ISOLASI DNA

Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti
protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni
penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan
protein, serta pemurnian DNA.
DNA terdapat pada seluruh jaringan dan cairan tubuh. Oleh karena itu DNA genom
dapat diisolasi dari semua bahan biologis yang mengandung sel berinti, seperti darah, semen,
akar rambut, tulang, liur dan lain-lain. Bahan yang paling sering digunakan untuk tujuan
isolasi DNA adalah darah dan rambut beserta akarnya, karena kedua bahan tersebut relatif
mudah diperoleh. DNA dapat diisolasi sekalipun dengan menggunakan bahan kering seperti,
bercak darah maupun preparat autan, selain itu DNA juga dapat diisolasi dari produk olahan.
DNA yang biasa digunakan dalam tes ada dua yaitu DNA mitokondria dan DNA inti
sel. Perbedaan kedua DNA ini hanyalah terletak pada lokasi DNA tersebut berada dalam sel,
yang satu dalam inti sel sehingga disebut DNA inti sel, sedangkan yang satu terdapat di
mitokondria dan disebut DNA mitokondria. Untuk tes DNA, sebenarnya sampel DNA yang
paling akurat digunakan dalam tes adalah DNA inti sel karena inti sel tidak bisa berubah.
DNA dalam mitokondria dapat berubah karena berasal dari garis keturunan ibu yang dapat
berubah seiring dengan perkawinan keturunannya. Sebagai contoh untuk sampel sperma dan
rambut. Yang paling penting diperiksa adalah kepala spermatozoanya karena didalamnya
terdapat DNA inti, sedangkan untuk potongan rambut yang paling penting diperiksa adalah
akar rambutnya. Tetapi karena keunikan dari pola pewarisan DNA mitokondria menyebabkan
DNA mitokondria dapat dijadikan sebagai marka (penanda) untuk tes DNA dalam upaya
mengidentifikasi hubungan kekerabatan secara maternal.
A. Tahapan Isolasi DNA dari Sampel Darah
DNA diisolasi dari sampel darah. Darah disentrifus membentuk whole blood yang
terdiri dari tiga lapisan, yaitu plasma, endapan, dan buffy coat. Buffy coat merupakan
lapisan sel darah yang memiliki inti sel, seperti halnya sel darah putih. Pada saat
pemipetan lapisan buffy coat, endapan tidak boleh ikut terbawa karena dapat
mengganggu jalannya proses isolasi DNA.
Lapisan buffy coat ditambahkan larutan pelisis sel. Perbandingan darah dengan
larutan pelisis sel yaitu 1 : 3, bila menggunakan 300 L darah (buffy coat)
memerlukan 900 L larutan pelisis sel. Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan

untuk melisiskan sel darah merah yang tidak mengandung DNA genom, agar sel
darah putih yang mengandung inti sel dapat diisolasi atau dipisahkan dari sel darah
merah. Setelah itu, campuran darah dan pelisis sel didiamkan pada suhu ruang selama
10 menit, agar reaksi berjalan sempurna serta keduanya dapat bercampur homogen.
Kemudian dapat disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 20 detik, dan
supernatannya dibuang. Sebagaimana telah diketahui, DNA genom terdapat di dalam
kromosom, dan benang-benang kromosom terdapat dalam inti sel baik haploid (n)
pada sel kelamin/ sel gamet maupun diploid (2n) pada sel tubuh/ dikenal dengan sel
somatis. Kromosom sel tubuh berjumlah 46, sedangkan pada sel kelamin jumlahnya
hanya 23.
Darah yang telah lisis (hemolisat) ditambahkan larutan pelisis inti sel yang merupakan
bahan pengawet DNA sebanyak 300 L, guna melisiskan inti sel darah putihnya.
Bahan pengawet DNA merupakan deterjen anionik yang berguna untuk melarutkan
komponen seluler, seperti halnya tween-20. Bahan pengawet DNA juga dapat
mengurangi aktivitas DNase yang terdapat dalam sel.Inti sel harus dilisiskan, karena
substansi gen yang kita inginkan ada di dalamnya. Biasanya tidak diperlukan proses
inkubasi, namun apabila gumpalan sel masih terlihat setelah proses pencampuran,
perlu dilakukan inkubasi pada suhu 370C atau pada suhu ruang hingga larutan
homogen. Sampel yang disimpan pada suhu ruang dapat tetap stabil, selama
sekurang-kurangnya 18 bulan. Kemudian divortex, guna mempercepat proses
pelisisan inti sel, dan supernatannya dibuang.
Setelah ditambahkan pelisis inti sel, dapat pula ditambahkan RNase. Sedangkan
RNase berguna untuk menyingkirkan kontaminasi RNA. Biasanya larutan RNase A
ditambahkan ke dalam lisat sel, kemudian diinvert 50 kali dan diinkubasi pada suhu
370C selama 15 menit. Tetapi karena tahap ini kurang begitu berarti dalam isolasi
DNA sehingga tidak dilakukan pada praktikum kami.
Selanjutnya adalah tahap pengendapan protein. Protein yang terdapat dalam lisat sel
diendapkan dengan penambahan larutan pengendap protein sebanyak 100 L,
kemudian divortex selama 20 detik sehingga pengendap protein dan lisat sel dapat
bercampur secara menyeluruh. Selanjuntnya masuk ke proses sentrifus, dengan
kecepatan sentrifugasi 13.000 rpm selama 3 menit. Endapan protein akan membentuk
butiran coklat tua yang padat.

