INSTITUTO

POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA
PRODUCCIN Y CONTROL DE BIOLGICOS

PRUEBAS DE ESTERILIDAD POR MTODO

FARMACETICO
(USP / FEUM) Y NUEVOS MTODOS

P R E S E N T A N:

QBP. VILA MELO JOS LUIS

QBP. BASURTO RODRIGUEZ SHAILA DE LOS ANGELES
QBP. VILLAGMEZ GARFIAS CATALINA

PROFESOR:
DR. MARIO GONZLEZ PACHECO

MXICO, D. F. JUNIO, 2015

NDICE
Pp.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Introduccin...
Pruebas de esterilidad.....
Shays
Prueba de promocin crecimiento de aerobios, anaerobios y hongos
Precauciones para prevenir contaminacin microbiana.
Shays
Pruebas de esterilidad del producto a examinar
Nuevos mtodos
I. Bioluminiscencia..
II. Deteccin de virus en productos biolgicos
III. Algo
9. Anexos
I. Validacin de la prueba de esterilidad para vacunas virales en
II.
III.

vehculos oleoso y acuoso..

Gua de Monitoreo de Higiene por Bioluminiscencia..
Tecnologa de enzimas: Mejorando los beneficios de la deteccin
microbiana rpida.

~1~

01
02

INTRODUCCIN
El objetivo de un proceso de esterilizacin consiste en destruir o eliminar microorganismos
presentes en un objeto con un alto nivel de probabilidad que asegure que el objeto no
representa riesgos de infeccin. Su eficacia no puede verificarse mediante la simple
inspeccin y evaluacin del producto final, por lo que los procesos deben controlarse
sistemticamente y el equipo debe mantenerse en forma regular. Finalmente, para que el
proceso de esterilizacin sea aceptado, la probabilidad de hallar una unidad no estril
debe ser de menos de una en un milln, es decir, que proporcione un nivel de garanta de
esterilidad (SAL) igual o mayor de 10-6 (1).
El procedimiento para la esterilizacin de una droga, una preparacin farmacetica o un
instrumental mdico est determinado en gran medida por la naturaleza del producto,
dado que las propiedades caractersticas de ciertos materiales pueden conducir a su
destruccin o modificacin, por ello, cada mtodo de esterilizacin debe evaluarse y
validarse experimentalmente mediante pruebas de esterilidad (1).
En las farmacopeas (FEUM y USP) se citan los mtodos oficiales para las pruebas de
esterilidad aunque actualmente tambin se estn implementando nuevas metodologas
que permiten evaluar los procesos de esterilizacin.

PRUEBAS DE ESTERILIDAD
Las pruebas de esterilidad son procedimientos que forman parte del control de calidad
microbiolgico y tienen como finalidad investigar la presencia de microorganismos
contaminantes en sustancias, preparaciones o dispositivos que de acuerdo con la
farmacopea, requieren ser estriles (2).
Los mtodos de ensayo estndares (farmacopicos) se consideran validados. Sin
embargo, se necesita demostrar que el mtodo de ensayo especfico a ser utilizado por un
determinado laboratorio para el anlisis de un producto dado es adecuado para su uso.
Con base en esto, las pruebas de esterilidad se realizan con el fin de detectar formas
viables de microorganismos en medios de cultivo adecuados para el crecimiento de
bacterias, hongos y levaduras, que pueden encontrarse como contaminantes (3). Sin
embargo, un resultado satisfactorio nicamente indica que no se han encontrado
microorganismos contaminantes en la muestra examinada bajo las condiciones de la
prueba.
Estos procedimientos farmacopicos no se han diseado para garantizar que un lote de un
producto es estril o ha sido esterilizada. Esta garanta se consigue principalmente
mediante la validacin del proceso de esterilizacin o de los procedimientos aspticos (4).

~1~

PRECAUCIONES PARA PREVENIR CONTAMINACIN MICROBIANA

Los ensayos de esterilidad son uno de los pasos ms importantes en la comercializacin
de un producto farmacutico , por lo que para efectuar las pruebas es necesario evitar
contaminacin con la finalidad de que no se afecten los microorganismos que deban
detectarse en la muestra y cuidar que las condiciones sean adecuadas para la realizacin
de las pruebas. Por ello, es necesario cumplir con ciertos requisitos (2,3,4):

El personal debe estar calificado y entrenado en microbiologa.

Los ensayos deben realizarse en un rea de trabajo asptica, en campanas o

mdulos de flujo laminar o aisladores ubicados en un entorno sujeto a control
microbiolgico peridico del ambiente, del equipo y del material.

Los envases de las muestras debe desinfectarse previamente a su anlisis.

A los productos envasados al vaco se les debe introducir aire filtrado, libre de
microorganismos.

Si el producto tiene diluyente o algn aplicador anexo, tambin ste debe cumplir la
prueba de esterilidad.

Se debe llevar en paralelo una prueba blanco como testigo o un control negativo
que incluya un producto de esterilidad comprobada.

