FACULTADTtulo:

DE CIENCIAS FARMACEUTICAS Y
BIOQUIMICAS

MTODOS DE COLORACIN

Asignatura: Microbiologa
Docente responsable: Jacinto Hervias, Pedro
Grupo de laboratorio: G1
Integrantes:

Ajahuana Villafan, Teresa Mnica

Cruzat Campos, Alexandra
Echeverra Vega, Patricia
Huaman Pashanasi, Gisela
Quintana Blas, Paola
Silva Villacrez, Jhuliana
Vargas Huyhua, Milagro

Semestre acadmico: 2015 2

Ciclo acadmico: VIII

LIMA PER
2015

INTRODUCCIN

El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan

difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de
contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de
aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden
emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la
presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos,
esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna
afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados
con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se
combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados
negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos.
Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y
la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente
(aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados
positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la
eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son
sustancias liposolubles. Los colorantes de este grupo se combinan con los
materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la
localizacin de las gotculas o depsitos de grasa
En el presente informe se desarrollarn los mtodos de coloracin, as como
la tincin cido resistente dndose a conocer los resultados obtenidos en la
prctica.

I.

COMPETENCIAS

II.

Realizar manualmente mtodos de tincin habituales usados

en la preparacin de lminas de observacin
Describir minuciosamente sus observaciones, al microscopio

MARCO TEORICO
TINCIONES UTILIZADAS EN MICROBIOLOGIA
Tcnicas de tincin. Fundamentos
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan
difciles de ver con el microscopio
ptico. La principal dificultad es la
falta de contraste entre la clula y el
medio que la rodea, y el medio ms
simple de aumentar el contraste es la
utilizacin
de
colorantes. Estos
pueden emplearse para distinguir
entre tipos diferentes de clulas o
para
revelar
la
presencia
de
determinados
constituyentes
celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares,
centros de actividad respiratoria, etc.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma
antes de teirlas, proceso llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin
por el calor es lo ms corriente, aunque tambin puede fijarse con
sustancias qumicas como formaldehido, cidos y alcoholes. Despus
de la fijacin, si se aade el colorante, no se producen ulteriores
cambios estructrales en el protoplasma. La fijacin se realiza
habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre un portaobjetos.
Tratando despus ste con el agente fijador, y siguiendo
inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce
habitualmente el encogimiento de las clulas; la tincin, por el
contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que es
realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido
fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin.
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen
alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos
colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas
positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los
constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los
cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes
catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.
Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y
se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente,
tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la

fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias

liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los
materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la
localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un ejemplo de
colorante liposoluble es el negro Sudn.
Algunos colorantes teirn mejor slo
despus de que la clula haya sido tratada
con otra sustancia qumica, que no es un
colorante por s mismo. Esta sustancia se
denomina
mordiente;
un
mordiente
habitual es el cido tnico. El mordiente se
combina con un constituyente celular y lo
altera de ta1 modo que ahora s podr
atacar el colorante.
Si se desea simplemente incrementar el
contraste
de
las
clulas
para
la
microscopa, son suficientes los procedimientos simples de tincin. EI azul
de metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas las clulas
bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que
oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la
presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte
del material no celular no se tie.
La tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las
clulas se dejan sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea.
Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para
la tincin negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los
constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la
tinta china (que es una suspensin de partculas de carbono coloidal) o la
nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tincin negativa es un
modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la microscopia
ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas
alrededor de las clulas bacterianas.
Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con
precaucin, ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante
forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras
celulares autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales
inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan
artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad
de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una
estructura realmente existente.

Examen microscpico de las muestras clnicas. Sin tincin

No se utiliza ningn tipo de colorante.
Es el montaje directo hmedo o examen en fresco: las muestras se
extienden directamente sobre la superficie de un portaobjetos para su
observacin. El material que es demasiado espeso para permitir la

diferenciacin de sus elementos puede diluirse con igual volumen de

solucin salina fisiolgica estril. Se deposita suavemente un cubreobjetos
sobre la superficie del material.
Este tipo de preparacin se emplea para detectar trofozotos mviles de
parsitos intestinales como Giardia, Entamoeba, huevos y quistes de otros
parsitos, larvas y gusanos adultos, Trichomonas, hifas de hongos, etc.