 Tahap berikutnya adalah tahap pengendapan DNA. Supernatan yang diperoleh dari
hasil sentrifugasi pengendapan protein mengandung DNA dan selanjutnya dituangkan
secara hati-hati ke dalam tabung yang berisi 300 L isopropanol 100% (dingin).
Endapan protein dapat dibuang. Penambahan isopropanol dingin bertujuan untuk
mempercepat reaksi pengendapan/ presipitasi DNA genom. Kemudian tabung
diinvert/ dibolak-balik ( 1 invert = 1 bolak-balik) sebanyak 50 kali secara
perlahan, hingga terlihat adanya benang-benang putih DNA yang membentuk
gumpalan. Setelah itu disentrifus dengan kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit, DNA
akan tampak sebagai butiran putih kecil, dan supernatan dibuang. Tabung dikeringkan
pada suhu ruang sampai kering, atau dapat pula dikeringkan dengan hairdryer/ alat
pengering rambut. Bila melakukan proses pengeringan dengan cara yang kedua, harus
lebih hati-hati, agar DNA tidak hilang. Selanjutnya butiran DNA genom dicuci
dengan penambahan alkohol 70% (dingin) sebanyak 300 L, diinvert kembali
sebanyak 50 kali agar proses pencucian sempurna, kemudian disentrifus dengan
kecepatan 13.000 rpm selama 3 menit dan supernatannya dibuang. Etanol dituang
dengan hati-hati tanpa mengeluarkan butiran DNA. Tabung selanjutnya dapat
dikeringkan dengan alat pengering rambut selama 15 menit atau sampai tabung
kering.
Tahap selanjutnya adalah tahap menghidrasi DNA. Larutan penghidrasi DNA
sebanyak 100 L ditambahkan ke dalam tabung berisi butiran DNA. DNA genom
dipanaskan pada suhu 650C selama 1 jam atau dapat pula dibiarkan mengalami
rehidrasi selama semalaman pada suhu ruang. Setelah itu tabung diketuk-ketuk secara
periodik untuk menyebarkan DNA dalam larutan. DNA dapat disimpan pada suhu
-200C untuk menghindarkan terjadinya kontaminasi, sehingga DNA akan selalu dalam
keadaan murni.
Jumlah DNA yang didapat dari darah umumnya > dari 35 g DNA per mL darah. Dari
300 L sediaan (buffy coat), hasil DNA yang diharapkan berkisar antara 5 sampai 10
mg. Pengukuran serapan DNA dilakukan pada panjang gelombang 260 nm (A

).

