil akan bergerak lebih cepat mengikuti aliran pelarut (Yazid, 2005, hal: 199).
Teknik pemisahan kromatografi kolom dalam memisahkan campuran, kolom yang telah dipilih sesuai ukuran
diisi dengan bahan penyerap (adsorben) seperti alumina dalam keadaan kering atau dibuat seperti bubur dengan
pelarut. Pengisian dilakukan dengan bantuan batang pemanpat (pengaduk) untuk memanpatkan adsorben dengan gelas
wool pada dasar kolom. Pengisian harus dilakukan secara hati-hati dan sepadat mungkin agar rata sehingga terhindar
dari gelembung-gelembung udara. Untuk membantu homogenitas pengepakan biasanya kolom setelah diisi divibrasi,
diketok-ketok atau dijatuhkan lemah pada pelat kayu. Sejumlah cuplikan dilarutkan dalam sedikit pelarut, dituangkan
melalui sebelah atas kolom dan dibiarkan mengalir ke dalam adsorben. Komponen-komponen dalam campuran
diadsorpsi dari larutan secara kuantitatif oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada permukaan atas kolom, dengan
penambahan pelarut (eluen) secara terus-menerus, masing-masing komponen akan bergerak turun melalui kolom dan
pada bagian atas kolom akan terjadi kesetimbangan baru antara bahan penyerap, komponen campuran dan eluen.
Kesetimbangan dikatakan tetap bila suatu komponen yang satu dengan lainnya bergerak ke bagian bawah kolom
dengan waktu atau kecepatan berbeda-beda sehingga terjadi pemisahan. Jika kolom cukup panjang dan semua
parameter pemisahan betul-betul terpilih seperti diameter kolom, adsorben, pelarut dan kecepatan alirannya, maka
akan terbentuk pita-pita (zona-zona) yang setiap zona berisi satu macam komponen. Setiap zona yang keluar dari
kolom dapat ditampung dengan sempurna sebelum zona yang lain keluar dari kolom. Komponen (eluat) yang
diperoleh dapat diteruskan untuk ditetapkan kadarnya, misalnya dengan cara titrasi atau spektofotometri (Yazid, 2005,
hal: 200 201).

Teknik pemisahan kromatografi kolom partisi sangat mirip dengan kromatografi kolom adsorpsi. Perbedaan
utamanya terletak pada sifat dari penyerap yang digunakan. Pada kromatografi kolom partisi penyerapnya berupa
materi padat berpori seperti kieselguhr, selulosa atau silika gel yang permukaannya dilapisi zat cair (biasanya air).
Dalam hal ini zat padat hanya berperan sebagai penyangga (penyokong) dan zat cair sebagai fase diamnya. Fase diam
zat cair umumnya diadsorpsikan pada penyangga padat yang sejauh mungkin inert terhadap senyawa-senyawa yang
akan dipisahkan. Zat padat yang penyokong harus penyerap dan menahan fase diam serta harus membuat
permukaannya seluas mungkin untuk mengalirnya fase bergerak. Penyangga pada umumnya bersifat polar dan fase
diam lebih polar dari pada fase bergerak. Dalam kromatografi partisi fase bergeraknya dapat berupa zat cair dan gas
yang mengalir membawa komponen-komponen campuran sepanjang kolom. Jika fase bergeraknya dari zat cair, akan
diperoleh kromatografi partisi cair-cair. Teknik ini banyak digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa organik
maupun anorganik (Yazid, 2005, hal: 203 204).
Resin penukar ion adalah suatu bahan padat yang memiliki bagian (ion positif atau negatif) tertentu yang bisa
dilepas dan ditukar dengan bahan kimia lain dari luar.
Berdasarkan jenis ion/muatan yang dipertukarkan, resin dapat dibagi menjadi 2 yaitu resin penukar kation adalah ion
positif yang dipertukarkan dan resin penukar anion adalah ion negatif yang dipertukarkan. Ion Exchange adalah proses
penyerapan ion ion oleh resin dengan cara Ion-ion dalam fasa cair (biasanya dengan pelarut air) diserap lewat
ikatan kimiawi karena bereaksi dengan padatan resin. Resin sendiri melepaskan ion lain sebagai ganti ion yang
diserap. Selama operasi berlangsung setiap ion akan dipertukarkan dengan ion penggantinya hingga seluruh
resin jenuh dengan ion yang diserap (Clark, 2007).
Besarnya nilai kapasitas penukar dari resin penukar ion tergantung pada jumlah gugus ion yang dapat
ditukarkan yang terkandung dalam setiap gram bahan resin tersebut. Semakin besar jumlah gugus-gugus tersebut,
maka semakin besar pula nilai kapasitas resinnya. Besarnya nilai kapasitas resin diketahui agar dapat memperkirakan
berapa banyaknya resin yang diperlukan dalam analisa kimia dengan menggunakan metode kromatografi kolom.
Apabila resin telah mengikat jumlah ion yang sama dengan kapasitas maksimumnya maka resin tersebut dikatakan
telah exchausted. Dalam keadaan demikian resin dapat dikembalikan ke keadaan semula dengan jalan menuangkan
larutan asam yang agak pekat ke dalamnya sehingga terjadi reaksi kebalikan dari reaksi penukaran ion. Resin penukar
anion dapat berupa ko-polimer stiren dan divinil benzen tetapi tidak mengandung gugusan-gugusan amin yang bersifat
basa dengan resin penukar anion terjadi pengubahan yang jumlahnya ekuivalen (Tim Dosen, 2012).
BAB III
METODE PRAKTIKUM
A.

Waktu dan Tempat

Hari/ Tanggal

: Kamis/ 24 Mei 2012

Pukul

: 13.30 16.00 WITA

Tempat

: Laboratorium Kimia Analitik, Lantai I, Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar

B.

Alat dan Bahan

1.

Alat

a.

Neraca analitik

1 buah

b.

Resin kolom

1 buah

c.

Buret basa 50 mL

1 buah

d. Pipet volume 25 mL, 10 mL, 5 mL

1 buah

e.

1 buah

Pipet skala 25 mL

f.

Erlenmeyer 250 mL

4 buah

g.

Gelas kimia 250 mL

2 buah

h.

Petridisk

1 buah

i.

Bulp

1 buah

j.

Pipet tetes

1 buah

k.

Botol semprot

1 buah

2.

Bahan

a.

Aquades (H2O) 300 mL

b.

Indikator kalium kromat (K2CrO4)

c.

Kalium nitrat (KNO3) 0,25 M

d.

Perak nitrat (AgNO3) 0,1 M

e.

Resin penukar anion

f.

Tissue

C.

Prosedur Kerja

Prosedur kerja pada percobaan ini adalah:


1. Menimbang resin anion sebanyak 5,0049 gram ke dalam petridisk, lalu menambahkan aquades hingga semua
resin tertutupi aquades
2.

Mendiamkan selama 2-3 hari untuk mengaktifkan ion-ion yang ada pada resin.

3. Menyiapkan kolom, lalu menuangkan resin ke dalam kolom dan menambahkan aquades hingga semua resin
tertutupi aquades
4.

Menambahkan 125 mL larutan kalium nitrat (KNO3) sedikit demi sedikit

5.

Menampung efluen, lalu menambahkan indikator kalium kromat (K2CrO4)

6.

Menitrasi dengan perak nitrat (AgNO3) 0,1 M sampai terjadi perubahan warna.

7.

Mencatat volume titrasi.

8.

Melakukan percobaan 4 7 secara duplo.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

A.

Hasil Pengamatan

Bobot kosong petridisk

= 43,3485 gram

(a)

Bobot petridisk + resin kering

= 48,3534 gram

(b)

Bobot resin

=b - a
= 48,3534 gram 43,3485 gram
= 5,0049 gram

Volume titrasi AgNO3 0,1M (simplo)

= 12 mL

Volume titrasi AgNO3 0,1M (duplo)

= 6,5 mL

Warna sebelum + indikator

= tak berwarna

Warna setelah + indikator

= kuning

Warna setelah dititrasi (simplo)

= larutan kuning endapan putih

Warna setelah dititrasi (duplo)

= merah bata

B.

Reaksi
R+Cl + KNO3
AgNO3 + KCl

E.

R+NO3 + KCl
AgCl + KNO3

Pembahasan

Pada percobaan ini yaitu untuk mengetahui cara pemisahan dengan metode kromatografi kolom dan
menentukan kapasitas resin penukar ion. Resin anion ditimbang sebanyak 5,0049 gr dengan menggunakan neraca
analitik yang berfungsi untuk mengetahui bobot berat pada resin anion, selanjutnya merendam resin tersebut pada
petridisk dengan menggunakan aquades yang berfungsi untuk mengaktifkan ion-ion yang ada pada resin tersebut,
tahap perendaman dilakukan selama 2 3 hari. Selanjutnya resin anion dimasukkan ke dalam alat kolom dan
memasukkan larutan kalium nitrat (KNO3) sebanyak 125 mL secara perlahan-lahan yang berfungsi sebagai sampel
cair yang ion-ionnya akan bertukar dengan anion yang ada pada resin. Dalam hal ini ion nitrat (NO3-) yang akan
mengalami penukaran dengan anion klorida (Cl-) pada resin. Hasil dari sampel yang ionnya telah bertukar dinamakan
dengan efluen. Efluen tersebut ditambahkan dengan indikator kalium kromat (K2CrO4) yang berfungsi sebagai
penanda dalam batas volume tertentu akan mengalami titik akhir titrasi yang menunjukkan terjadinya perubahan
warna. Penggunaan kalium kromat (K2CrO4) sebagai indikator sebab kalium kromat (K2CrO4) merupakan indikator
khusus pada titrasi argentometri. Pada penitaran pertama, warna yang diperoleh pada saat terjadinya titik akhir titrasi
yaitu dari kuning menjadi larutan kuning endapan putih. Hal ini menunjukkan bahwa telah terjadi pertukaran anion
antara sampel kalium nitrat (KNO3) dan anion klor (Cl-) pada resin sebab adanya endapan putih menunjukkan ciri-ciri
dari sifat perak klorida (AgCl), sedangkan pada penitaran yang kedua, warna yang diperoleh pada saat terjadinya titik

akhir titrasi yaitu dari kuning menjadi merah bata. Hal ini menunjukkan bahwa resin tidak lagi bekerja dalam hal ini
tidak terjadi pertukaran anion antara sampel kalium nitrat (KNO3) dengan anion klorida (Cl-) yang ada pada resin.
Berdasarkan data di atas, volume titran yang diperoleh secara simplo yaitu 0,012 L dan kapasitas resinnya
sebanyak 2,397 x 10-4 mol/gr sedangkan volume titran yang diperoleh secara duplo yaitu 0,0065 L dan kapasitas
resinnya 1,298 x 10-4 mol/gr. Nilai kapasitas resin yang diperoleh menunjukkan bahwa ion-ion yang bertukar hanya
sedikit antara anion klorida (Cl-) yang ada pada resin dan kalium nitrat (KNO3). Dalam hal ini nilai kapasitas resin
dari resin penukar anion tergantung pada jumlah gugus ion yang dapat ditukarkan yang terkandung dalam setiap gram
bahan resin tersebut. Semakin besar jumlah gugus-gugus tersebut, maka semakin besar pula nilai kapasitas resinnya.
Besarnya nilai kapasitas resin diketahui agar dapat memperkirakan berapa banyaknya resin yang diperlukan dalam
analisa kimia dengan menggunakan metode kromatografi kolom.
BAB V
PENUTUP
A.

Kesimpulan

Kesimpulan pada percobaan ini adalah kapasitas resin yang diperoleh pada sampel dengan menggunakan metode
kromatografi kolom yaitu, 2,397 x 10-4 mol/gr dan 1,298 x 10-4 mol/gr.
B.

Saran

Saran pada percobaan ini adalah sebaiknya pada saat melakukan titrasi, tidak boleh melewati titik akhir titrasi,
sebab akan mempengaruhi hasil yang diperoleh. DAFTAR PUSTAKA
Alimin, dkk. Kimia Analitik. Makassar: Alauddin Press, 2007.
Clark, Jim. Ion Exchange. http://chem-is-try.org/diakses pada tanggal 24 Mei 2012.
Khopkar, SM. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI-Press, 2008.
Puspasari, Dian. Kamus Lengkap Kimia. Jakarta: Dwi Media Press, 2010.
Kromatografi Kolom
KROMATOGRAFI KOLOM

I. TUJUAN
Mempelajari cara pemisahan suatu campuran dengan kromotografi kolom.
II. TEORI
Kromatografi kolom adalah suatu metode pemisahan yang di dasarkan pada pemisahan daya adsorbsi suatu adsorben
terhadap suatu senyawa, baik pengotornya maupun hasil isolasinya. Sebelumnya dilakukan percobaan
tarhadap kromatografi lapis tipis sebagai pencari kondisi eluen. Misalnya apsolsi yang cocok dengan pelarut yang baik
sehingga antara pengotor dan hasil isolasinya terpisah secara sempurna.
Alat yang diinginkan adalah kolom gelas yang diisi dengan zat padat aktif sepertialumino dan selika gel
sebagai fase diam. Zat yang dimasukan lewat puncak kolom akan mengalir kedalam zat penyerap. Zat diserap dari
larutan secara sempurna oleh zat penyerapan berupa pita sempit pada ujung kolom dengan kecepatan yang berbeda,
sehingga terjadi pemisahan dalam kolom. Hasil pemisahan ini disebut kromatogram.
Umumnya pada kromatografi kolom digunakan campuran homogen seperti campuran gas dilakukan pada suatu
penyerap (absorbent). Komponen penyusun campur akan diserap oleh adsoben adalah 1 : 50.

