FIGURA 2.13
Velocidad frente al pH, un modelo monoprtico sencillo
Considerar un sistema en el que el sustrato es un cido dbil, HA, pero slo la forma
ionizada A- se une a la enzima. El verdadero sustrato es entonces A-. Para una
concentracin total fija de cido dbil, la proporcin que se encuentra en la forma
inica apropiada se calcula con la ecuacin de Henderson-Hasselbalch.
Cuando el pH es superior en una unidad al pKa 10/11 del total se encuentran como A-.
Cuando el pH = pKa + 2, 100/101 del total se encuentran como A-. Cuando el pH es
1Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
una unidad menor que el pKa 1/11 se encuentran como A-; as podemos esperar que la
velocidad aumente a medida que se in-cremente el pH, como se muestra en la figura
2.14 donde el pKa del sustrato se supone que es 4. Se supone tambin que el sitio
activo de la enzima contiene un grupo bsico B que deber estar protonado, BH+, para
unirse al sustrato A-. La proporcin de concentracin total de enzima en la forma inica
adecuada BH+ disminuye al aumentar el pH, como se ilustra en la figura 2.14 donde el
pKa del sitio ac-tivo se supone es 7. La actividad mxima terica se dar a un pH en el
que toda la enzima se encuen-tra como BH+ y todo el sustrato como A-. Sin embargo,
los dos valores de pKa se diferencian slo en tres unidades y, por lo tanto, la
combinacin mxima de BH+ y A- se dar a un pH de 5.5 en el que el 97% del sustrato
total y enzima total estarn en la forma inica adecuada.
k = Ae
Ea
RT
log k =
[y
Ea
1
+ log A
2.303R T
m
b]
log
O bien
Ea
k2
T2 T1
=
k 1 2.303R T2 T1
Ea =
2.303 RT2 T1
T2 T1
log
k2
k1
3Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
Ea =
Cintica enzimtica
Para que una reaccin qumica se lleve a cabo es necesario:
Que las molculas se reconozcan qumicamente; es decir, que tengan una
orientacin espacial ptima.
Que posean la suficiente energa para alcanzar un estado de transicin en el
cual la probabilidad de establecer o romper un enlace sea elevada. Este
estado de transicin se encuentra en la barrera de energa que separa
reactivos y productos. Se puede esquematizar de la siguiente manera:
4Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
Energa de activacin
Es la energa necesaria para llevar las molculas de un mol de sustancia al estado de
transicin.
Energa de activacin y catlisis
Se sabe que los procesos espontneos transcurren con disminucin de la energa
libre. La energa adi-cional que hay que suministrar al sustrato para que se transforme
en producto recibe el nombre de energa de activacin, como se haba mencionado.
La energa de activacin est relacionada con la constante de velocidad de la reaccin
qumica, como se indica:
S
k P
k = -
dS dP
=
dt dt
k = constante de velocidad
V = k[S]
La energa de activacin y la constante de velocidad estn relacionadas por la
ecuacin de Arrhe-nius
k = Ae
Ea
RT
en donde
A = nmero de molculas que tienen la suficiente energa para reaccionar
e = base de logaritmo natural
R = 1.99 cal/Kmol
T = 273 + C
Sacando logaritmo natural a los dos miembros de la ecuacin, tenemos que
5Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
ln k = ln A ln e
Ea
- RT
= ln A -
Ea
RT
Sustituyendo ln A = B.
ln k = B -
Ea
RT
Esta ecuacin permite deducir que la velocidad de cualquier reaccin qumica ser
mayor al aumentar la temperatura de la reaccin y disminuir la energa de activacin.
Se sabe que por cada 10 de elevacin de temperatura la velocidad de
reaccin se duplica. Precisamente, los catalizadores disminuyen la energa de
activacin y en consecuencia aumentan considerablemente la velocidad de la
reaccin catalizada.
Llamamos k a la constante de velocidad de la reaccin espontnea, y k a la
catalizada:
ln k = B -
Ea
RT
ln k' = B -
Ea '
RT
ln
k' E a - E a '
=
, o bien,
k
RT
log
Ea - Ea '
k'
=
k
RT 2.303
Esta relacin nos indica cuantas veces es ms rpida una reaccin catalizada de una
no catalizada.
Principios de la cintica enzimtica
La cintica es el estudio de las velocidades de reaccin y el conocimiento de los
principios que rigen dichas reacciones. Vamos a relacionar la velocidad de la reaccin
con la concentracin de los reactivos mediante la expresin
V = k[ ]
Sea la reaccin
en donde,
kf = constante de formacin
kr = constante de reversibilidad
kf
A
B + C
V = kf [A]
A k r B + C
V = kr [B][C]
6Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
Sobre una base cintica, las reacciones qumicas se pueden clasificar por el orden de
reaccin en: de primer orden, de segundo orden, de tercer orden y de orden cero.