Los microorganismos de prueba y las temperaturas de incubacin deben de ser las

adecuadas.

Antes de efectuar cualquier prueba de esterilidad, debe determinarse si el producto

en cuestin tiene propiedades bactericidas o bacteriostticas bajo las condiciones
de anlisis (prueba de adecuacin del mtodo).

Esterilizar por calor hmedo, seco o filtracin, segn corresponda los medios de
cultivo, soluciones diluyentes y de enjuague, as como los materiales en contacto
con la muestra, empleando ciclos de esterilizacin validados.

~2~

PRUEBAS DE PROMOCIN CRECIMIENTO DE AEROBIOS, ANAEROBIOS Y

HONGOS
Se realiza para garantizar que cada lote de medio de cultivo cuenta con las propiedades
nutritivas necesarias y est listo para usarse, ya sea el medio preparado a partir de medio
deshidratado o mezclando los ingredientes (3, 4).

Tabla 2. Cepas de microorganismos de prueba adecuados para usar en la prueba de promocin del
crecimiento (4)
Bacteria aerobia

Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis
Pseudomonas aureginosa

ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB 9518

ATCC 6633, CIP 55.62, NCIMB 8054
ATCC 9027, CIP 82.118, NCIMB 8626

Bacteria anaerobia

Clostridium sporogenes

Hongo
Candida albicans
Aspergillus niger

ATCC 19404, CIP 79.3, NCTC 532, ATTC 11437

ATCC 10231, IP 48.72, NICPF 3179

ATCC 16404, IP 143.83, IMI 149007

Medio liquido de tioglicolato. Inocular con una cantidad pequea (<100 ufc)
usando una porcin de medio distinta para cada una de las especies de los
siguientes microorganismos: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aureginosa,
Clostridium sporogenes.
Medio liquido alternativo de tioglicolato. Inocular porciones con una pequea
cantidad (<100 ufc) de Clostridium esporogenes.
Medio de digerido de casena y soya. Inocular porciones con una cantidad
pequea de (<100 ufc) usando una porcin de medio distinta para cada una de las
especies de los siguientes: Aspergillus niger, Bacillus subtilis y Candida albicans.
Incubar durante no ms de 3 das para el caso de bacterias y durante no ms de 5 das en
el caso de hongos.
Los medios son adecuados si se produce un crecimiento claramente visible de los
microorganismo (4).
Almacenamiento. Uso durante un mes si se almacenan en envases no sellados. Siempre
que se hayan evaluado en cuanto a promocin del crecimiento durante el periodo de 2
semanas antes de su uso. Uso durante un ao, si se almacenan en envases
impermeables. Siempre que se hayan realizado las pruebas de promocin de crecimiento
durante el periodo de 3 meses antes de su uso (4).
La prueba puede realizarse simultneamente con la de esterilidad del producto.

~3~

LQUIDOS DE DILUCIN Y LAVADO PARA FILTRACIN POR MEMBRANA

Los diluyentes se emplean en el mtodo de filtracin por membrana para realizar los
lavados y disolver productos estriles slidos antes de la filtracin, minimizando la
destruccin de las clulas vegetativas gracias a que contienen concentraciones
equilibradas de sustancias nutritivas que impiden el choque fisiolgico de los
microorganismos retenidos en la membrana, haciendo posible su crecimiento en los
mismos (5).
Los diluyentes a utilizar dependen de la naturaleza del producto a evaluar, principalmente
cuando se trata de productos que poseen alguna actividad inhibitoria, ya que de ser el
caso, se puede contrarrestar el efecto a travs de distintos mtodos: neutralizacin,
dilucin o lavados (3,4,5).
o Neutralizacin: empleando agentes
lactamasa), lecitina, polisorbato 80, etc.

neutralizantes como penicilinasas (-

Penicilinasas: enzimas que hidrolizan e inactivan ciertos antibiticos

Lecitinas: lpido saponificable y con funcin de emulgente que
Polisorbato o Tween 80: actan como detergente, capturando las partculas
oleosas y retirndolas de la membrana.

o Dilucin: estableciendo la proporcin de producto y medio de cultivo necesarios

para evitar que se presente inhibicin microbiana.
o Lavados: durante la filtracin, se coloca un volumen especificado del producto en
una solucin diluyente que puede o no contener sustancias neutralizantes.
Tabla 1. Soluciones diluyentes y de lavado para filtracin por membrana (2,4).
Solucin

Producto

Diluyente A
Solucin de peptona
al 0.1%

Sustancias miscibles en agua y productos con

antibiticos (penicilinas o cefalosporinas),
para inactivarlos es necesario adicionar lactamasa.

Diluyente D
Solucin de peptona al 0.1%
con polisorbato 80.

Lquidos inmiscibles en agua y que adems

contienen lecitina, aceite o productos
etiquetados para administracin estril.