Metode ini dapat memisahkan zat dari 100 mg sampai 5 mg bahkan lebih. Pemisahan campuran baik bila harga
Rf = 0.6. Teknik kromatografi kolom paling sesuai untuk pemisahan hasil isolasi dari pengotornya.
Pemisahan dengan kromatografi kolom biasanya digunakan absorben yang paling umum : alumunium oksida (Al2O3)
yang mempunyai daya absorsi atau kereaktifan yang diatur secara cepat sehingga penggunaan memberikan hasil yang
baik. Seberapa jauh komponen itu dapat diserap absorben tergantun pada sifat fisika komponen tersebut.
Bila campuran cairan dilakukan dengan kolom yang berisikan absorben, komponen cairan lainya akan mengalir
kebawah . Jadi semakin lemah kemungkinan cairan itu teradsopsi semakin cepat komponen itu mengalir ke bawah.
Bila kecepatan gerak cairan itu lebih besar dari pada kecepatran absorbsi oleh absorben.
Prinsip kerja kromatografi kolom adalah dengan adanya perbedaan daya serap dari masing-masing komponen,
campuran yang akan diuji, dilarutkan dalam sedikit pelarut lalu di masukan lewat puncak kolom dan dibiarkan
mengalir kedalam zat menyerap. Senyawa yang lebih polar akan terserap lebih kuat sehingga turun lebih lambat dari
senyawa non polar terserap lebih lemah dan turun lebih cepat. Zat yang di serap dari larutan secara sempurna oleh
bahan penyerap berupa pita sempit pada kolom. Pelarut lebih lanjut / dengan tanpa tekanan udara masin-masing zat
akan bergerak turun dengan kecepatan khusus sehingga terjadi pemisahan dalam kolom.
Kromatografi kolom dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya dapat dibedakan :

Kromatografi Fase Normal

Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya normal bersifat polar, misalnya silica
gel, sedangkan fase geraknya bersifat non polar.

Kromatografi Fase Terbalik

Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar, sedangkan fase geraknya bersifat polar; kebalikan
dari fase normal.
Cara pengisian kolom terbagi dua , yaitu :
1. Cara basah
-

Isi dasar kolom dengan kapas

Masukkan eluen

Campurkan dengan rata sebagai adsorben dan eluen menjadi homogen

Jangan tersentuh atau diguncangkan 6 jam

Setelah stabil, masukkan eluen dan zat, lalu keluarkan eluen

2. Cara kering
-

Isi tabung dengan kapas

Masukkan eluen

Masukkan adsorben kering sedikit demi sedikit

Lalu di aduk

Faktor yang mempengaruhi kecepatan gerak zat:

- Daya serap adsorben.


- Sifat pelarut.
- Suhu sistem kromotografi.
Kecepatan turunan sampel dipengaruhi oleh :

Tekanan didalam kolom semakin besar semakin cepat.

Panjang absorben, makin panjan makin cepat turunnya senyawa.

Ukuran artikel absorben.

Rongga udara dalam absorben.

Jika ada rongga udara dalam adsorben maka jalannya senyawa akan

terganggu.

Faktor yang mempengaruhi proses pemisahan:


-

Daya serap adsoben.

Jenis / sifat eluen.

Suhu kromatografi.

Pelarut yang digunakan.

III. PROSEDUR KERJA


3.1 Alat dan Bahan
Adapun bahan-bahan dan peralatan yang digunakan pada praktikum ini adalah sebagai berikut :
a.

Alat

Kolom kromatografi, alat gelas berupa kolom sebagai tempat fase diam dan media proses kromatografi.
Botol vial, botol kecil dengan volume 10 mL sebagai wadah penampung hasil pemisahan.
Standar dan klem, sebagai alat bantu untuk rangkaian alat kromatografi.
Gelas piala, sebagai wadah pelarut.
Batang pengaduk dan corong, sebagai alat bantu untuk mengalirkan pelarut ketika memasukkannya ke dalam
kolom.
b.

Bahan

Hasil ekstrak buah naga (pada objek sokletasi) sebagai sampel uji.
Silika sebagai bahan untuk fase diam.
Eluent / fase gerak, berupa campuran heksan dengan etil asetat dengan perbandingan tertentu.
Kapas, sebagai bahan pembatas dan penahan pada serbuk silika
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1

Hasil dan Data

Dari praktikum Kromatografi Kolom yang dilakukan didapatkan data-data sebagai berikut :
Sampel

: ekstrak buah naga (hasil dari objek sokletasi).

Jenis Eluen

: campuran heksan dengan etil asetat, dengan sistem SGP


(step gradien polarity)

Tabel Pengamatan.

No. Perbandinga Heksan : Etil


Asetat

Warna Zat

10:0

bening

8:2

bening

6:4

Orange muda

4:6

orange muda

2:8

orange

0:10

orange

4.2 Pembahasan
Pemisahan ekstrak buah naga ini dilakukan dengan metode kromatografi kolom, dengan sistem pelarut SGP (Step
Gradieny Polarity). Langkah ini diambil karena belum diketahui jenis eluen yang cocok dengan pemisahan ini.
Sistem pelarut SGP dilakukan dengan cara menggantikan / mengubah kepolaran dari eluen yang digunakan secara
bertahap. Eluen tersebut merupakan campuran dua jenis pelarut dengan kepolaran berbeda. Dengan mengubah
perbandingan campurannya kita dapat menggeser tingkat kepolaran dari eluen ini. Pada pengerjaannya di awali
dengan satu jenis pelarut yaitu berupa heksan saja, kemudian digeser tingkat kepolarannya dengan mencampurkannya
dengan pelarut etil asetat. Pencampuran dilakukan dengan perbandingan yang divariasikan secara bertahap, hingga
diakhiri dengan hanya menggunakan etil asetat saja sebagai eluen. Dengan ini diharapkan dapat memberikan
pemisahan yang lebih baik.
Eluen dialirkan untuk pemisahan komponen dengan kecepatan alir sekitar 100 tetesan per menitnya. Aliran eluen
diatur agar tidak terlalu cepat agar komponen dapat terpisah dengan. Alirannya pun diusahakan tidak terlalu lambat
agar proses tidak terlalu lama. Eluen mengalir mengelusi sampel menyusuri fase diam di sepanjang kolom dengan
memanfaatkan gaya gravitasi.
Dengan adanya perubahan tingkat kepolaran secara bertahap, keterikatan komponen terhadap pelarut dan keterikatan
masing-masing komponen terhadap fase diam akan berubah-ubah, sesuai dengan sifat-sifat masing-masing
komponen.. Komponen ini dibawa oleh pelarut dan tertampung pada vial penampung. Hasil pemisahan dapat
diakumulasikan dan masih dalam keadaan terlarut dalam pelarut. Kita bisa saja mendapatkan komponen murninya
dengan pemekatan, meskipun hasilnya tidak terlalu banyak.

Untuk lebih memastikan tingkat kemurnian dari hasil pemisahan dapat kita uji dengan metode Kromatografi Lapisan
Tipis. Hasil yang ada pada masing-masing vial tersebut kita uji dengan KLT sehingga bisa kita lihat apakah pada
masing-masing benar-benar hanya mengandung satu komponen.
Kelebihan dari metode ini jika dibandingkan dengan KLT adalah bahwa kita dapat melakukan pemisahan untuk
sampel dengan jumlah yang lebih banyak. Di samping itu, kita juga bisa memperoleh hasil pemisahan tersebut dan
menampungnya.
Proses pemisahan pada kromatografi kolom ini bisa dikatakan sebagai bentuk sederhana dari teknik kromatografi yang
dilakukan dengan instrument kinerja tinggi. Kita juga bisa melakukan pemisahan dengan jenis eluen lain, atau dengan
jenis absorben lainnya. Kolom di sini hanya sebatas berfungsi sebagai wadah. Bahan yang digunakan sebagai fase
diam dapat berupa macam, baik itu dengan memanfaatkan prinsip partisi ataupun absorbsi.
V. KESIMPULAN DAN SARAN
5.1

Kesimpulan

Setelah melakukan praktikum ini dapat disimpulkan bahwa dengan kromatografi kolom kita dapat memisahkan
komponen penyusun dari suatu sampel bahan alam. Hasil pemisahannya disimpan dalam 6 botol vial secara terpisah
untuk masing-masing jenis eluen.
5.2

Saran

Belum dapat dipastikan apakah pada masing-masing vial benar-benar hanya terdapat satu jenis komponen. Untuk
lebih memastikan kita dapat menguji masing-masing vial dengan menggunakan metode Kromatografi Lapisan Tipis.
Tugas Sebelum Pratikum
1.

Bagaimana cara memilih eluen untuk kromatografi kolom?

Jawab :
Dengan meneteskan pada plat lapis tapis, jika KLT hasilnya bagus dari totolan suatu zat dan berbentuk bulatan maka
eluen tersebut baik untuk kromatografi kolom.
2.

Faktor-faktor apa saja yang mempengaruhi proses pemisahan?

Jawab :
-

Pemilihan adsorben sebagai fase diam

Kepolaran pelarut yang akan dipisahkan

Laju elusi atau aliran fase gerak

3.

Jelaska metoda pengelusian yang digunakan pada kromatografi kolom!

Jawab :
a.
Step graden polarity, dimana noda yang tampak sehingga hasil kromatografi kolom pada plat KLT sangat
berdekatan.
b.
Kokratik, dimana noda yang tampak sehingga hasil kromatografi kolom pada plat KLT berimpit dengan
kepolaran.

DAFTAR PUSTAKA
http://asyharstf08.wordpress.com/2010/02/25/kromatografi-kolom-dan-lapis-tipis

http://wiro-pharmacy-blogspot.com/2009/10/kuliah-kromatografi-kolom-bagian
1.html

http://www.chem-is-try.org/materi_kimia/kimia_dasar/pemurnian_material/
kromatografi

http://www.chem-is-try.org/wp-content/migrated_images/analisis/ column1.gif

laporan fitokimia kromatografi kolom

LAPORAN PRAKTIKUM FITOKIMIA II


Isolasi dan Idendtifikasi Fraksi Aktif dari Ekstrak Daun Bunga Terompet(Mandevillae sanderi) menggunakan
Kromatografi Kolom Konvensional,Kromatografi Cair Vakum dan
Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

BAB I
PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Istilah kromatografi mula-mula ditemukan oleh Michael Tswett (1908), seorang ahli botani Rusia. Nama kromatografi
diambil dari bahasa Yunani (chromato = penulisan dan grafe = warna). Kromatografi berarti penulisan dengan warna.
Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen campuran
tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (stationary) dan fasa bergerak (mobile). Fasa diam dapat berupa zat padat
atau zat cair, sedangkan fasa bergerak dapat berupa zat cair atau gas. Teknologi yang penting untuk analisis dan
pemisahan preparatif pada campuran bahan adalah prinsip dasar kromatografi.
Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan senyawa yang akan
dipisahkan.Kromatografi digunakan sebagai untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponenkomponennya, misalnya senyawa Flavonoida yang terdapat pada tahu, tempe, bubuk isoflavon memiliki banyak
manfaat.
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan
mengetahui kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan
sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya.
KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida lipida dan
hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk
kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi,
dan isolasi senyawa murni skala kecil.