Examen microscpico Tincin simple

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se
tien con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de
lactofenol).
El Hidrxido de potasio al 10%
(solucin de KOH) permite ver
elementos de hongos ya que el
KOH digiere
parcialmente
los
componentes proteicos, por ejemplo
de la clula husped, pero no acta
sobre los polisacridos de las
paredes celulares de los hongos.
La tinta china o Nigrosina permite
observar
clulas
levaduriformes
capsuladas (Cryptococcus), sobre
todo en LCR. Los polisacridos capsulares rechazan la tinta china y la
cpsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul
de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de
heces para observar la presencia de leucocitos.

Examen microscpico de las muestras clnicas muy modificadas.

Tincin diferencial
Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se
diferencian en funcin de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con
su propia constitucin qumica.
Los ejemplos clsicos seran la tincin de GRAM o la de Ziehl-Neelsen.
Examen de muestras al microscopio: la tincin GRAM
La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el
laboratorio bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar
perfectamente familiarizado. Su utilidad prctica es indiscutible y en el
trabajo microscpico de rutina del Laboratorio de Microbiologa las
referencias a la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos,
negativos, etc.) se basan justamente en la tincin de GRAM

Descrita
en
forma
breve,
la
secuencia de la tincin es la
siguiente: el Frotis fijado con calor se
tie 1 min con Violeta Cristal, se lava
con agua, se cubre con solucin
Yodada durante 1 min y se lava de
nuevo con agua, decolorar con
mezcla
alcohol
etlico/acetona.
Escurrir y cubrir con Safranina (color
de contraste) durante 20 seg. Lavar
y secar.
Esta tincin se denominada as por el
bacterilogo dans Christian Gram,
quien la desarroll en 1844. Sobre la
base de su reaccin a la tincin de
Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram positivas y
gramnegativos (en este caso, los trminos positivo y negativo no tiene nada
que ver con carga elctrico, sino simplemente designan dos grupos
morfolgicos distintos de bacterias).
Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tien de forma distinta
debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes
celulares. La pared de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma
al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared
celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la
clula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas
de peptidoglicano as como algo de cido teicoico. Generalmente, 80%-90%
de la pared de la clula Gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la
clula Gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho ms delgada,
nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior
compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo 10% 20% de la pared de la clula Gram-negativa es peptidoglicano.
Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias
fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos
aqu con algn detalle la tincin de Gram y las interpretaciones que
actualmente se hacen sobre el porqu de su funcionamiento.
Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien, primero con una
solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y
son lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado,
todas las clulas, tanto las Gram positivas como las gramnegativos, estn
teidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo-yoduro
potsico. El ingrediente activo es aqu el I2; el KI simplemente hace soluble
el I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en
agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas Gram positivas como
las gramnegativos se encuentran en la misma situacin.
Se lleva a cabo despus la decoloracin, usando una mezcla de alcoholacetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal violeta.

Algunos organismos (Gram positivos) no se decoloran, mientras que otros

(gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de
clulas est por tanto en su resistencia a la decoloracin; esta resistencia se
debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias Gramnegativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipdico y disuelve la
membrana exterior de la pared de la clula (y tambin puede daar la
membrana citoplsmica a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de
peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la
clula se decolora. Las clulas Gram positivas, a causa de sus paredes
celulares ms espesas (tienen ms peptidoglicano y menos lpido), no son
permeables al disolvente ya que ste deshidrata la pared celular y cierra los
poros, disminuyendo as el espacio entre las molculas y provocando que el
de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular.
Despus de la decoloracin las clulas Gram positivas son todava azules,
pero las gramnegativos son incoloras.
Para poner de manifiesto las clulas gramnegativos se utiliza una coloracin
de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina
o la fucsina bsica. Despus de la coloracin de contraste las clulas
gramnegativos son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen
azules.
Deben destacarse algunos aspectos cruciales de la tincin de Gram:
1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con
yodo. El yodo por s solo tiene poca afinidad con las clulas.
2) La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que
pierdan la tincin las clulas Gram positivas. EI proceso de
decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del
tiempo para obtener resultados satisfactorios.
3) Cultivos ms viejo de 24 horas puede perder su habilidad de
retener el complejo cristal violeta-yodo.
El carcter de Gram positivo no es siempre un fenmeno del todo o nada.
Algunos organismos son ms Gram positivos que otros y algunos son Gramvariables, es decir, unas veces Gram positivos y otras gramnegativos.