260

Pada A260 = 1, konsentrasi DNA adalah 50 mg/mL. Konsentrasi DNA dapat ditentukan
dengan rumus: Konsentrasi DNA (mg/mL) = A260 50 mg/mL / Pengenceran.
DNA yang diperoleh sangat tergantung pada jumlah sel darah putih dalam sampel
darah atau sumsum tulang. Jumlah sel darah putih dalam sampel bervariasi, tapi rata-rata

terdapat 7 106/ mL darah. Setiap sel rata-rata mengandung 6 pikogram DNA. Hasil yang
didapat mungkin lebih rendah, bila sampel darah dikumpulkan tanpa EDTA atau
penyimpanannya tidak tepat, atau bila sampel disimpan lebih dari 5 hari sebelum digunakan
dalam prosedur isolasi DNA ini. Kemurnian DNA ditentukan dengan nilai indeks kemurnian.
DNA yang murni memiliki indeks kemurnian > 1,75. Indeks Kemurnian = A260 / A280. Bila
indeks kemurnian < 1,75 menandakan, mungkin masih terdapat adanya protein pada saat
proses pengendapan DNA, sehingga benag-benang kromosom masih bercampur dengan
protein.
Proses PCR
Tahapan selanjutnya adalah memasukan sampel DNA yang telah dimurnikan kedalam
mesin PCR (polymerase chain reaction) sebagai tahapan amplifikasi. Komponen dari reaksi
PCR diinkubasi di dalam suatu mesin yang dapat mengatur perubahan suhu secara tepat
(dikenal sebagai Thermal cycler). Tahap pertama adalah denaturasi DNA yaitu dengan cara
meningkatkan temperatur hingga kurang lebih 940C selama 1 menit, sehingga terjadi
pemisahan dari kedua untai DNA dupleks. Tahap kedua adalah tahap penempelan
oligonukleotida primer (annealing/ hibridasi). Pada tahap ini suhu reaksi diturunkan menjadi
500C-620C (600C) selama 1 menit agar oligonukleotida dapat menempel pada DNA. Tahap
ketiga adalah tahap pemanjangan rantai yaitu dengan cara memaskan kembali komponenkomponen reaksi pada suhu 720C selama 1 menit sehingga primer dapat diperpanjang oleh
enzim DNA polimerase hingga mencapai seluruh panjang dari DNA sasaran. Ketiga tahap ini
diulang sebanyak 25-35 kali. Peningkatan jumlah siklus PCR diatas 35 siklus tidak memberikan
efek yang positif.

Jadi, setiap DNA dupleks pada siklus pertama akan membentuk 2 untai anak
sehingga seluruhnya terdapat 4 untai DNA. Selanjutnya selama siklus kedua, keempat untai
ini akan berfungsi sebagai cetakan dan akan dihasilkan 8 untai DNA. Pada akhir dari siklus
kedua akan terbentuk polinukleotida yang panjangnya hanya terbatas dari satu primer ke
primer lainnya. Fragmen DNA ini disebut amplikon. Sklus selanjutnya akan menghasilkan
penggandaan dari jumlah amplikon.Prosedur PCR dapat memperbanyak jumlah DNA hingga
beberapa juta kali
Hasil akhir dari tahap amplifikasi ini adalah berupa kopi urutan DNA lengkap dari
DNA sampel. Selanjutnya kopi urutan DNA ini akan dikarakterisasi dengan elektroforesis
untuk melihat pola pitanya. Karena urutan DNA setiap orang berbeda maka jumlah dan lokasi
pita DNA (pola elektroforesis) setiap individu juga berbeda. Pola pita inilah yang disebut