Beberapa kelabihan senyawa isoflavon yang potensial bagi kesehatan manusia, diantaranya adalah sebagai
antioksidan, antitumor / antikanker, antikolestrol, antivirus, antialergi, dan dapat mencegah osteoporosis. Dan semua
kromatografi bekerja berdasarkan metode kromatografi.
I.2 Maksud dan Tujuan
I.2.1 Maksud
Adapun maksud dari praktikum ini adalah
1.
Untuk mengetahui dan memahami cara pemisahan senyawa pada ekstrak daun bunga terompet (Mandivella
sanderi)menggunakan kromatografi kolom konvensional.
2.
Untuk mengetahui dan memahami cara memisahkan sampelekstrak daun bunga terompet (Mandivella
sanderi) denganmenggunakan kromatografi kolom cair vakum.
3.
Untuk mengetahui dan memahami metode penentuan komponen kimia secara kromatografi lapis tipis preparatif
yang terdapat dalam fraksi kasar n-heksan daun bunga terompet (Mandivella sanderi)
1.2.2 Tujuan
Adapun tujuan dilakukannya percobaan kali ini adalah
1.
Untuk menentukan nilai Rf masing-masing noda kromatogram dari sampel ekstrak daun bunga
terompet(Mandivella sanderi) dengan menggunakan meode kromatografi kolom konvensional
2.
Untuk menentukan nilai Rf masing-masing noda kromatogram dari sampel ekstrak daun bunga
terompet(Mandivella sanderi) dengan menggunakan meode kromatografi kolom cair vakum
3.
untuk memisahkan campuran senyawa dalam fraksi kasar n-heksan daun bunga terompet (Mandivella
sanderi) dengan metode kromatografi lapis tipis praparatif dan untuk mengetahui nilai Rf.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Klasifikasi Ilmiah (http://www.plantamor.com/index.php?plant=1940)
Kingdom

Plantae (Tumbuhan)

Subkingdom

Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh)

Super Divisi

Spermatophyta (Menghasilkan biji)

Divisi

Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga)

Kelas

Magnoliopsida (Berkeping dua / dikotil)

Sub Kelas

Asteridae

Ordo

Gentianales

Famili

Apocynaceae

Genus

Mandevilla

Spesies

Mandevilla sanderi

Ciri - ciri Umum Bunga Terompet

Bunga terompet merupakan tumbuhan berkeping dua/ dikotil.Berikut ini ciri-ciri dari bunga terompet,
yaitu(http://deztriya.blogspot.com/2012/04/tumbuhan-biji-terbuka-dan tertutup.html) :
Ciri Umum

Penjelasan

Biji

Biji mempunyai lembaga dengan 2 lembaga

Lembaga/ kecambah Akar lembaga tumbuh terus menjadi akar tungggang yang
bercabang-cabang dan akhirnya membentuk sistem akar tunggang
Ujung akar lembaga dan ujung pucuk lembaga tidak mempunyai
pelindung khusus
Batang

Batang dari pangkal ke ujung seperti kerucut panjang, bercabangcabang, buku-buku dan ruas tidak jelas

Daun

Daun tunggal atau majemuk, seringkali disertai daun penumpu,


jarang mempunyai upih

Daun duduknya tersebar atau berkarang

Tulang daun menjari atau menyirip

Bunga

Bagian-bagian bunga berjumlah 2, 4 atau 5

Anatomi

Baik akar maupun batang mempunyai kambium, sehingga dapat


tumbuh membesar (pertumbuhan sekunder)

Letak berkas pembuluh melingkar

Mandevilla Sandersi tanaman rambat berbunga dengan banyak pilihan warna.Tanaman rambat memang banyak
digunakan untuk menciptakan suasana rumah yang asri. Disitu memang tanaman rambat akan lebih mendukung
konsep tersebut karena mampu tumbuh rimbun dan mempunyai bunga yang berwarna cerah. Kesan yang muncul
selain teduh juga mampu memberikan kombinsai warna yang menawan. Mandevilla sendiri disebut juga sebagai
bunga terompet karena bunga yang muncul mirip seperti terompet. Tanaman ini diyakini berasal dari wilayah Florida,
Amerika Serikat dengan kombinasi warna yang beragam mulai dari merah, putih, dan pink. Bentuk kelopak juga
cukup beragam salah satunya mampu tumbuh menumpuk seperti halnya adenium dokson atau bunga mawar. Tanaman
yang cukup melegenda di dunia landscape dan eksterior ini mempunyai karakter membutuhkan sinar matahari penuh
untuk tumbuh. Kondisi ini tentu sangat cocok dengan fungsi tanaman sebagai naungan. Apalagi bila lokasi rumah
berada di daerah perkotaan yang punya suhu udara sangat panas.
Menurut Badrun Sutiyuko dari Aghissa Florist Banjarmasin yang menjual mandevilla, tanaman ini meski berasal dari
wilayah yang dingin namun bisa tumbuh baik dengan lingkungan yang panas. Bahkan semakin banyak terkena sinar
matahari warna yang muncul akan makin cerah. Secara fisiologis tanaman ini hampir tidak berbeda dengan tanaman
merambat lainnya yaitu punya batang yang menjulur dan akar yang menempel pada tempat naungan. Kelebihan yang
paling menonjol pada tanaman ini adalah bentuk bunga yang cukup besar. Meski disebut juga sebagai bunga terompet
namun bentuk kelopak bunga juga hampir mirip dengan kembang sepatu (hibiscus rosa-sinensis L.)
Tanaman yang di luar negeri juga disebut sebagai brazilian jasmine ini punya bentuk yang cukup menarik dimana
untuk kelopak bunga akan memutar dan menutup satu dengan lainnya. Bunga akan muncul diujung tangkai sehingga
semakin rimbun tanaman maka bunga akan muncul makin banyak dan serempak (bunga kompak).
Pada bagian daun mandevilla punya karakter yang meruncing dengan serat daun yang menonjol. Disini daun yang
tumbuh tidak terlalu mendominasi dibandingkan mekarnya bunga. Tidak seperti tanaman rambat lainnya yang lebih
mendominasi adalah daun sementara bunga hanya muncul di beberapa bagian saja.

Tanaman yang masuk dalam keluarga apocynaceae ini memang membutuhkan sinar matahari secara penuh untuk
tumbuh. Sehingga saat menanam mandevilla diusahakan menghadap ke arah timur atau barat untuk mendapatkan sinar
matahari yang bagus. Keunikan lain tanaman ini adalah mampu berbunga terus tanpa henti dalam satu tahunnya.
Untuk kelangsungan hidup tanaman ini juga mampu tumbuh dengan baik meski sudah berusia antara 3-4 tahun. Jelas
kelebihan ini jauh dari jenis tanaman lainnya yang mati setelah berbunga. Bahkan selain merambat mendevilla juga
bisa tumbuh secara menjuntai karena mempunyai batang yang lemas.
Manfaat bunga terompat, biasanya digunakan akar,daun dan bunga terompet untuk obat-obatan.Bunga
terompet memiliki getah berwarna putih, getah bunga terompet memilki manfaat untuk pencegah kuman/bakteri dan
juga obat penyakit kanker.
Bunga terompet mengandung Hyoscyamine, atropine, scopolamine, sebagai zat anticholinergics (zat penghilang
kesadaran).Selain memilki warna kuning juga ada bunga terompet berwarna putih, merah muda, ungu, orange melalui
stek ataupun penyilangan.
Ciri-ciri Bunga Terompet, Bunga terompet memiliki bentuk bunga yang dapat mencapai ukuran diameter 5-7,5
cm, Bunga terompet mampu tumbuh sampai lebih dari 2 meter, Bunga terompet memilki tangkai bungaberwarna hijau
muda dan mempunyai daun agak kasar, Bunga terompet mekar setiap tahun.
Istilah kromatografi mula-mula ditemukan oleh Michael Tswett (1908), seorang ahli botani Rusia. Nama kromatografi
diambil dari bahasa Yunani (chromato = penulisan dan grafe = warna). Kromatografi berarti penulisan dengan warna.
Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen campuran
tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (stationary) dan fasa bergerak (mobile). Fasa diam dapat berupa zat padat
atau zat cair, sedangkan fasa bergerak dapat berupa zat cair atau gas (Yazid, 2005).
Kromatografi adalah proses melewatkan sampel melalui suatu kolom, perbedaan kemampuan adsorpsi terhadap zatzat yang sangat mirip mempengaruhi resolusi zat terlarut dan menghasilkan apa yang disebut kromatogram (Khopkar,
2008)
1.

Kromatografi Kolom Konvensional

Kromatografi kolom adalah suatu metode pemisahan yang di dasarkan pada pemisahan daya adsorbsi suatu adsorben
terhadap suatu senyawa, baik pengotornya maupun hasil isolasinya. Sebelumnya dilakukan percobaan tarhadap
kromatografi lapis tipis sebagai pencari kondisi eluen. Misalnya apsolsi yang cocok dengan pelarut yang baik
sehingga antara pengotor dan hasil isolasinya terpisah secara sempurna (Kasiman, 2006).
Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom, penjerap
yang berada dalam tabung kaca, tabung logam atau bahkan tabung plastik. Pelarut (fase gerak0, dibiarkan mengalir
melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau di dorong dengan tekanan. Pita senyawa linarut
bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari atas
kolom (Sudjadi, 1986).
Kromatografi kolom dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Vakum
dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi dan siap di
pakai. Cuplikan dilarutkan dalam pelarut yang cocok, dimasukkan langsung pada bagian atas kolom atau pada lapisan
prapenjerap dan dihisap perlahan-lahan kedalam kemasan dengan memvakumkannya. Kolom dielusi dengan
campuran pelarut yang cocok, kolom dihisap sampai kering pada setiap pengumpulam fraksi (Sudjadi, 1986).
Kolom keromatografi atau tabung untuk pengaliran karena gaya tarik bumi (gravitasi) atau sistem bertekanan rendah
biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi dengan kran. Ukuran keseluruhan kolom beragam, tetapi biasanya
panjangnya sekurang-kurangnya 10 kali garis tengah dalamnya dan mungkin juga sampai 100 kalinya. Nisbah panjang
terhadap lebar sebagian besar ditentukan oleh mudah sukarnya pemisahan, nisbah lebih besar untuk pemisahan yang
lebih sukar. Ukuran kolom dan banyaknya penjerap ditentukan oleh bobot campuran linarut yang akan dipisahkan.
Sifat, derajat, atau tingkat keaktifan penjerap, dan ukuran partikelnya betul-betul penting dalam pengembangan sistem

kromatografi. Ukuran penjerap biasanya lebih besar daripada untuk KLT. Kemasan kolom biasanya 63-250 mikro
meter untuk kolom yang dijalankan oleh gaya gravitasi (Raymond, 2006).
Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang masih banyak digunakan. Kromatografi kolom
digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah yang banyak berdasarkan adsorpsi dan partisi.
Kemasan adsorben yang sering digunakan adalah silika gel G-60, kieselgur, Al2O3, dan Diaion. Cara pembuatannya
ada dua macam (Hargono, 1986):
1. Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang telah diberi kapaskemudian ditambahkan cairan
pengelusi.
2. Cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan dengan cairan pengelusi yangakan digunakan kemudian
dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom secarakontinyu sedikit demi sedikit hingga masuk semua, sambil
kran kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga silika gel mapat, setelah silika gel mapat eluen dibiarkan mengalir sampai
batas adsorben kemudian kran ditutup dan sampel dimasukkan yang terlebih dahulu dilarutkan dalam eluen sampai
diperoleh kelarutan yang spesifik. Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding kolom
sedikit demi sedikit hingga masuk semua, dan kran dibuka dan diatur tetesannya, serta cairan pengelusi ditambahkan.
Tetesan yang keluar ditampung sebagai fraksi-fraksi.
Kolom dapat dibuat dari berbagai jenis material, seperti stainless steel, aluminium, tembaga, gelas dan paduan silika.
Sebagian besar sistem kolom modern terbuat dari gelas atau paduan silika. Kolom konvensional dibuat dari material
pendukung yang dilapisi fase diam dari berbagai pembebanan yang dikemas di dalam kolom. Kolom kapiler terdiri
dari tabung kapiler panjang yang didalamnya dilapisi dengan fase diam (fase diam dapat juga direkatkan langsung
pada permukaan silika). Sebagian besar kolom kapiler terbuat dari paduan silika yang dilapisi polimer di bagian
luarnya. Paduan silika sangat mudah pecah sedangkan lapisan polimer tersebut bertindak sebagai pelindungnya (Seno,
1997).
Prinsip kerja kromatografi kolom adalah dengan adanya perbedaan daya serap dari masing-masing komponen,
campuran yang akan diuji, dilarutkan dalam sedikit pelarut lalu di masukan lewat puncak kolom dan dibiarkan
mengalir kedalam zat menyerap. Senyawa yang lebih polar akan terserap lebih kuat sehingga turun lebih lambat dari
senyawa non polar terserap lebih lemah dan turun lebih cepat. Zat yang di serap dari larutan secara sempurna oleh
bahan penyerap berupa pita sempit pada kolom. Pelarut lebih lanjut / dengan tanpa tekanan udara masin-masing zat
akan bergerak turun dengan kecepatan khusus sehingga terjadi pemisahan dalam kolom (Seno, 1997).
2. Kromatografi Cair Vakum
Kromatografi Suction Column and Vacuum liquid chromatography (VLC) atau kromatografi cair
vakum (KCV) adalah bentuk kromatografi kolom yang khususnya berguna untuk fraksinasi kasar yang cepat terhadap
suatu ekstrak. Kondisi vakuma adalah alternatif untuk mempercepat aliran fase gerak dari atas ke bawah. Metode ini
sering digunakan untuk fraksinasi awal dari suatu ekstrak non-polar atau ekstrak semipolar (Raymond, 2006).
Suction coloumn merupakan alat kromatografi yang merupakan modifikasi kromatografi kolom serapan. Prinsip
pemisahannya sama dengan kromatografi kolom serapan. Bedanya terletak pada adanya isapan pompa vakum di
bagian bawah kolom ini. Alat ini dirancang mengingat pada kromatografi kolom serapan yang pengerjaannya
memakan waktu yang cukup lama. Prinsip pemisahan komponen kimia berdasarkan adsorpsi dan partisi serta
dipercepat dengan isapan pompa vakum. Seperti halnya kromatografi kolom serapan, senyawa yang akan dipisahkan
dilarutkan dengan pelarut yang cocok kemudian dimasukkan dalam kolom isap, selanjutnya ditambahkan eluen, eluen
yang mengalir turun yang disebabkan oleh isapan pompa vakum. Hasil pemisahan ditampung dalam setiap fraksi.
Volume penampungan 25 ml/fraksi dan untuk berat sampel q 10 - 30 gram volume penampungan 50 ml/fraksi.
Adsorben yang digunakan sedikit lebih berbeda yaitu 35 gram silica gel 7733 dan 10 gram silika gel 7731 (Gritter,
1991).
Manfaat dari kromatografi ini yaitu menentukan ciri senyawa aktif penyebab efek racun atau efek yang bermanfaat,
yang ditunjukkan oleh ekstrak tumbuhan kasar bila diuji dengan sistem biologi. Dalam hal ini kita harus memantau
cara ekstraksi dan pemisahan pada setiap tahap, yaitu untuk melacak senyawa aktif tersebut sewaktu dimurnihkan.