Otras tinciones de uso habitual

RODAMINA-AURAMINA
Los cidos miclicos de las paredes celulares de las mico bacterias poseen
afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se
fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja brillante
contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como
contraste, evita la fluorescencia inespecfica. Todos los microorganismos
cido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parsitos, se tien
con estos colorantes.
Un aspecto importante de la coloracin rodamina-auramiria es que luego los
frotis pueden ser reteidos con la coloracin de Ziehl-Neelsen o Kinyoun
directamente sobre la tincin con el fluorocromo, si se elimina antes el

aceite de inmersin. De esta forma, los resultados positivos pueden ser

confirmados con las coloraciones tradicionales, que adems permiten la
diferenciacin morfolgica.

NARANJA DE ACRIDINA
El fluorocromo naranja de acridina se une al cido nucleico ya sea en su
forma nativa o desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de
acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de
la concentracin. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante
vital, que da una fluorescencia verde si el microorganismo est vivo y roja si
est muerto. De todos modos, como el colorante se intercala en el cido
nucleico, el germen viable se inactivar poco tiempo despus de la tincin.
El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los
hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad
de estudios han demostrado que la tincin de hemocultivos con naranja de
acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la deteccin inicial de
hemocultivos positivos.

ZIEHL-NEELSEN (BAAR)
Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias. Contienen cidos
grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que
les confieren la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-cido,
despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cidoalcohol resistente. Las micro bacterias como M. tuberculosis y M. marinum y
los parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus
propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de ZiehlNeelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared
bacteriana que contiene ceras. Se ha desarrollado una coloracin de cidoalcohol resistencia modificada que diferencia las especies de Nocardia
(bacterias ramificadas filamentosas cuyas paredes celulares contienen
cidos-grasos de unos 50 tomos de carbono), de los actinomiceos (muy
semejantes pero no cido-alcohol resistentes). Nocardia spp son

decoloradas por la mezcla cido-alcohol estndar pero no por un

tratamiento ms suave con cido sulfrico 0,5 a 1%. Estos microorganismos
se denominan cido-alcohol resistentes parciales o dbiles.
El frotis se tie durante unos 5 min con Carbolfucsina aplicando calor suave.
Lavar con agua. Decolorar con alcohol etlico 95% con un 3% de ClH
concentrado. Lavar y teir durante 30-60 seg con Azul de Metileno (color de
contraste). Lavar y secar

BLANCO DE CALCOFLOR
Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calco flor
aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras
muestras. Segn fue descrito por Hageage y Harrington, este colorante se
emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales
clnicos. Tambin se emplea para aumentar la visualizacin de los elementos
morfolgicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos laboratorios ha
suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos
florecen con luz blanco-azulada o verde manzana, segn la fuente luminosa
que se utilice.

III.

METODO EXPERIMENTAL
a) COLORACION SIMPLE
1. .Se tom una pequea cantidad de la placa que contena la
siembra de Streptococcus agalactiae con el asa de
siembra y la esparcimos en el porta objeto (limpio y
desinfectado) agregando una gota de agua destilada.

2. Fijamos al calor la porta-objeto, a travs del mechero.

3. Cubrimos el porta objeto correctamente seco con azul de

metileno y dejamos actuar por 3 minutos.

4. Lavamos con agua a chorro lento, retirando la mayor

cantidad de coloracin azul posible y dejamos secar.

5. Observamos al microscopio .

b) COLORACION GRAM

1. Se utiliz como cultivo Shigella fexneri

2. Se tomo una pequea cantidad de la placa que contena la
siembra de con la asa de siembra y la esparcimos en porta
objeto (limpio y desinfectado) agregando una gota de agua
destilada .

shigella
fexneri

3. .Fijamos al calor el porta-objeto , a travs del mechero .

4. Cubrimos el frotis con reactivo de cristal violeta durante un minuto y

luego lo lavamos agua lentamente.

5. Cubrimos el frotis con solucin de lugol y lo dejamos durante 2

minutos.

6. Lavamos con agua corriente, y aplicamos lentamente el alcoholacetona.

7. Volvemos lavar el frotis y agregamos fuscina fenicada .

8. Lavamos con agua corriente y dejamos secar, para luego observarlo

en el microscopio .

c) COLORACION ACIDO RESISTENTE

a) Se utilizo como cultivo Enterobacter cloacas

b) Se tomo una pequea cantidad de la placa que contena la siembra
de con la asa de siembra y la esparcimos en porta objeto (limpio y
desinfectado) agregando fucsina fenicada al 5% y dejamos reposar 60
segundos antes de calentarlo.

c) Calentamos la preparacin con suavidad en el mechero de alcohol

por debajo del portaobjeto, haciendo que se desprendan algunos
vapores y evitando que la fucsina hierva , esto se repiti por 2 veces.

d) Enframos el porta-objeto con la muestra y lavamos con agua

corriente .Decoloramos con alcohol cido hasta que no arrastre
colorante.

e) Procedemos a cubrir el porta objeto con azul de metileno por 1

minuto .