Reacciones de primer orden
Son aqullas cuya velocidad depende de la concentracin de un reaccionante.
AP
La velocidad de reaccin en cualquier tiempo t est dada por:
V = -
V=-
d[A]
d[P]
=
dt
dt
d[A ]
= k[A ]
dt
V = k[A]
k = seg -1
La forma integrada de esta ecuacin, que es ms til para la realizacin de clculos
cinticos, es
log
[Ao ]
kt
=
[ A ] 2.303
En las reacciones de primer orden, la mitad del tiempo est dada por:
t1 =
2
0.693
k
A + B P
La velocidad de esta reaccin se puede expresar como
V = -
d[A]
d[B]
d[P]
= =
dt
dt
dt
d[A ]
= k[A][B]
dt
V = k [A]2
despejando k tenemos
7Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
k = (seg mol) -1
La forma integrada de la expresin de segundo orden es
t=
[B ][A]
2.303
log o
k[A o ] [B]
[A o ][B]
en donde
[Ao] y [Bo] son las concentraciones iniciales
[A] y [B] son las concentraciones en el tiempo t
t1 =
2
en donde
1
Cok
A + B + C P
La velocidad de esta reaccin se puede expresar como
V = -
d[P]
d[A]
d[B]
d[C]
=
= = dt
dt
dt
dt
V=-
d[A ]
= k[A][B][C]
dt
V = k [A]3
k = (seg mol 2 ) -1
Reacciones de orden cero
Son independientes de la concentracin de cualquiera de los reaccionantes. La
velocidad puede de-pender de la concentracin del catalizador
8Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
V=-
d[A ]
= k[A]o = k
dt
despejando k
k = mol/seg
Obsrvese que la velocidad es una constante a lo largo del tiempo que dura la
reaccin.
Los principios generales de cintica de las reacciones qumicas son aplicables
a las reacciones enzimticas, pero stas tienen una caracterstica que no se observa
en las reacciones qumicas no enzimticas y es la saturacin con el sustrato.
Los primeros conocimientos sobre el comportamiento enzimtico se deben a V.
Henri y ms tarde a L. Michaelis y Maud L. Menten. El modelo de accin enzimtica de
Michaelis-Menten ha sido la base de la cintica enzimtica. Su trabajo experimental se
realiz con un extracto de levaduras ricas en invertasa (hidroliza la sacarosa). Se
recopilaron los datos de dos experimentos independientes, los cuales se indican a
continuacin.
1) Mientras la concentracin del sustrato se mantuvo constante, en tanto se
haca variar la con-centracin de enzima, se observ lo siguiente:
9Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
Eleonor Michaelis
Maud Menten
k 2 + k 3 ( [E T ] - [ES] ) [S]
=
k1
[ES]
en donde
k 2 + k3
= K m (constante de Michaelis).
k1
Km =
Sustituyendo
( [E T ] - [ES] ) [S]
[ES]
simplificando
Km =
Km =
[E T ] [S]
- [S]
[ES]
K m + [S] =
[ES] =
[E T ] [S]
[ES]
[E T ] [S]
K m + [S]
11Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
Vo [E T ] [S]
=
k 3 K m + [S]
despejando Vo
Vo = k 3
[E T ] [S]
K m + [S]
Vo =
Vmax [S]
K m + [S]
Vo = Vmax
sustituyendo Vo en la ecuacin de Michaelis-Menten:
Vmax
V
[S]
= max
2
K m +[S]
simplificando
Km + [S] = 2 [S]
Km = 2 [S] - [S]
Km = [S]
12Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
f ES =
[S]
V
=
Vmax K m + [S]
Este diagrama muestra cmo tienden a variar las concentraciones de los distintos
componentes de una reaccin enzimtica en el curso de la misma.
13Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
De acuerdo con esto, despus de un primer momento transitorio [S] y [P] cambian
mucho ms rpida-mente en trminos absolutos que [E] y [ES]. Si la enzima est
presente en cantidades catalticas; es decir, [S] >> [ET], entonces, inmediatamente
despus de mezclar E y S se alcanza un estado estacio-nario en el que [ES]
permanece, prcticamente, constante con el tiempo. Cabe considerar cero la velocidad
de cambio de [E] y [ES] respecto al tiempo, en comparacin con la velocidad de
cambio con [S] y [P]. Esta suposicin de Briggs y Haldane se conoce como
aproximacin del estado estacionario. De esto puede deducirse una ecuacin de
velocidad de forma similar a la descrita por Michaelis-Menten.