Kadang-kadang keaktifan hilang selama proses fraksinasi akibat ketidakmantapan senyawa itu, dan akhirnya mungkin
saja diperoleh senyawa berupa kristal tetapi keaktifan seperti yang ditunjukkan oleh ekstrak asal(Harborne, 1987).
Fasa diam yang digunakan dikemas dalam kolom yang digunakan dalam KCV. Proses penyiapan fasa diam dalam
kolom terbagi menjadi dua macam, yaitu(Sarker, 2006):
a)

Cara Basah

Preparasi fasa diam dengan cara basah dilakukan dengan melarutkan fasa diam dalam fase gerak yang akan
digunakan. Campuran kemudian dimasukkan ke dalam kolom dan dibuat merata. Fase gerak dibiarkan mengalir
hingga terbentuk lapisan fase diam yang tetap dan rata, kemudian aliran dihentikan.

b) Cara kering
Preparasi fasa diam dengan cara kering dilakukan dengan cara memasukkan fase diam yang digunakan ke dalam
kolom kromatografi. Fase diam tersebut selanjutnya dibasahi dengan pelarut yang akan digunakan.
Preparasi sampel cara basah dilakukan dengan melarutkan sampel dalam pelarut yang akan digunakan sebagai fasa
gerak dalam KCV. Larutan dimasukkan dalam kolom kromatografi yang telah terisi fasa diam. Bagian atas dari
sampel ditutupi kembali dengan fasa diam yang sama. Sedangkan cara kering dilakukan dengan mencampurkan
sampel dengan sebagian kecil fase diam yang akan digunakan hingga terbentuk serbuk. Campuran tersebut diletakkan
dalam kolom yang telah terisi dengan fasa diam dan ditutup kembali dengan fase diam yang sama (Sarker, 2006).
Kromatografi Vakum Cair mempunyai keuntungan yang utama dibandingkan dengan kolom konvensional yaitu
(Kasiman, 2006):
1. Konsumsi fase gerak KCV hanya 80% atau lebih kecil disbanding dengan kolom konvensional karena pada
kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100l/menit).
2. Adanya aliran fase gerak lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spectrometer
massa.
3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih pekat karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat
jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

3. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif


Kromatografi dalam bidang kimia merupakan sebuah tehnik analisis yang digunakan untuk memisahkan sebuah
campuran ataupun persenyawaan kimia. Tehnik ini ditemukan pada tahum 1906 oleh Mikhail Tswett seorang ahli
botani dari Italia yang lahir di Rusia. Tehnik pemisahan ini dilakukan terhadap pigmen tumbuhan (klorofil), dengan
cara menuangkan ekstrak petroleum eter dari daun tumbuhan diatas sebuah kolom kaca yang berisi serbuk kalsium
karbonat dalam arah yang tegak lurus (Najib, 2013).
Dalam perkembangan selanjutnya metode ini tidak hanya digunakan untuk mengidentifikasi noda, akan tetapi juga
untuk mengisolasi ekstrak. Metode ini kemudian dikenal sebagai KLT preparatif. Metode ini paling sederhana dan
murah untuk mengisolasi komponen kimia dari suatu bahan alam, dengan menggunakan lempeng yang besar terbuat
dari kaca dengan ukuran 20 x 20 cm (Najib, 2013).
Metode kerjanya meliputi penotolen ekstrak bahan alam dalam bentuk pita pada lempeng. Hal ini memungkinkang
sampel dalam jumlah besar dapat muat pada lempeng KLT, lempeng dikembangkan dalam pelarut yang telah
diketahui mampu memisahkan komponen, yang paling penting adalah harus digunakan metode deteksi yang tidak
merusak sampel (Najib, 2013).

Pada KLT preparatif, cuplikan yang akan dipisahkan ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi plat lapisan besar dan
dikembangkan secara tegak lurus pada garis cuplikan sehingga campuran akan terpisah menjadi beberapa pita. Pita
ditampakkan dengan cara yang tidak merusak jika senyawa itu tahan warna, dan penjerap yang mengandung pita
dikerok dari plat kaca. Kemudian cuplikan dielusi dari penjerap dengan pelarut polar. Cara ini berguna untuk
memisahkan campuran reaksi sehingga diperoleh senyawa murni untuk telaah pendahuluan, untuk menyiapkan
cuplikan analisis, untuk meneliti bahan alam yang lazimnya berjumlah kecil dan campurannya rumit, dan untuk
memperoleh cuplikan yang murni untuk mengkalibrasi KLT kuantitatif (Gritter, 1991).
Keuntungan KLTP adalah salah satu metode pemisahan yang memerlukan pembiayaan paling murah dan memakai
peralatan paling dasar. Kerugian KLTP adalah pengambilan senyawa dari plat yang dilanjutkan dengan
pengekstraksian penjerap memerlukan waktu lama dan jika senyawa beracun harus dikerok dari plat akan
menimbulkan banyak masalah serius. Serta adanya zat pencemar dan sisa dari plat sendiri setelah pengsekstraksian
pita yang mengandung senyawa yang dipisahkan dengan pelarut (Hostettmann, 1995).
Metode kromatografi, karena pemanfaatannya yang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan
preparative. Hampir setiap campuran kimia, mulai dari bobot molekul rendah sampai tinggi, dapat dipisahkan menjadi
komponen-komponennya dengan beberapa metode kromatografi. Jenis pemisahan, apakah analitik atau preparatif,
tidak ditentukan oleh ukuran cuplikan, melainkan lebih oleh keperluan khusus. Biasanya, kromatografi analitik
dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan, dan kromatografi hanya dilakukan jika diperlukan fraksi murni
dari campuran (Gritter, 1991).

Kadang-kadang kita berhasil memisahkan campuran tertentu dengan beberapa kali pengembangan memakai sistem
pelarut yang sama yang nisbi nonpolar, padahal campuran itu tidak dapat dipisahkan dengan sekali pengembangan
yang memakai sistem pelarut yang lebih polar. Jumlah cuplikan lebih banyak dapat dipisahkan dengan cara
pengembangan berganda sehingga hal ini sangat penting pada KLT preparatif (Gritter, 1991).
Kromatografi pada lapisan berbentuk khusus. Kadang-kadang lapisan KLT perlu diraut menjadi berbagai bentuk. Pada
lapisan belandas kaca, bentuk itu dapat dibuat dengan spatula atau alat yang diruncing. Lapisan berlandas plastik dapat
dipotong-potong memakai gunting (Gritter, 1991).
Ketika pelarut muncul dari bagian lapisan yang sempit (tempat menotolkan cuplikan), pelarut dipaksa bergerak
menyamping dan sekaligus menegak. Ini berarti cuplikan akan berbentuk pita, bukan bercak bundar. Pita ini lebih
tajam dan lebih mudah dilihat, dan kita dapat menunjukkan komponen yang lebih banyak (Gritter, 1991).

Kristalisasi

Kristalisasi digunakan untuk mendapatkan bahan dalam bentuk Kristal murni.Oleh karena itu pembentukan Kristal
menyebabkan zat terlarut memisah dari lelehan atau larutan dimana yang tidak murni tetap tertinggal dalam
larutan,maka kristalisasi juga merupakan proses pemisahan (Harborne,1987).
Bila terdapat senyawa tunggal, beberapa senyawa dapat mengkristal. Kristal dapat dimurnikan dengan pengkristalan
kembali (rekristalisasi). Teknik ini dilakukan pada produk yang kotor, mula-mula dilarutkan dalam sejumlah pelarut
ppanas (umumnya digunakan solven dimana produk tersebut kurang larut dibandingkan kotorannya). Jika larutan
panas tersebut dibiarkan mendingin produk yang murni memisah dari campuran, sehingga tersisa kotoran dalam
larutannya. Kristal-kristal yang terbentuk dari produkm disaring dan dikeringkan (Najib, 2013).
Jika sebuah fraksi dipekatkan dan didinginkan serta pelarutnya dibiarkan menguap lambat,Kristal dapat membentuk
senyawa yang murni Kristalisasi dapat dilakukan dengan sedikit penggosokan pada bagian dalam dinding kaca
selanjutnya membiarkannya di tempat dingin,bahkan dalam lemari pendingin.Beberapa deposit mungkin merupakan
kristalin dan harus di cek dengan bantuan lensa tangan untuk meyakinkan bahwa deposit tersebut bukan bahan yang
amorf yang berasal dari larutan saat pendinginan terjadi (Harborne,1987).
Manfaat dari kromatografi ini yaitu menentukan ciri senyawa aktif penyebab efek racun atau efek yang bermanfaat,
yang ditunjukkan oleh ekstrak tumbuhan kasar bila diuji dengan sistem biologi. Dalam hal ini kita harus memantau

cara ekstraksi dan pemisahan pada setiap tahap, yaitu untuk melacak senyawa aktif tersebut sewaktu dimurnihkan.
Kadang-kadang keaktifan hilang selama proses fraksinasi akibat ketidakmantapan senyawa itu, dan akhirnya mungkin
saja diperoleh senyawa berupa kristal tetapi keaktifan seperti yang ditunjukkan oleh ekstrak asal (Harborne, 1987).

Uji Kemurnian

a.

KLT 2 Dimensi

Merupakan salah satu metode untuk mengetahui kemurnian suatu senyawa dari hasil isolat, yang di mana bertujuan
untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solute mempunyai karakterisktik kimia yang hampir
sama. Karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagaimana dalam asam-asam amino, selain itu 2 sistem fase gerak yang
sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan, sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analilt yang
mempunyai tingkat polaritas yang berbeda (Sastrohamidjojo, 1985).
KLT dua arah adalah cara yang memungkinkan pemakaian lapisan fase diam yang lebih luas untuk memisahkan
campuran yang mengandung banyak komponen. Selain itu, dua sistem pelarut yang sangat berbeda dapat digunakan
secara berurutan pada campuran tertentu, jadi memungkinkan pemisahan campuran yang mengandung komponen
yang kepolarannya sangat berbeda. Ekstrak ditotolkan dan dielusi seperti pada KLT normal kemudian diputar
900 untuk pengembangan kedua (Gibbons, 2006).
Penyerap umum yang digunakan adalah silica gel, aluminium oksida, keiselgur, selullosa dan turunannya. Poliamida
dll. Silica gel adalh penyerap umum yang banyak digunakan karena mempunyai daya pemisahan yang baik, hal ini
telah diseleksi oleh Stahl untuk pertama kali 1958 (Stahl, 1985).
Salah satu aplikasi untuk mengetahui kemurnian senyawa hasil isolat dengan metode ini yaitu dengan mengelusi noda
pada 2 arah yang berbeda dan menggunakan eluen yang berbeda, isolate dikatakan murni apabila noda yang
dinampakkan adalah tunggal (Stahl, 1985).
b.