6. Lavamos con agua corriente el porta objeto y lo demos secar

para observarlo en el microscopio.

d) COLORACION NEGATIVA
1. Colocamos varias asadas de cultivo en un porta objeto limpio,
cerca de uno de los bordes , el cultivo utilizado fue Escherichia
coli .

2. Colocamos un volumen igual de tinta china cerca del cultivo y los

mezclamos con el cultivo hasta esparcirlo hasta todo el porta objeto
.

3. Dejamos secar el frotis. Y cubrimos con fucsina fenicada durante

10 segundos, enjuagamos con agua y luego lo dejamos secar,
Procedemos a observarlo en el microscopio .

IV.

RESULTADOS Y DISCUSION

MTODOS DE COLORACIN

microorganismo

Coloracin
simple

Mtodo de coloracion
Coloracion de la Coloracin
Gram
acido
resistente
Gram
Gram -

Coloracin de
esporas

Coloracin
negativa:

tincin
especial o
de ZiehlNeelsen (B
AAR)

Estreptococcus
agalacteae
Shigella fexneri
Enterobacter
cloacae
~
Escherichia
coli

+++

~
~

~
~

++
~

~
--

~
~

~
~

~
~

~
~

~
~

~
~

~
~

~
+++

De que manera lo
identifico
Se
mostr
una
coloracin
del
azul
metileno identificando al
microorganismo .

microscopio:+++

No se presento: --No se realizo:~

Muestra encontradas
1. PRIMER
Estreptococcus

en

MICROORGANISMO:
agalacteae

Durante un tiempo determinado y luego se lava y acontinuacion el

portaobjetos se seca y se examina , en algunos caso se hace uso de
un mordiente para auentar la afinidad de la muestra biologica por
un colorante otra es cubrir una estructura (como un flagelo) para
darle mayor espesor y facilitar la observacion despues del teido. El
colorante se aplica extendidamente una de las funciones de una
mordiente es aumentar la afinidad de la muestra biolgica por u
colorante , cubrir otra estructura.(flagelo)para darle mayor espsor y
fragilidad a la observacin despus del teido.

Tie membrana
citoplasma de la bacteria encontrado en
Introduccin a la microbiologa escrita por Gerard J. Tortora,
Berdell R.

2. SEGUNDO
spp fexneri

De que
identifico

manera

lo

MICROORGANISMO: Shigella

Se observo una tincin

rojiza esto se debe por el
colorante usado como
contrastador.
encontrando
Gram
negativas

Las bacterias Gram-negativas tienen una bicapa lipdica gruesa en la

parte exterior, que es selectivamente permeable, no todo puede
pasan a travs de ella, y una de esas cosas es la tincin de Gram.
encontrado en Microbiologa clnica prctica escrita por Pedro Garca
Martos

3. TERCER MICROORGANISMO: Enterobacter cloacae

De que manera lo
identifico
No se pudo identificar
zonas coloradas esto
se debe a que el
microorganismo no es
acido resistente por ello
se vio de color azul

la propiedad de la acido alcohol resistencia no se conoce a fondo pero

se sabe que solo las celulas intactas con alto contenido lipdico
poseen este carcter , dependiente dela mayor solubilidad del
colorante fenicado en los lpidos celulares que en decolorante son las
micobacterias BAAR por excelencia principalmente su contenido

fosfolipidico abarca 40% de peso secototal, en la fraccion

insaponificable se encuentran sustancias de elevado peso molecular
como el acido micolico que es el responsable del acido alcohol
resistencia encontrado en Introduccin a la microbiologa escrita
por Gerard J. Tortora, Berdell R.
Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen cidos grasos
(cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que
les confieren la propiedad de resistir la decoloracn con alcoholcido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se
denominan cido-alcohol resistentes.
La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para
que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al
suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva
solidificacin de lo cidos grasos de modo que el colorante ya no
puede salir de las bacterias. Por otro lado, el
calentamiento aumenta la energa cintica de De que manera lo
las molculas del colorante lo cual tambin identifico
presento
facilita su entrada a las bacterias. Las Se
la
bacterias que resisten la decoloracin son de rpidamente
coloracin
azul
de
la
color rojo y las que no, se ven de color azul
china
en
ya que se utiliza azul de metileno como tinta
tincin
de
contraste.encontrado
en microorganismo como
Microbiologa clnica prctica Escrita por una zona transparente
Pedro Garca Martos
que rodea a la pared
4. CUARTO MICROORGANISMO:
se realizo

no

5. QUINTO
MICROORGANISMO:
Echericha coli

V.