DNA sidik jari (DNA finger print) yang akan dianalisa pola STR nya. Tahap terakhir adalah
DNA berada dalam tahapan typing, proses ini dimaksudkan untuk memperoleh tipe DNA.
Mesin PCR akan membaca data-data DNA dan menampilkannya dalam bentuk angka-angka
dan gambar-gambar identfikasi DNA. Finishing dari tes DNA ini adalah mencocokan tipetipe DNA.
Untuk metode tes DNA di Indonesia, masih memanfaatkan metode elektroforesis
DNA. Dengan intreprestasi hasil dengan cara menganalisa pola DNA menggunakan marka
STR (short tandem repeats). STR adalah lokus DNA yang tersusun atas pengulangan 2-6
basa. Dalam genom manusia dapat ditemukan pengulangan basa yang bervariasi jumlah dan
jenisnya. Dengan menganalisa STR ini, maka DNA tersebut dapat diprofilkan dan
dibandingkan dengan sampel DNA terduga lainnya.
Komponen PCR
Pada reaksi PCR diperlukan DNA template, primer spesifik, ensim DNA polimerase yang
thermostabil, buffer PCR, ion Mg 2+, dan thermal cycler.
2.1 Template DNA
Ukuran target amplifikasi biasanya kurang dari 1000 pasangan basa (bp) atau 1KB, Hasil
amplifikasi yang efisien antara 100-400bp. Walaupun kemungkinan hasil amplifikasi lebih
dari 1 kB tetapi prosesnya kurang efisien, karena produk yang panjang rentan terhadap
inhibitor yang mempengaruhi kerja ensim DNA polymerase dan waktu yang diperlukan lebih
lama. Hal ini dapat menyebabkan hasil amplifikasi yang tidak diinginkan.
2.2 Primers
Primer disusun dari sintesis oligonukleotida sepanjang 15-32bp dan primer ini harus mampu
mengenali urutan yang akan diamplifikasi. Untuk standar amplifikasi sepasang primer akan
mempunyai kisaran pasangan basa sekitar 20 basa panjangnya pada tiap primernya.
Kandungan GC harus antara 45-60%. Annealing temperatur antara primer yang digunakan
harus berkisar antara 1C. Ujung 3 dari setiap primer harus G atau C, akan tetapi hindari
susunan nukleotida G/C berturut-turut tiga pada ujung ini, misal CCG, GCG, GGC, GGG,
CCC, GCC. Pada penentuan atau penyusunan sepasang primer, penting diperhatikan urutan
primer tidak saling komplementer sehingga membentuk dimer-primers, berikatan satu sama
lain, atau membentuk hairpins. Hal lainnya hindari menyusun primer pada daerah DNA
repetitif.
2.3 Taq DNA polymerase

Enzim ini bersifat thermostabil dan diisolasi dari Thermus aquaticus. Aktivitas polimerisasi
DNAnya dari ujung-5 ke ujung-3 dan aktivitas enzimatik ini mempunyai waktu paruh
sekitar 40 menit pada 95C. Biasanya untuk setiap 100l volume reaksi ditambahkan 2.0-2.5
unit.
2.4 PCR buffer dan konsentrasi Mg2+
Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50mM KCl, 10mM Tris-Cl (pH8.3) dan 1.5mM
MgCl2. Buffer standard ini akan bekerja dengan baik untuk DNA template dan primer dengan
kondisi tertentu, tetapi mungkin tidak optimum dengan kombinasi yang lain. Produk PCR
buffer ini terkadang dijual dalam bentuk tanpa atau dengan MgCl2.
Konsentrasi ion magnesium dalam PCR buffer merupakan faktor yang sangat kritikal, karena
kemungkinan dapat mempengaruhi proses annealing primer, temperatur dissosiasi untai DNA
template, dan produk PCR. Hal ini disebabkan konsentrasi optimal ion Mg2+ itu sangat
rendah. Hal ini penting untuk preparasi DNA template yang tidak mengandung konsentrasi
chelating agent yang tinggi, seperti EDTA atau phosphat. Ion Mg 2+ yang bebas bila terlalu
rendah atau tidak ada, maka biasanya tidak menghasilkan produk akhir PCR, sedang bila
terlalu banyak ion Mg2+yang bebas akan menghasilkan produk PCR yang tidak diinginkan.
2.5 Nucleotides (dNTPs)
Konsentrasi yang biasanya digunakan untuk setiap dNTP adalah 200 M. Pada konsentrasi
ini penting untuk mengatur konsentrasi ke-empat dNTP pada titik estimasi Km untuk setiap
dNTP. 50mM, harus selalu diatur pH7.0. Konsentrasi yang tinggi akan menimbulkan
ketidakseimbangan dengan enzim polymerase. Sedang pada konsentrasi rendah akan
memberikan ketepatan dan spesifitas yang tinggi tanpa mereduksi hasil akhir. Total
konsentrasi dNTP dan ion saling terkait dan tidak akan merubah secara bebas.
2.6 PCR Thermal Cycler
PCR thermal cycler pertama kali dikembangkan oleh perusahaan PerkinElmer
sebagai pemegang paten asli. Pada saat ini telah diproduksi berbagai macam tipe alat PCR
thermal cycler ini dari berbagai perusahaan yang bergerak dalam bioteknologi. Walaupun
nama masing-masing alat itu berbeda tetapi prinsip kerjanya sama.