Multi Eluen

Multi eluen merupakan penggunaan eluen atau fase gerak yang berbeda yang memungkinkan pemisahan analit dengan
berdasarkan tingkat polaritas yang berbeda (Sastrohamidjojo, 1985).
Prinsipnya, like dissolve like yang dapat digunakan untuk pemilihan pelarut dalam menentukan jenis senyawa
kimia yang mungkin terekstraksi dari organisme. Dimana pelarut non polar akan mengestraksi senyawa-senyawa non
polar akan terekstraksi oleh pelarut polar, serta dapat juga digunakan untuk menganalisis kemurnian suatu
isolat/senyawa kimia yang diperoleh dari hasil isolasi dari bahan alam (Sastrohamidjojo, 1985).
KLT Multi eluen adalah penggunaan eluen atau fase gerak yang berbeda yang memungkinkan pemisahan analit
dengan berdasarkan tingkat polaritas yang berbeda. Dalam multi eluen, setelah pengembang tunggal
menaik,kromatogram diangkat dari chamber dan dikeringkan, biasanya selama 5-10 menit. Kromatogram tersebut
kemudian dielusi lagi dalam eluen segar dari pelarut yang sama dalam arah yang sama untuk jarak yang sama.Proses
ini, yang dapat diulang berkali-kali, meningkatkan resolusi komponen dengan nilai RF bawah 0,5. Beberapa
pengembang dilakukan dengan pelarut yang berbeda dalam arah yang sama, masing-masing yang menjalankan jarak
yang sama atau berbeda, disebut elusi bertahap.Sebuah fase kurang polar dapat digunakan pertama, diikuti oleh fase
yang lebih polar, atau sebaliknya. Pemindahan material nonpolar kebagian atas lapisan,meninggalkan zat terlarut polar
terganggu darimana dia berasal. Setelahkering, zat terlarut polar dipisahkan olehpengembang dengan
eluen(Cazes, 2004).
Multieluen adalah untuk mendapatkan resolusi yang baik dari hasil KLT.Memfokuskan zona pemisahan multi eluen,
cocok digunakan untuk sampel yang memiliki noda dengannilai Rf di bawah 0.5. Sampel disentrifuge terlebih dahulu
dengan menggunakan methanol p.a, sebabuntuk menjamin kemurnian senyawa. Sebab, methanol p.a
merupakanpelarut yang khusus digunakan untuk analisis dan bebas dari pengotor.Berbeda dengan methanol teknis
yang bisa saja mengandung pengotor seperti plasticizer dari wadah yang digunakan untuk menampung pelarut. agar

seluruh area lempeng dapat digunakan sehingga senyawa yang masih menumpuk dalam satu noda, dapat ter-elusi
kembali melalui sisi lempeng yang lain(Mary, 1996).

BAB III
PROSEDUR KERJA
III.1 Alat dan Bahan
III.1.1 Alat yang dipakai
Adapun alat yang digunakan yaitu batang pengaduk,chamber, gunting, gelas ukur, kolom kaca, lampu UV 254 nm
dan 366 nm, lempeng KLT, mistar, pensil 2B, pinset, pipa kapiler, sendok tanduk besi, statif, timbangan analitik, dan
vial.
III.1.2 Bahan yang digunakan
Adapun bahan yang digunakan yaitu aluminium foil, DPPH, ekstrak n-heksan daun bunga terompet (Mandivella
sanderi), eluen, n-heksan : EtoAC dengan perbandingan 7:3 , 6:4 , 5:5 , 4:6 , 3:7 , 2:8 , 1:9 dan 0:10 , label, silica gel,
tissue
III.2 Cara Kerja
Cara kerja kromatografi kolom konvensional :
1) Pengemasan Alat isolasi
Kolom dipasang tegak lurus pada statif,kemudian dibebas lemakkan menggunakan metanol. Bagian bawah kolom
dilapisi kapas kemudian silika gel dimasukkan sampai terisi dari kolom.lalu diketuk ketuk sampai tidak terbentuk
gelembung gas.

2) Pemisahan/isolasi :
Silika gel ditimbang berdasarkan perbandingan 1 gram ekstrak : 100 gram silika gel (tergantung ketersediaan ektrak
dan kapasitas kolom) . Dalam praktikum ini digunakan metode basah dimana silika gel disuspensikan menggunakan
eluen n-hexan : EtoAC dengan perbandingan 10 : 0. Kemudian suspensi dari silika gel dimasukkan ke dalam kolom
lalu dimampatkan.
Ekstraksi ditimbang berdasarkan perbandingan 1 g ektrak : 100 g silika gel dan dikemas menggunakan metode basah
yaitu sampel disuspensikan dengan eluen dengan perbandingan 9 : 1 selapis diatas permukaan kertas saring,
selanjutnya dielusi sampai menghasilkan fraksi fraksi dan ditampung ke dalam vial. Eluen yang sebelumnya
yang telah habis diganti dengan eluen 8 : 2 , kemudian secara berturut turut dilanjutkan dengan eluen perbandingan
7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9, dan 0:10. Hasil kromatografi kolom berupa fraksi. Fraksi fraksi digabung dan
dianggap satu fraksi berdasarkan warna atau profil KLT.
3) Pengujian fraksi aktif antioksidan dengan metode KLT (Gibbons, 2006)

Senyawa antioksidan adalah komponen penting dalam makanan dan berkontribusi dalam kesehatan manusia. Sifat
antioksidan dari suatu senyawa bahan alam dapat diketahui dengan menggunakan metode uji KLT (TLC Assay).
Senyawa yang mempunyai kemampuan antioksidan akan mampuh menstabilkan radikal 2,2-diphenyl-picrylhydrazyl
(DPPH). Indikasi ini terdeteksi beberapa menit setelah penyemprotan DPPH menyebabkan terbentuknya warna
kuning dengan latarbelakang ungu.
b. Kromatograsi Cair Vakum
c. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Fraksi aktif (dari KKK dan KCV) dilarutkan dengan n-heksan. Dibuat perbandingan eluen (9:1 atau 8:2). Didisiapkan
lempeng KLTP, lempeng yang digunakan biasanya berukuran 20 x 20 cm. Setelah itu fraksi ditotolkan pada lempeng
berbentuk pita pada garis penotolan yang telah dibuat sebelumnya. Setelah raksi ditotolkan pada lempeng, kemudian
dikembangkan dengan eluen yang sesuai dan dapat memisahkan komonen kimia
Setelah pengembangan/elusi, pita-pita tersebut dideteksi dan diberi tanda kemudian dikeruk yang selanjutnya disebut
sebagai isolat. Kemudian isolate tersebut dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge lalu disentrifuge. Selanjutnya
dilakukan pengujian antioksidan pada lempeng KLT dengan metode DPPH.
1.

Pengerjaan Kromatografi

1.Penyiapan lempeng silika gel


Dibuat lempeng dari silika gel dengan ukuran 7 cm x 1 cm menggunakan mistar dan lempeng silika gel
dipotong dengan cutter yang sebelumnya telah diukur dan dilakukan penjenuhan chamber kemudian disiapkan
chamber yang bersih lengkap dengan penutupnya , chamber diisi eluen n-heksan : etil dengan perbandingan 8 : 2
dengan kepolaran yang berbeda kemudian dimasukkan potongan kertas saring yang panjangnya lebih dari tinggi
chamber dan kemudian ditutup dan dibiarkan hingga eluen naik pada kertas saring hingga melewati penutup kaca
(chamber telah jenuh)
2.

Penotolan sampel pada lempeng

Disiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan dan fraksi-fraksi hasil kromatografi kolom cair vakum dularutkan
dengan n-heksan kemudian masing-masing fraksi diambil dengan menggunakan pipa kapiler, kemudian ditotolkan
pada lempeng yang telah disiapkandan lempeng yang telah ditotol diangin-anginkan sebentar untuk menguapkan
pelarutnya lalu dimasukkan ke dalam chamber yang telah dijenuhkan seelah itu Dilakukan pengelusian terhadap
lempeng yang telah ditotol dengan fraksi-fraksi n-heksan menggunakan eluen n-heksan:etil (8:2) dan bila eluen telah
mencapai batas atas dari lempeng silica gel, maka lempeng tersebut dapat dikeluarkan menggunakan pinset dan
diamati secara langsung dan dengan menggunakan penampak bercak UV 254, UV 366, dan menyemprot lempeng
dengan menggunakan DPPH.

BAB IV
Hasil Pengamatan
IV. 1 Gambar Hasil Pengamatan
A.

Kromatografi Kolom Konvensional

a. Fraksi 1
Keterangan gambar :
Fraksi 1

: Vial 1 - 17

Fraksi 2

: Vial 18

Fraksi 3

: Vial 19 - 21

Fraksi 4

: Vial 22-29

Fraksi 5

: Vial 30 - 35

Fraksi 6

: Vial 36

Fraksi 7

: Vial 37 40

Fraksi 8

: Vial 41 - 50

Fraksi 9

: Vial 51- 60

Gambar Fraksi di Sinar UV


a. Sinar Tampak
Perhitungan Nilai Rf
Rf =
a.

Sinar Tampak

Tidak ada noda yang tampak


b.

Sinar UV 254

Tidak ada noda yang tampak


c.

Sinar UV 366

Tidak ada noda yang tampak


Keterangan gambar :
Fraksi 1

: Eluen n-Heksan : etil asetat (15 : 1)

Fraksi 2

:Eluen n-Heksan : etil asetat (10 : 1)

Fraksi 3

:Eluen n-Heksan : etil asetat (5 : 1)

Fraksi 4

:Eluen n-Heksan : etil asetat (1 : 1)

Fraksi 5

: Eluen n-Heksan : etil asetat (0 : 5)

Fraksi 6

:Eluen n-Heksan : etil asetat (0 : 50)

Fraksi 7

: Pelarut Metanol 1

Fraksi 8

: Etil asetat : Metanol (1 : 1)

Fraksi 9

: Pelarut Metanol 2

Gambar di sinar UV
a.

Sinar tampak

BAB V
PEMBAHASAN
Kromatografi merupakan suatu pemisahan zat berkhasiat dan zat lain yang ada dalam bahan atau sediaan dengan jalan
penyarian berfraksi, penyerapan, atau penukaran ion pada zat berpori, menggunakan cairan atau gas mengalir.
Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan dengan menggunakan salah satu dari empat
teknik kromatografi atau gabungan teknik tersebut. Keempat teknik kromatografi itu adalah : Kromatografi Kertas
(KKt), Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Kromatografi Gas Cair (KGC) dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT).
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara
dua fasa, satu dari fasa ini membentuk lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan fasa lainnya
merembes melewati dan melalui lapisan stasioner tersebut. Pemisahan secara kromatografi memanfaatkan sifat fisika
umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat adalah kecenderungan molekul untuk larut dalam cairan (kelarutan),
kecenderungan molekul untuk melekat dalam cairan (adsorpsi), dan kecenderungan molekul untuk menguap
(keatsirian)
Sampel yang digunakan dalam praktikum ini adalah daun bunga terompet (Mandivella sanderi ). Dalam fitokimia
dilakukan suatu proses ekstraksi, isolasi dan identifikasi dari suatu komponen kimia dari tumbuhan dan biota laut yang
banyak digunakan dalam pengobatan tradisional yang berkembang menjadi obat modern. Menggunakan cara yang
bervariasi tergantung dari sifat fisika dan kimia komponen tersebut. Kemudian dilanjutkan dengan proses pemurnian
dengan kristalisasi dengan tujuan mendapatkan senyawa kimia yang penampakannya bagus dan kelihatan lebih
banyak. Metode fitokimia sangat penting artinya dalam bidang farmasi sebagai salah satu cara meneliti senyawa aktif
yang terdapat dalam tumbuhan.
Dalam kromatografi,eluent adalah fasa gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed)
untuk melewati fasa diam (adsorbent). Interaksi antara adsorbent eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan
komponen. Oleh sebab itu pemisahan komponen secara kromatografi dipengaruhi oleh laju alir
eluent dan jumlah umpan.
Sebagian besar dasar teori kromatografi kolom juga dapat diterapkan pada KLT. Konsep lempeng teori lebih sukar
digambarkan, tetapi pemisahan ini dilakukan oleh keseimbangan berturutan cuplikan dalam dua fasa, satu diantaranya
bergerak terhadap yang lainnya. Terjadi proses penyebaran molekul cuplikan karena proses nonideal.
Sifat kromofor dari struktur senyawa ini mudah dikenali di bawah lampu UV sehingga memudahkan identifikasi
dalam kromatografi lapis tipis. Pada metode isolasi senyawa -karoten dengan cara refluks yaitu tejadi penarikan
komponen kimia yang dilakukan dengan cara sampel dimasukkan ke dalam labu alas bulat bersama-sama dengan zat
pelarut (kloroform) lalu dipanaskan dan diberikan batu didih agar pemanasan berlangsung secara merata. Uap-uap
pelarut terkondensasi pada kondensor menjadi molekul-molekul pelarut yang akan turun kembali menuju labu alas
bulat, dan akan akan menyari kembali sampel yang berada pada labu alas bulat. Demikian seterusnya berlangsung
secara berkesinambungan sampai penyarian sempurna, setelah itu filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan cara
evaporasi. Evaporasi yaitu proses pemisahan ekstrak dari cairan penyarinya dengan pemanasan yang dipercepat oleh
putaran dari labu alas bulat. Dengan bantuan pompa vakum, uap larutan penyari akan menguap naik ke kondensor dan
mengalami kondensasi menjadi molekul-molekul cairan pelarut murni yang ditampung dalam labu alas bulat.
a.