Cintica de primer orden
La relacin lineal entre V y [S] cuando [S] << Km, la Km puede deducirse a partir de la
ecuacin de Michaelis-Menten.
Vo =
Vmax [S]
K m + [S]
Vo =
Vmax
[S]
Km
V = k[S]
Donde
k = constante de velocidad de primer orden para la reaccin total (min-1)
Vo =
Vmax [S]
,
[S]
simplificando
Vo = Vmax
Vo =
De
Vmax [S]
K m +[S]
1
K m +[S]
=
Vo
Vmax [S]
Simplificando
1
Km 1
1
=
+
Vo
Vmax [S]
Vmax
[y =
b]
15Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
Representacin de Eadie-Hofstee
La ecuacin de Michaelis-Menten se transforma en la ecuacin que corresponde a una
recta.
V = - Km
[y =
V
+ Vmax
[S]
x
b]
Representacin de Dixon
La ecuacin de Michaelis-Menten puede tambin generar una recta al expresarla en la
forma
[S] [S]
K
=
+ m
V Vmax Vmax
[y = m x + b]
ndice de recambio
16Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
El trmino ndice de recambio puede utilizarse de dos formas. Una, que ha sido
definida como activi-dad molecular, es el nmero de moles de sustrato
transformados por minuto por mol de enzima en condiciones ptimas. Otra,
considerando que muchas enzimas son oligmeros que contienen n subunidades, es
el nmero de moles de sustrato transformados por minuto por mol de subunidad activa o centro cataltico en condiciones ptimas. Esta ltima definicin de
poder cataltico se llama actividad de centro cataltico.
Vmax
kp =
[E]t
Inhibicin enzimtica
Cualquier sustancia que reduzca la velocidad de una reaccin catalizada
enzimticamente se puede considerar como un inhibidor. Tanto la velocidad mxima
como la Km pueden verse afectadas de diferentes maneras. La inhibicin de la
actividad enzimtica es uno de los mecanismos de regulacin de las clulas vivas y
uno de los procedimientos ms importantes de diagnstico enzimtico.
En la vida cotidiana, los inhibidores enzimticos pueden encontrarse en sustancias
como dro-gas, antibiticos, conservadores, venenos y toxinas.
Inhibicin irreversible
En primer lugar, se reconoce la inhibicin irreversible que supone una unin
covalente enzima-inhibidor que lesiona o suprime la actividad enzimtica, sin
posibilidad
de
regeneracin.
As,
por
ejemplo,
el
iodoacetato
el
CysSH + ICH2COOH
CysSCH2COOH + HI
17Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
Inhibicin reversible
En la inhibicin reversible, la unin enzima-inhibidor (EI) suele ser no covalente y,
por tanto, temporal. El complejo (EI) se podr formar y destruir de acuerdo con las
leyes de los equilibrios qumicos. Se describen tres tipos fundamentales de inhibicin
reversible: inhibicin competitiva; inhibicin no competitiva a) pura y b)mixta; e
inhibicin acompetitiva.
Inhibicin competitiva
Un inhibidor competitivo es una sustancia que se combina con la enzima libre, de
forma que impide la unin con el sustrato. Es decir, el inhibidor y el sustrato se
excluyen mutuamente. Un inhibidor competitivo puede ser un anlogo no
metabolizable, un derivado del verdadero sustrato, otro sustrato para la enzima o un
producto de reaccin. Esta inhibicin se puede compensar aumentando la
concentracin de sustrato lo que permite alcanzar la misma velocidad mxima. El
efecto aparente del inhibidor es disminuir la afinidad de la enzima por el sustrato.
El cido malnico se parece al cido succnico lo suficiente como para combinarse con
la enzima en el sitio activo
18Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
De
Vo =
Vmax [S]
K m +[S]
Vo =
Vmax [S]
[I]
+ [S]
K m 1 +
K
I
[I]
K m ' = K m 1 +
KI
1 Km
=
V Vmax
[ y =
[I] 1 + 1
1 +
K I [S] Vmax
m
b ]
19Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
Inhibicin no competitiva
Inhibicin no competitiva pura
El inhibidor no se fija en el centro activo, sino en otro punto de la molcula enzimtica,
modificando la eficacia cataltica de sta. La unin del inhibidor a la enzima no es
excluyente para el sustrato, pero el complejo ternario ESI no origina productos de
reaccin.
Esta inhibicin no afecta a la constante de Michaelis de la enzima, pero disminuye la
velocidad mxima. El resultado aparente es que hay menos molculas enzimticas
dispuestas a actuar sobre el sustrato. El efecto de inhibicin no se contrarresta al
aumentar la concentracin de sustrato; la inhibi-cin depende slo de la concentracin
del inhibidor.
20Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
De
Vo =
Vmax [S]
K m +[S]
Vo =
Vmax [S]
[I]
1 +
KI
Vmax ' =
( K m + [S] )
Vmax
[I]
1 +
KI
1
Km
I 1
1
I
+
1 +
1 +
=
Vo Vmax K I [S] Vmax K I
[ y = m
x + b
21Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
Como ejemplos de esta inhibicin tenemos enzimas que tienen como cofactores
metales y son inhibi-os reversiblemente por EDTA o enzimas que tienen grupos
tilicos (-SH) que reaccionan reversible-mente con metales pesados, como Pb++, Hg++
y Ag+.
Inhibicin no competitiva mixta
De
Vo =
Vmax [S]
K m +[S]
Vo =
Vmax
[I]
1+
KI
[S]
[I]
K m 1 +
KI
+ [S]
22Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
Vmax ' =
Vmax
[I]
1 +
K
I
[I]
K m ' = K m 1 +
KI
K
1
= m
Vo Vmax
I 1
1
1 +
+
[S] V
K
I
max
[ y =
1 +
K
I
Inhibicin acompetitiva
El inhibidor slo se une al complejo enzima-sustrato, y no a la enzima libre. El
complejo ternario ESI tampoco origina producto final. Como resultado, la velocidad
mxima disminuye (ya que no todos los complejos ES van a producir reaccin) pero la
constante de Michaelis aparente disminuye: aumenta la estabilidad del complejo ES
por la presencia del inhibidor.
23Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
FIGURA 2.21
De
Vo =
Vmax [S]
K m +[S]
Vo =
Vmax
[I]
1+
KI
[S]
Km
[I]
1+
KI
+ [S]
Vo =
Vmax
[I]
1+
KI
[S]
[I]
K m + [S] 1 +
KI
[I]
1+
K I
24Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
Vo =
Vmax
[I]
1 +
K
I
[I]
[S] 1 +
K
I
[I]
K m + [S] 1 +
KI
Eliminando trminos
Finalmente
Vmax [S]
Vo =
Km
[I]
+ [S] 1 +
KI
Vmax ' =
Vmax
[I]
1 +
K
I
Km ' =
Km
[I]
1 +
K
I
K
1
1
1
= m
+
Vo Vmax [S] Vmax
[ y =
1 +
KI
25Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
El efecto cooperativo se atribuye a que la enzima presenta varios centros activos (uno
por cada monmero), ya que puede adoptar dos conformaciones espaciales distintas:
la forma R (relajada) ms activa, y la forma T (tensa) menos activa, en equilibrio
dinmico. La presencia del sustrato puede despla-zar el equilibrio, favoreciendo la
adopcin de una de ellas, de acuerdo con el esquema siguiente:
26Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
E + n S ES n E + P
Por un razonamiento anlogo al seguido con la deduccin de la ecuacin de Michaelis
se llega a lo siguiente:
V max [S ]
Vo =
Km + [S ]
Vmax [S] n
V =
n
+ [S] n
K 0.5
Vmax [S] n
V =
n
+ [S] n
K 0.5
27Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
S
V
=
Vmax V K 0.5
log
V
= n log S n log k 0.5
Vmax V
Y = mx b
A n se le denomina coeficiente de Hill. Si su valor es 1, no existe cooperatividad; si es
mayor que 1, hay cooperatividad positiva; y si es menor que 1, la cooperatividad es
negativa. Sus valores habituales en las enzimas reguladoras oscilan entre 2 y 3
Efectores alostricos
Las enzimas alostricas modifican su actividad cataltica al fijar determinados ligandos
sobre el centro activo: sustrato natural, sustrato anlogo, inhibidores competitivos,
28Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia
entre otros. Estos ligandos se podran denominar ligandos homotrpicos, pero con
frecuencia estos u otros compuestos pueden fijarse a centros diferentes del centro
cataltico, llamados centros alostricos. Estos ligandos sern heterotrpicos y
tambin son capaces de modificar la actividad cataltica de las enzimas reguladoras.
Los inhibidores alostricos disminuyen o anulan la actividad cataltica de la enzima y
los activadores alostricos la aumentan.
La activacin o inhibicin puede afectar a diversos parmetros de la cintica
enzimtica. Entre los modelos clsicos se consideran los sistemas K en los que se ve
afectada la K0.5 y los sistemas V, en los que resulta alterada la velocidad mxima.
En el esquema A es activador o modulador positivo e I es modulador negativo o
inhibidor.
29Recopilado por Luz del Carmen Ornelas Hernndez Profesora de Bioqumica. Instituto Tecnolgico de Morelia