CONCLUSIONES

VI.

En la prctica se analiz en base a la teora las distintos mtodos de

coloracin y se realiz su respectivo ensayo
El microorganismo Estreptococcus agalacteae se puso analizar
con rapidez en el microscopio sin necesidad de ningn mordiente
Mediante el anlisis del mtodo de coloracin Gram se pudo
determinar que el microorganismo o inoculo era un Gram negativo
debido a su descoloracin
El microorganismo usado fue el Shigella fexneri este se pudo
observarlo al llevarlo al microscopio su color rojiza caracterstica
principal de la GRAM negativa
Los microorganismo acido resistentes mediante la prctica se pudo
determinar que estos poseen un gran contenido fosfolipidico que
hace que pesar de un descolorante permanezcan del color de su
colorante.
En caso del Enterobacter cloacae no es acido resistente debido a
que este cambio a color azul .si hubiese sido acido resistente seria de
color rojizo
En caso del Echericha coli se observ una zona transparente que
rodea a la pared permitiendo determinar la ubicacin dela cpsula
bacteriana.

CUESTIONARIO

1. Qu importancia tiene la pared celular bacteriana en la

coloracin de Gram?
La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el
laboratorio bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar
perfectamente familiarizado, ya que permite diferenciar dos grandes grupos
de bacterias (Gram+ y Gram-), segn se comporten ante esta tincin. El
fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos
grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en
su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de
peptidoglicano ms fina y una capa lipopolisacardica externa. Tras la tincin
con el primer colorante (Cristal violeta) se efecta un lavado con etanol que
arrastrar al colorante slo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el
colorante queda retenido y las clulas permanecern azules. Las clulas
Gram (-) se teirn despus con un colorante de contraste (safranina) para
que puedan observarse.
2. Cules son las diferencias qumicas importantes que explican el
estado cido-resistente?
La Resistencia acido- alcohol tiene capacidad de incorporar ciertos
colorantes y retenerlos despus de someterlos a la accin de cidos y
alcoholes y est determinada por la presencia en la pared celular de los

cidos miclicos que son cidos grasos de cadenas ramificadas de alto peso
molecular (60 a 70 tomos de carbono). Las micobacterias son bacilos
cido-alcohol
resistente,
corto,
ligeramente
curvo.
El
gnero
Mycobacterium, incluido en esta clasificacin, comprende especies
patgenas para el hombre, animales y especies saprfitas. El grado de
cido-alcohol resistencia es variable entre las especies de este gnero y
est relacionado muchas veces con las condiciones culturales, no pudiendo
utilizarse esta diferencia para distinguirlos entre s. Los bacilos cidoalcohol resistentes (BAAR) se observan de color rojo al ser coloreados con
los colorantes para Ziehl Neelsen, mientras que otros grmenes y clulas
toman distintos tonos de azul debido al azul de metileno que se utiliza como
colorante de contraste. La coloracin de Ziehl Neelsen constituye una
tcnica sencilla rpida y econmica, de baja sensibilidad.

VII.

REFERENCIAS

MICROBIOLOGA CLNICA MEDIOS DE CULTIVO (CURSO 2012-2013)

(GRUPOS 1 y 2) universidad 5,7,8
Microbiologa Mdica + StudentConsult, 6a ed., Patrick R. Murray
,edicin 2 , 2009,, 68 .89
Centro Nacional deBiopreparados. La Habana, Cuba, Enterococcus,
medios de cultivo convencionales y cromognicos ,MSc. Marilyn Daz
Prez, Dr. C. Claudio Rodrguez Martnez, Dra. C. RaisaZhurbenko,
Cruickshank, R. Medical Microbiology, 11th ed., London: Livingstone
LTD, 1968, p.268. - MacFaddin. 1985.
Media forisolation-cultivation-identificationmaintenance of medical
bacteria, volume 1. Williams &Wilkins, Baltimore, Md. - Grasmick.
1992.
In Isenberg (ed.), Clinicalmicrobiologyprocedureshandbook, vol. 1.
American SocietyforMicrobiology, Washington, D.C.
Rojas N, Chaves E, Garca F (2006) Bacteriologa Diagnstica, Costa
Rica, Universidad de Costa Rica, Facultad de Microbiologa.
Garca R, Crdoba R, (1988) Manual Ilustrado para Laboratorio de
Bacteriologa y Micologa Veterinaria.