Kromatografi Kolom Konvensional (KKK)

Pada metode ini, kolom diisikan dengan adsorben yang berupa padatan dalam hal ini adalah silika gel yang
dicampurkan dengan pelarut n heksan hingga membentuk bubur silika (slurry). Slurry dimasukkan dengan hati-hati
kedalam kolom kromatografi yang telah diisikan n-heksan yang sebelumnya telah disumbat dengan kapas dan kertas

saring yang berfungsi sebagai penahan adsorben agar tidak keluar bersama eluen. Pengisian kolom harus dikerjakan
secara seragam dan sepadat mungkin untuk menghindari terjadinya gelembung-gelembung udara. Jika terdapat
gelembung-gelembung udara dalam kolom maka akan berpotensi menyebabkan pecahnya kolom.
Prinsip dari kromatografi kolom jenis ini adalah kecenderungan komponen kimia untuk terdistribusi ke dalam fase
diam atau fase gerak dengan proses elusi berdasarkan gaya gravitasi. Kolom kromatografi atau tabung untuk
pengaloran karena gaya tarik bumi (gravitasi) atau system bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang
dilengkapi dengan kran.
Hal lain yang dapat dilakukan agar tidak terjadi pemecahan kolom adalah dengan menambahkan eluen secara kontinu
agar udara tidak masuk kedalam kolom. Kolom yang padat diindikasikan dengan warna slurry yang semakin memutih
dan kecepatan alir eluen yang semakin lambat. Jika kolom sudah memadat, larutan sampel kemudian diisikan kedalam
kolom . Mekanisme yang terjadi pada kromatografi kolom ialah sample akan terelusi oleh eluen (n-heksan) melalui
fase diam silika gel. Senyawa organik terelusi oleh eluen proses elusi terjadi karena keseimbangan distribusi zat analit
pada fase gerak n-heksan dan fase diam selika gel. Elusi terus berlangsung hingga tidak ada lagi yang tinggal dalam
kolom. Proses elusi ini menghasilkan eluat yang diharapkan mengandung banyak betakaroten.
Kelebihan kromatografi kolom :
1. Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative
2. Digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran
3. Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi
Kekurangan kromatografi kolom :
1. Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual
2. Metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama (time consuming)
Berdasarkan hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa daun bunga terompet (Mandevillae folium) didapatlan hasil
kromatografi kolom dengan jumlah fraksi 9 dan menggunakan 7 eluen berdasarkan tingkat kepolaran yang lebih tinggi
yang selanjutnya akan diisolasi kembali dengan metode yang cocok. Pada sinar UV tidak menampakkan noda, hal
tersebut dapat disebabkan adanya faktor kesalahan
b.

Kromatografi Cair Vakum

Kromatografi Cair Vakum (KCV) merupakan salah satu metode fraksinasi yaitu dengan memisahkan crude
extract menjadi fraksi-fraksinya yang lebih sederhana. Pemisahan tersebut memanfaatkan kolom yang berisi fasa diam
dan aliran fasa geraknya dibantu dengan pompa vakum. Fasa diam yang digunakan dapat berupa silika gel atau
alumunium oksida
Setelah ekstrak dievaporasi kemudian dilanjutkan proses pemisahan dengan menggunakan metode kromatografi
kolom. Adapun cara kerja kromatografi cair vakum yaitu kolom kromatografi dikemas kering dengan penjerap silika
gel KL 254 dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang
kepolarannya rendah (n-heksana) dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom dipisah sampai
kering dan sekarang siap dipakai. Sampel dilarutkan dalam pelarut yang cocok, dimasukkan langsung pada bagian atas
kolom dan dihisap perlahan-lahan ke dalam kemasan dengan mengvakumkannya. Kolom, dielusi dengan campuran
pelarut yang cocok, mulai dengan pelarut yang kepolarannya rendah (n-heksana) lalu kepolaran ditingkatkan perlahanlahan dengan cara elusi gradien antara n-heksana:etil asetat:metanol, kolom dihisap sampai kering pada setiap
pengumpulan fraksi.
Pengaruh lebarnya kolom pada KVC mengakibatkan fraksi sampel turun satu persatu, dan bila pelarutnya telah habis
maka harus dibuat pelarut dengan kosentrasi sama, dan diturunkan kembali fraksinya. Sedangkan panjang kolom,
mengakibatkan semakin panjang kolom maka waktu atau cepat lambatnya turun fraksi senyawa.
Adapun keuntungan dan kerugian dari kromatografi kolom adalahsebagai berikut :
a.Keuntungan

1.Konsumsi fase gerak KCV hanya 80% atau lebih kecil disbandingdengan kolom konvensional karena pada kolom
mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10-100l/menit)
2.Adanya aliran fase gerak lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spectrometer
massa.
3.Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih pekatkarenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika
jumlah sampelterbatas missal sampel klinis
b.Kerugian KCV (Kromatografi Vakum Cair) :
1.Membutuhkan waktu yang cukup lama
2.Sampel yang dapat digunakan terbatas
Berdasarkan hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa daun bunga terompet (Mandevillae folium) didapatkan hasil
kromatografi kolom dengan jumlah fraksi 9 dan menggunakan 7 eluen. Berdasarkan hasil noda yang tampak ada 2
fraksi yang menampakkan noda pada fraksi 4, noda 1 : 4,1 cm memiliki nilai Rf = 0,745, noda 2 : 4,6 cm memiliki
nilai Rf = 0,836, noda 3 : 5,1 cm memiliki nilai Rf = 0,927. Sedangkan pada fraksi 5, noda 1 : 4,8 cm memiliki nilai
Rf = 0,872, dan pada noda 2 : 5,1 cm memiliki nilai Rf = 0,927. Senyawa tersebut selanjutnya akan diisolasi kembali
dengan menggunakan metode pemisahan yang cocok, seperti Kromatografi Preparatif.
C. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP)
Kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) adalah salah satu metode yang memerlukan pembiayaan paling murah dan
memakai peralatan paling dasar. Walaupun KLTP dapat memisahkan bahan dalam jumlah gram, sebagian besar
pemakainya hanya dalam jumlah miligram.KLTP bersama-sama dengan kromatografi kolom terbuka, masih dijumpai
dalam sebagian besar publikasi mengenai isolasi bahan alam.
Cuplikan pada KLTP dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan pada pelat KLTP. Pelarut yang baik adalah
pelarut atsiri ( heksana, diklorometana, etil asetat), karena jika pelarut kurang atsiri akan terjadi pelebaran pita.
Konsentrasi cuplikan harus sekitar 5% - 10%. Cuplikan ditotolkan berupa pita yang harus sesempit mungkin karena
pemisahan tergantung pada lebar pita.
KLTP klasik mempunyai beberapa kekurangan, kekurangan yang utama adalah pengambilan senyawa dari pelat yang
dilanjutkan dengan pengekstrasian dari penjerap. Jika senyawa beracun harus dikerok dari pelat, dapat menimbulkan
masalah yang serius (misalnya Adolf dkk. 1982). Kekurangan yang lainya ialah jangka waktu yang diperlukn untuk
pemisahan dan adanya pencemar dan sisa dari pelat sendiri setelah pengekstrasian pita yang mengandung senyawa
yang dipisahkan dengan pelarut (Szekely 1983).
Untuk mengatasi beberapa masalah tersebut, beberapa pendekatan yang melibatkan kromatografi sentrifugal telah
dicoba. Pada prinsipnya kromatografi sentrifugal adalah kromatografi klasik dengan aliran fase gerak yang dipercepat
oleh gaya sentrifugal.
Adapun keuntungan dan kerugiaan KLTP yaitu :
keuntungan :
Salah satu pemisahan yang memerlukan pembiayaan paling murah danmemakai peralatan paling dasar adalah
kromatografi lapis tipis preparatif.
Kerugian:
Ketebalan dari lempeng menyebabkan waktu yang dibutuhkan menjadilebih lama dibadingkan dengan KLT pada
umumnya.
Setelah fraksi senyawa didapatkan, selanjutnya dengan menggunakan KLT kita menghitung Rf (retention fraksion),
dimana bila didapat senyawa yang Rfnya sama atau pola nodanya sama, maka kemungkinan senyawa itu adalah sama.

Dan terakhir, kita uji fitokimia dari senyawa tersebut (ekstraks n- heksana kulit batang nangka). Namun langkah ini
tidak dapat dilakukan karena waktu yang tidak mengizinkan lagi.
Adapun mekanisme dan prinsip penampakan noda pada pegujian Kromatigrafi yaitu :
a. Pada UV 254 nm
Pada UV 254 nm, lempeng akan berflouresensi sedangkan sampel akan tampak berwarna gelap.Penampakan
noda pada lampu UV 254 nm adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan indikator fluoresensi yang
terdapat pada lempeng. Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen
tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali
ke keadaan semula sambil melepaskan energi.

b. Pada UV 366 nm
Pada UV 366 nm noda akan berflouresensi dan lempeng akan berwarna gelap. Penampakan noda pada lampu
UV 366 nm adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan gugus kromofor yang terikat oleh auksokrom
yang ada pada noda tersebut. Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh
komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi
kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi. Sehingga noda yang tampak pada lampu UV 366
terlihat terang karena silika gel yang digunakan tidak berfluororesensi pada sinar UV 366 nm.
c.

Penyemprotan dengan DPPH

Salah satu metode yang digunakan untuk pengujian aktivitas antioksidan adalah metode DPPH. Metode DPPH
didasarkan pada kemampuan antioksidan untuk menghambat radikal bebas dengan mendonorkan atom hidrogen.
Perubahan warna ungu DPPH menjadi ungu kemerahan dimanfaatkan untuk mengetahui aktivitas senyawa
antioksidan. Metode ini menggunakan kontrol positif sebagai pembanding untuk mengetahui aktivitas antioksidan
sampel.

Noda-noda yang diperoleh biasanya berekor disebabkan karena :


1. Penotolan yang berulang-ulang dan letaknya tidak tepat
2. Kandungan senyawa yang terlalu asam atau basa
3. Lempeng yang tidak rata

BAB V
PENUTUP
V.1 Kesimpulan
A. Kromatografi Kolom Konvensional
Berdasarkan hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa daun bunga terompet (Mandevillae folium) didapatlan hasil
kromatografi kolom dengan jumlah fraksi 9 dan menggunakan 7 eluen berdasarkan tingkat kepolaran yang lebih tinggi
yang selanjutnya akan diisolasi kembali dengan metode yang cocok. Pada sinar UV tidak menampakkan noda, hal
tersebut dapat disebabkan adanya faktor kesalahan.
B. Kromatografi Cair Vakum (KCV)
Berdasarkan hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa daun bunga terompet (Mandevillae folium) didapatkan hasil
kromatografi kolom dengan jumlah fraksi 9 dan menggunakan 7 eluen. Berdasarkan hasil noda yang tampak terdapat
2 fraksi yang menampakkan noda yaitu pada fraksi 4 dan fraksi 5 .Pada Fraksi 4, noda 1 memiliki nilai Rf = 0,745,
noda 2 memiliki nilai Rf = 0,836, dan noda 3 memiliki nilai Rf = 0,927. Sedangkan pada fraksi 5, noda 1 memiliki
nilai Rf = 0,872, dan pada noda 2 memiliki nilai Rf = 0,927. Senyawa tersebut selanjutnya akan diisolasi kembali
dengan menggunakan metode pemisahan yang cocok, seperti Kromatografi Preparatif.

V.2 Saran
Diharapkan kebersihan dan bahan lebih dilengkapi dilaboratorium agar praktikum lebih lancar.

DAFTAR PUSTAKA
Hayani, E., 2007. Pemisahan Komponen Rimpang Temu Kunci Secara Kromatografi Kolom.Buletin Teknik
Pertanian Vol. 12 No. 1.
Khopkar, S.M. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. UI-Press. Jakarta.
Sastrohamidjojo, Hardjono.1985. Kromatografi Edisi kedua, Liberty.Yogyakarta

Soebagio, dkk. 2000. Kimia Analitik II. JICA. Malang


Sumar Hendayana. 2010. Kimia Pemisahan. PT Remaja Rosdakarya,.Bandung.
Yazid, Estien. 2005. Kimia Fisika untuk Paramedis. Andi. Yogyakarta
LAPORAN KROMATOGRAFI KOLOM

BAB I
PENDAHULUAN

A.

Latar Belakang

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan
fase diam untuk memisahkan komponen berupa molekul yang berada pada larutan. Molekul yang terlarut dalam fase
gerak akan melewati kolom yang merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan
cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah. Dengan ini, berbagai macam tipe molekul
dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom. Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut
dapat dianalisis dengan menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk analisis lebih lanjut (Anonim, 2012).
Kromatografi pertukaran ion biasa digunakan untuk pemurnian materi biologis seperti asam
amino, peptida, protein. Metode ini dapat dilakukan dalam dua tipe, yaitu dalam kolom maupun ruang datar (planar).
Terdapat dua tipe pertukaran ion, yaitu pertukaran kation dan pertukaran anion. Pada pertukaran kation, fase stasioner
bermuatannegatif sedangkan pada pertukaran anion, fase stasioner bermuatan positif. Molekul bermuatan yang berada
pada fase cair akan melewati kolom. Jika muatan pada molekul sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan
terelusi. Namun jika muatan pada molekul tidak sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan membentuk ikatan
ionikdengan kolom. Untuk mengelusi molekul yang menempel pada kolom diperlukan penambahan larutan
dengan pH dan kekuatan ionik tertentu. Pemisahan dengan metode ini sangat selektif karena biaya untuk menjalankan
metode ini murah serta kapasitasnya tinggi, maka metode ini biasa digunakan pada awal proses keseluruhan (Anonim,
2012)
Berdasarkan penjabaran di atas maka untuk memperdalam pengetahuan tentang resin pertukaran ion maka
dilakukanlah percobaan tentang teknik pemisahan kromatografi kolom.
B.

Rumusan Masalah

Rumusan masalah dari percobaan ini adalah:


1.

Bagaimana cara mengetahui teknik pemisahan kromatografi kolom ?

2.

Berapa kapasitas resin (C) pada percobaan ini ?

C.

Tujuan Percobaan

Tujuan dari percobaan ini adalah:


1.

Mengetahui teknik pemisahan kimia dengan cara kromatografi kolom.

2.

Menghitung kapasitas resin dari sampel yang digunakan pada percobaan ini.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Dalam kromatografi partisi cair-cair, suatu pemisahan dipengaruhi oleh distribusi sampel antara fase cair diam dan
fase cair bergerak dengan membatasi kemampuan pencampuran. Jika suatu zat terlarut dikocok dalam sistem dua
pelarut yang tidak bercampur atau saling melarutkan maka zat terlarut akan terdistribusi di antara kedua fase
(Khopkar, 2008, hal: 155).
Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk memisahkan komponenkomponen dalam campuran. Alat tersebut berupa pipa gelas yang dilengkapi suatu kran dibagian bawah kolom untuk

mengendalikan aliran zat cair, ukuran kolom tergantung dari banyaknya zat yang akan dipindahkan. Secara umum
perbandingan panjang dan diameter kolom sekitar 8:1 sedangkan daya penyerapnya adlah 25-30 kali berat bahan yang
akan dipisahkan. Teknik banyak digunakan dalam pemisahan senyawa-senyawa organic dan konstituen-konstituen
yang sukar menguap sedangkan untuk pemisahan jenis logan-logam atau senyawa anorganik jarang dipakai (Yazid,
2005, hal: 98).
Dalam proses kromatografi selalu terdapat salah satu kecenderungan molekul-molekul komponen untuk melarut
dalam cairan, melekat pada permukaan padatan halus, bereaksi secara kimia dan terekslusi pada pori-pori fasa diam.
Komponen yang dipisahkan harus larut dalam fasa gerak dan harus mempunyai kemampuan untuk berinteraksi
dengan fasa diam dengan cara melarut di dalamnya, teradsorpsi atau bereaksi secara kimia. Pemisahan terjadi
berdasarkan perbedaan migrasi zat-zat yang menyusun suatu sampel. Hasil pemisahan dapat digunakan untuk
keperluan analisis kualitatif, analisis kuantitatif dan pemurnian suatu senyawa. Dalam beberapa hal metode
pemisahan kromatografi mempunyai kemiripan dengan metode pemisahan ekstraksi. Kedua metode ini sama-sama
menggunakan dua fasa, dimana fasa satu bergerak terhadap fasa lainnya, kesetimbangan solut selalu terjadi di antara
kedua fasa ( Alimin dkk, 2007, hal: 74-75).
Pemisahan kromatografi kolom adsorpsi didasarkan pada adsorpsi komponen-komponen campuran dengan
afinitas berbeda-beda terhadap permukaan fase diam. Kromatografi kolom terabsorpsi termasuk pada cara pemisahan
cair padat, substrat padat bertindak sebagai fasa diam yang sifafnya tidak larut dalam fasa cair, fasa bergeraknya
adalah cairan atau pelarut yang mengalir membawa komponen campuran sepanjang kolom. Pemisahan bergantung
pada kesetimbangan yang terbentuk pada bidang antar muka diantara butiran-butiran adsorben dan fase bergerak serta
kelarutan relatif komponen pada fasa bergeraknya. Antara molekul-molekul komponen dan pelarut terjadi kompetisi
untuk teradsorpsi pada permukaan adsorben sehingga menimbulkan proses dinamis. Keduanya secara bergantian
tertahan beberapa saat di permukaan adsorben dan masuk kembali pada fasa bergerak (Yazid, 2005, hal: 100).
Pada saat teradsorpsi komponen dipaksa untuk berpindah oleh aliran fasa bergerak yang ditambahkan secara kontinu,
akibatnya hanya komponen yang mempunyai afinitas lebih besar terhadap adsorben akan secara selektif tertahan.
Komponen afinitas paling kecil akan bergerak lebih cepat mengikuti aliran pelarut. Pada kromatografi adsorpsi,
besarnya koefisien distribusi sama dengan konsentrasi zat terlarut pada fasa teradsorpsi dibagi konsentrasinya pada
fasa larutan. Ketergantungan jumlah zat terlarut yang teradsorpsi terhadap konsentrasi zat terlarut dalam larutan
dinyatakan dengan isoterm adsorpsi Langmuir (Yazid, 2005, hal: 100).
Metode pemisahan kromatografi kolom ini memerlukan bahan kimia yang cukup banyak sebagai fasa diam
dan fasa bergerak bergantung pada ukuran kolom gelas. Untuk melakukan pemisahan campuran dengan metode
kromatografi kolom diperlukan waktu yangcukup lama, bias berjam-jam hanya untuk memisahkan satu campuran.
Selain itu, hasil pemisahan kurang jelas artinya kadang-kadang sukar mendapatkan pemisahan secara sempurna karena
pita komponen yang satu bertumpang tindih dengan komponen lainnya. Masalah waktu yang lama disebabkan laju alir
fasa gerak hanya dipengaruhi oleh gaya gravitasi bumi, ukuran diameter partikel yang cukup besar membuat luas
permukaan fasa diam relative kecil sehingga tempat untuk berinteraksi antara komponen-komponen dengan fasa diam
menjadi terbatas. Apabila ukuran diameter partikel diperkecil supaya luas permukaan fasa diam bertambah
menyebabkan semakin lambatnya aliran fasa gerak atau fasa gerak tidak mengalir sama sekali. Selain itu fasa diam
yang sudah terpakai tidak dapat digunakan lagi untuk pemisahan campuran yang lain karena sukar meregenerasi fasa
diam (Hendayana, 2006, hal: 2-3).
Untuk memisahkan campuran, kolom yang telah dipilih sesuai campuran diisi dengan bahan penyerap seperti alumina
dalam keadaan kering atau dibuat seperti bubur dengan pelarut. Pengisian dilakukan dengan bantuan batang pengaduk
untuk memanfaatkan adsorben dan gelas wool pada dasar kolom. Pengisian harus dilakukan secara hat-hati dan
sepadat mungkin agar rata sehingga terhindar dari gelembung-gelembung udara, untuk membantu homogenitas
biasanya kolom setelah diisi divibrasi diketok-ketok. Sejumlah cuplikan yang dilarutkan dalam sedikit pelarut,
dituangkan melalui sebelah atas kolom dan dibiarkan mengalir ke dalam adsorben. Komponen-komponen dalam
campuran diadsorpsi dari larutan secara kuantitatif oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada permukaan atas
kolom. Dengan penambahan pelarut secara terus-menerus, masing-masing komponen akan bergerak turun melalui
kolom dan pada bagian atas kolom akan terjadi kesetimbangan baru antara bahan penyerap, komponen campuran dan

eluen. Kesetimbangan dikatakan tetap apabila suatu komponen yang satu dengan yang lainnya bergerak ke bagian
bawah kolom dengan waktu atau kecepatan berbeda-beda sehingga terjadi pemisahan (Yazid, 2005, hal: 200-2001).
Menurut Alimin (2007, hal: 75) keuntungan pemisahan dengan metode kromatografi adalah
a.

Dapat digunakan untuk sampel atau konstituen yang sangat kecil.

b.

Cukup selektif terutama untuk senyawa-senyawa organik multi komponen.

c.

Proses pemisahan dalam dilakukan dalam waktu yang relatif singkat.

d.

Seringkali murah dan sederhana karena umumnya tidak memerlukan alat yang mahal dan rumit.

BAB III
METODE PERCOBAAN
A.

Waktu dan Tempat


Hari/tanggal : Senin/22 Mei 2012

Pukul

: 13.30 16. 30 WITA

Tempat

: Laboratorium Kimia Analitik Universitas Islam Negeri (UIN) Alauddin Makassar

B.

Alat dan Bahan

1.

Alat

Adapun alat yang digunakan pada percobaan ini adalah :


a.

Botol fial

1 buah

b.

Botol semprot

1 buah

c.

Bulp

1 buah

d.

Chamber

2 buah

e.

Gelas kimia 400 mL

1 buah

f.

Penggaris

1 buah

g.

Penotol sampel

1 buah

h.

Pensil

1 buah

i.

Pinset

1 buah

j.

Pipet skala 5 mL

2 buah

2.
Bahan
Adapun bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah :
a.

Aquadest (H2O)

b.

Etanol : kloroform (1:4, 1:1 dan 4:1)

c.

Lempeng KLT

d.

Sampel ekstraksi daun bayam

e.

Tissue

C.

Prosedur Kerja

Prosedur kerja dari percobaan ini adalah:


1.

Menyediakan alat dan bahan yang akan digunakan.

2.

Membuat pelarut dengan campuran etanol-kloroform dengan perbandingan 1:4, 1:1 dan 4:1.

3.
Memasukkan pelarut ke dalam chamber (misalnya pelarut dengan perbandingan 1:4) kemudian di kocok hingga
pelarut homogen.
4.

Menyiapkan lempeng KLT, kemudian memberi tanda berupa garis sepanjang plat dengan menggunakan pensil.

5.

Menotol sampel bayam hasil ekstraksi pada garis yang telah dibuat pada lempeng KLT tersebut.

6.
Meletakkan plat KLT ke dalam chamber yang berisi larutan dengan posisi plat yang telah ditetesi dengan sampel
berada di bawah.
7.

Mendiamkan beberapa saat dan mengamati perubahan warna dan noda yang terjadi pada plat tersebut.

8.

Menghitung Rf dari masing-masing plat dengan perbandingan pelarut yang berbeda.

B.

Pembahasan

BAB V
PENUTUP
A.

Kesimpulan

1.

Kromatografi kolom merupakan teknik pemisahan kimia berdasarkan pertukaran ion anion dan ion kation.

2.

Kapasitas resin pada percobaan ini sebesar 6 x 10-5 gram.mol.

B.

Saran

Saran dari percobaan ini sebaiknya untuk percobaan selanjutnya digunakan sampel sampel air laut atau air sungai agar
dapat diketahui perbandingan kapasitas resin dari sampel tersebut.

DAFTAR PUSTAKA
Alimin, dkk. Kimia Analitik. Makassar: Alauddin Press, 2007
Anonim. kromatografi. http//id. Wikipedia. Org/ 8 Mei 2012
Anonim. Kromatografi Kolom. http//id. Wikipedia. Org/ 8 Mei 2012
Anonim. Pemisahan Kromatografi. http//www. Chem.-is-try. Org/ 8 Mei 2012
Hendayana, Sumar. Kimia Pemisahan. Bandung: PT. Remaja Rosdakarya, 2006
Khopkar, S.M. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: Erlangga, 2008
Yazid, Estien. Kimia Fisika Paramedis. Yogyakarta: Andi, 2005

I.
1.)
2.)
II.

KROMATOGRAFI KOLOM
Tujuan Percobaan
Adapun tujuan percobaan pada perlakuan ini yaitu sebagai berikut :
Memisahkan pigmen atau komponen-komponen dari ekstrak daun pandan suji (Pleomele angustifiolia
N.E Brown ).
Memisahkan Cr(III) dan Cr(IV) dari campurannya.
Dasar Teori
Kromatografi pertama kali diberikan oleh Michel Tswett, seorang ahli dari Botani Rusia, yang
menggunakan kromatografi untuk memisahkan klorofil dari pigmen-pigmen lain pada ekstrak tanaman.
Tswett sendiri mengantisipasi penearapan pada beraneka ragam sistem kimia. Seandainya karyanya segera
ditanggapi dan diperluas, beberap bidang sains mungkin akan lebih cepat maju. Demikianlah kromatografi
tetap tersembunyi sampai sekitar tahun 1931, ketika pemisahan karotenatumbuhan dilaporkan oleh ahli sains
organik terkemuka yaitu Kuhn. Penelitian ini menarik lebih banyak perhatian dan kromatografi adsorsi
menjadi meluas pemakaiannya dalam bidang kimia hasil alam (Speight, 2006).
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan
komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua
buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran, sedangkan fase
gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan
tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat(Speight,
2006).
Komponen-komponen utama kromatografi adalah fasa stasioner dan fasa mobil dan kromatogarfi dibagi
menjadi beberapa jenis bergantung pada jenis fasa mobil dan mekanisme pemisahannya,seperti ditunjukkan
pada table dibawah ini :
Kriteria
Nama
Kromatografi
cair,
kromatografi
gas
Fase mobil
kromatografi adsorpsi, kromatografi partisi
Mekanisme
Kromatografi pertukaran ion, kromatografi gel
Kromatografi kolom, kromatografi lapis tipis,
Fase stasioner
kromatografi kertas
(Anonim A, 2013).
Kromatografi kolom merupakan salah satu dari kromatografi partisi yang digunakan luas karena
merupakan sangat efisien untuk pemisahan senyawa organic. Kromatografi kolom sering kali digunakan

untuk memurnikan senyawa di laboratorium. Kromatografi kolom bekerja berdasarkan skala yang lebih
besar menggunakan material terpadatkan pada sebuah kolom gelas vertikal. Kromatografi kolom merupakan
teknik pemisahan berdasarkan pada perbedaan daya adsorpsi suatu adsorben tertentu terhadap suatu senyawa
baik pengotor maupun senyawa hasil isolasi. Prinsip dari kromatografi kolom ini adalah
adsorpsi
(Anonim A, 2013).
Dalam semua teknik kromatografi, zat-zat terlarut yang dipisahkan bermigrasi sepanjang kolom
(atau, seperti dalam kromatografi kertas atau lapis tipis, ekivalen fisik kolom), dan tentu saja dasar pemisaha
terletak dalam laju perpindahan yang berbeda untuk larutan yang berbeda. Kita boleh menganggap laju
perpindahan sebuah zat terlarut sebagia hasil dari dua faktor, yang satu cendrung menggerakkan zat terlarut
itu dan yang lain menahannya. Dalam proses asli tswett, kecendrungan zat-zat terlarut untuk menyerap pada
fasa padat menahan pergerakan mereka, sementara kelarutannya dalam fasa cair bergerak cendrung
menggerakkan mereka. Perbedaan yang kecil antara dua zat terlarut dalam kekuatan adsorpsi dan dalam
inetraksinya dengan pelarut yang bergerak menajdi dasar pemisahan bila molekul-molekul zat terlarut itu
berulang kali menyebar di antara dua fasa itu ke seluruh panjang kolom (Underwood, 2002).
Kromatografi kolom merupakan teknik kromatografi yang paling awal ditemukan. Ditinjau dari
mekanismenya kromatografi kolom merupakan kromatografi terapan atau adsorpsi berdasarkan jenis fasa
yang digunakan. Fasa diam berupa adsorben yang tidak boleh larut dalam fasa gerak, ukuran partikel fasa
diam harus seragam. Zat pengotor yang terdapat pada fasa diam dapat menyebabkan adsorpsi tidak
reversible. Sebagai fasa diam dapat digunakan alumina, silica gel, arang, bauksit, magnesium kerbonat, talk,
pati, sekilator, gula, dan tanah diatome. Pengisian fasa diam ke dalam kolom dapat dlakukan dengan cara
kering dan cara basah. Fasa gerak pada kromatografi kolom dapat berupa pelarut tunggal atau campuran
beberapa pelarut dengan komposisi tertentu. Pelarut dapat berupa pelarut polar dan pelarut non polar.
Umumnya senyawa non polar dengan berat molekul kecil lebih cepat meninggalkan fasa diam (Anonim
B, 2013).
Kromatografi kolom menunjukan adanya prinsip yang sama yang digunakan dalam kromatogtafi
lapis tipis yang dapat diterapkan pada skala besar pada pemisahan campuran. Kromatografi sering kali
digunakan untuk pemurnian senyawa di leboraturium. Berbagai ukuran kolom dapat digunakan dimana hal
utama yang dipertimbangkan adalah kapasitas yang memadai untuk menerima sampel-sampel tanpa mealui
fase diamnya. Merupakan aturan praktis yang umum bahwa panjang kolom harus sekurang- kurangnya 10
kali ukuran diameternya. Jika kita mempunyai kolom dengan panjang 20 cm, dan diameternya 1 atau 2 cm.
Bahan pengemasnya suatu adsorben seperti alumina atau resin penukar ion, dimasukkan dalam bentuk
suspense kedalam porsi fasa bergerak dan dibiarkan diam dalam komponen basa dengan sedikit cairan
(Anonim B, 2013)
KROMATOGRAFI KOLOM

1. I.
TUJUAN PRAKTIKUM
Memisahkan pigmen dalam berbagai sampel daun dengan kromatografi kolom.

1. II.
TINJAUAN PUSTAKA
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran yang berdasarkan kecepatan perambatan komponen dalam
medium tertentu. Uraian mengenai kromatografi pertama kali dijelaskan oleh Michael Tswett, seorang ahli biotani
Rusia yang bekerja di Universitas Warsawa Pada saat itu, Michael Tswett melakukan pemisahan klorofil dari pigmenpigmen lain dari ekstrak tanaman menggunakan kromatografi kolom yang berisi dengan kalsium karbonat. Pada

kromatografi, komponen- komponen yang akan dipisahkan berada diantara dua fase yaitu fase diam ( stationary ) dan
fase bergerak (mobile ). Fase diam adalah fase yang akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak
adalah fase yang akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan
tertinggal atau tidak bergerak sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat
( Sudarmadji, 2007 ).
Kromatografi kolom bertujuan untuk purifikasi dan isolasi komponen dari suatu campurannya. Metode pembuatan
kolom terbagi menjadi 2 yaitu untuk metode kering, kolom pertama diisi dengan kering fase diam bubuk, diikuti
dengan penambahan fase mobile. Metode basah, sebuah bubur disiapkan dari eluent dengan fase diam bubuk dan
kemudian dengan hati-hati dituangkan ke dalam kolom. Lapisan ini biasanya ditutupi dengan lapisan pasir kecil atau
dengan kapas atau wol kaca untuk melindungi bentuk lapisan organik dari kecepatan baru ditambahkan eluent. Eluent
perlahan-lahan melewati kolom untuk memajukan bahan organik (Roy, 1991).
Sebagian besar prinsip pemisahan kromatografi kolom didasarkan pada afinitas kepolaran analite dengan fase diam,
sedangkan fase gerak selalu memiliki kepolaran yang berbeda dengan fase diam. Pada sebagian besar kromatografi
kolom menggunakan fase diam yang bersifat polar dengan fase gerak yang non-polar dengan begitu waktu retensi
akan menjadi lebih singkat. Semakin cepat pergerakan fase gerak akan meminimalkan waktu yang diperlukan untuk
bergerak di sepanjang kolom. Laju aliran kolom dapat ditingkatkan dengan memperluas aliran eluent di dalam kolom
dengan mengisi fase diam pada bagian bawah atau dikurangi dengan mengontrol keran. Laju aliran yang lebih baik
dapat dicapai dengan menggunakan pompa atau dengan menggunakan gas dengan kompresi (misalnya
udara,nitrogen, argon) untuk mendorong pelarut melalui kolom.
Kolomnya (tabung gelas) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau pati yang dicampur dengan adsorben,
dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sampel
diasorbsi oleh adsorben. Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom.
Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa mobil) dan pelarut yang teradsorbsi oleh
adsorben (fasa stationer). Selama perjalanan turun, zat terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan partisi berulangulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masingmasing zat terlarut (Sastrohamidjojo, 2005).
Keuntungan kromatografi kolom yaitu dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative, digunakan unruk
menentukan jumlah komponen campuran digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi. Kerugian
kromatografi kolom yaitu untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual, metode ini sangat
membutuhkan waktu yang lama (time consuming) (Rahman, 2009).

1. III.
ALAT DAN BAHAN
2. A.
Alat
Alat-alat yang digunakan pada praktikum kali ini adalah
1. Buret
2. Gelas piala

3. Gelas ukur
4. Kertas Whatman No.42
5. Lampu UV
6. Neraca analitik
7. Penggaris
8. Pensil
9. Pipa kapiler
10. Ruang pengembang
11. B.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum kali ini adalah
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Aseton n-heksan
Diklorometana
Etil asetat
Methanol
Sampel daun (mangga dan kesturi)
Silika

1. IV.

PROSEDUR KERJA
A. A.
Persiapan Kolom
1. Menimbang sebanyak 10 gram silika.
2. Melarutkan sebagian silika dengan n-heksan hingga terbentuk lumpur.
3. Memasukkannya ke dalam buret yang ujungnya sudah tersumbat dengan kertas.
4. Mengetuk-ngetuk dinding kolom agar silika tertata rapid an tidak ada udara yang
masuk.

1. B.
A.
B.
C.
D.
E.
F.

Pemisahan Pigmen dalam Sampel Daun


Melarutkan ekstrak sampel daun mangga dengan n-heksana : aseton (7:3).
Memasukkan ekstrak tersebut ke dalam kolom.
Setelah itu elusi dengan menambahkan larutan n-heksana.
Menampung hasil elusi di dalam vial.
Kemudian mengujinya dengan KLT.
Mengamati jenis pigmen apa saja yang terdapat dalam tiap fraksi.

1. V.

HASIL DAN PEMBAHASAN


A. A.
Hasil Percobaan
1. B.
Pembahasan
Praktikum kali ini yaitu tentang kromatografi kolom yang bertujuan untuk memisahkan pigmen dalam berbagai sampel
daun . Pada praktikum kali ini sampel daun yang digunakan yaitu daun mangga yang pada praktikum sebelumnya
telah dilakukan uji KLT.
Pada praktikum kali ini pertama yaitu menyiapkan kolom yang akan digunakan untuk pemisahan pigmen tersebut.
Menimbang silica sebanyak 10 gram, kemudian sebagian silika di larutkan dengan pelarut n-heksana sampai
terbentuk lumpuran. Setelah itu masukkan silika atau lumpuran silika tersebut kedalam buret yang sebelumnya buret
tersebut sudah disumbat dengan kapas pada bagian ujungnya. Ketuk-ketuk bagian dinding buret agar lumpuran
tersebut tertata rapi atau padat hingga tidak ada udara yang menempati kolom tersebut dan bagian krannya dibiarkan
terbuka agar larutannya keluar. Sebelum ekstrak dimasukkan, terlebih dahulu di larutkan dengan n-heksana: aseton
(7:3) hingga larut, masukkan larutan ekstrak tersebut ke dalam kolom yang sudah disiapkan tadi kemudian di elusi

dengan larutan n-heksana, dan fraksi-fraksinya ditampung dalam vial. Fraksi yang diperoleh tersebut kemudian di uji
dengan KLT, mengamati jenis pigmen apa saja yang terdapat pada tiap fraksi yang didapat.
Hasil yang didapat pada uji KLT pada fraksi tersebut tidak ada spot yang terlihat pada lampu UV. Kemungkinan
kesalahan ini terjadi pada pemilihan pelarut dan sampel yang sebelumnya telah dimaserasi dengan larutan tertentu.
Mengingat pada prinsip kepolaran antara fase diam dan fase gerak pada kromatografi, sehingga kemungkinan hasil
yang didapat pada praktikum kali ini karena factor tersebut. Selain itu, pada melarutkan silika memakan waktu yang
terlalu lama, silika yang dibuat terlalu tinggi sehingga pada praktikum ini memakan waktu yang lama untuk
mengeluarkan pelarutnya sampai kolom terbentuk sempurna. Elusi yang dilakukan seharusnya ada beberapa pelarut,
tapi karena alasan terbatasnya waktu dan ketinggian kolom tersebut maka hanya bisa dengan pelarut n-heksana.
1. VI.
KESIMPULAN
Kesimpulan yang diperoleh dari praktikum kali ini yaitu sebagai berikut:
1. Kromatografi kolom yaitu purifikasi atau isolasi senyawa campuran.
2. Pada pelarut n-heksan tidak terdapat spot mungkin karena kesalahan praktikan yang tidak teliti
dalam pengerjaan.

Anda mungkin juga menyukai