~4~

PRUEBA DE ESTERILIDAD PARA EL PRODUCTO A EXAMINAR

El nmero de artculos empleados vara. Se evala el nmero de artculos citados en la
tabla 4. Si el contenido en cada artculo est en la cantidad suficiente (tabla 3) se puede
dividir para agregarlo a cada uno de los medios especificados en porciones iguales y
apropiadas. Si cada artculo no contiene las cantidades suficientes para cada medio, usar
el doble del nmero de artculos indicados en la tabla 4(2).
El producto a examinar puede ser analizado mediante dos tcnicas: 1) Filtracin por
membrana, e 2) Inoculacin directa del medio de cultivo (2)
1) Filtracin de membrana. Se utiliza cuando la naturaleza del producto lo permite
(preparaciones acuosas filtrables, preparaciones aceitosas o alcohlicas y para
preparaciones miscibles en disolventes acuosos u orgnicos) y que los disolventes
no posean un efecto antimicrobiano en las condiciones de la prueba.

Tabla 3. Cantidad mnima a usar para cada medio

Cantidad por envase
Cantidad mnima a usar (a menos que se
justifique y autorice algo diferente)
Lquidos (distintos de antibiticos)
El contenido total del envase
Menos de 1 mL
La mitad del contenido del envase
1-40 mL
20 mL.
Ms de 40 mL y no ms de 100 mL.
10% del contenido del envase
Ms de 100 mL.
1 mL
Lquidos antibiticos
El contenido total del envase no
Otras preparaciones solubles en
menos de 200 mg
agua o en mirstato de isopropilo.

Preparaciones insolubles, cremas y

ungentos que deben suspenderse
o emulsionarse.

Slidos
Menos de 50 mg
50 mg o ms, pero menos de 300
mg
300 mg a 5 g
Ms de 5 g

Usar el contenido de cada envase

para suministrar no menos de 200
mg

El contenido total del envase

La mitad del contenido de cada
envase
150 mg
500 mg

Dispositivos
~5~

Catgut y otros materiales de sutura

mdica para uso veterinario

3 secciones de la hebra (30 cm c/u)

Tabla 4. Nmero mnimo de artculos a evaluar en relacin con el nmero de artculos en

la partida.
Nmero de artculos en la partida
Nmero mnimo de artculos a evaluar para
cada medio
Preparaciones parenterales

No ms de 100 envases
10 % o 4 envases, lo que resulte
Ms de 100 pero no ms de 500
mayor
10 envases
envases
Ms de 500 envases
2% o 20 envases

Antibiticos slidos
Envases farmacuticos a granel (<5
g)
Envases farmacuticos a granel (>5
g)
Preparaciones oftlmicas y otras no
inyectables
No ms de 200 envases
Ms de 200 envases

Dispositivos
Catgut y otros materiales de sutura
quirrgica para uso veterinario
Productos slidos a granel
Hasta 4 envases
Ms de 4 envases pero no ms de
50
Ms de 50 envases

20 envases
6 envases

5 % o 2 envases
10 envases

2% o 5 envases.

Cada envase
20% o cuatro envases
2% o 10 envases

FILTRACIN POR MEMBRANA

El mtodo de filtracin por membrana se utiliza siempre que la naturaleza del producto lo
permita, se aplica a productos acuosos, con base alcohlica, oleosos y solubles o
miscibles en solventes que previamente se demuestre que no poseen actividad
~6~

antimicrobiana. Algunos ejemplos de productos son los siguientes: soluciones acuosas,

slidos solubles, aceites y soluciones oleosas, cremas y ungentos, slidos para inyeccin
no antibiticos, antibiticos slidos para inyeccin, jeringas prellenadas, productos
estriles en aerosol, envases a granel para farmacias, dispositivos mdicos cuyo interior
se indica es estril, jeringas vacas estriles (2,4).
La metodologa debe adaptarse al producto en cuestin con base a la prueba de
adecuacin del mtodo a fin de valorar la cantidad de producto, disolventes, nmero de
lavados y dems especificaciones necesarias para cada muestra. Sin embargo, en
relacin al proceso de filtracin en s, se utilizan filtros de membrana con un tamao de
poro no mayor a 0.45 micras, en los que la eficacia para retener a los microorganismos ya
se encuentra establecida; el dimetro de los mismos debe ser de 50 mm, en caso
contrario, el volumen de dilucin y nmero de lavados deben ajustarse. Por otro lado, el
tipo de membrana de acuerdo a la naturaleza de la muestra (2,3,4):
o Membranas de nitrocelulosa. Soluciones acuosas, oleosas y con bajo contenido de
alcohol.
o Membranas de acetato de celulosa. Soluciones con alto contenido de alcohol.
o Membranas adaptadas. Productos especiales como los que contengan antibiticos.
Las membranas y el equipo de filtracin deben esterilizarse utilizando procesos de
esterilizacin validados. Los equipos se disean de tal modo que la solucin a examinar se
pueda introducir y filtrar en condiciones aspticas. Y de manera general, el mtodo de
filtracin por membrana puede resumirse en cinco pasos (3,5):
1. La unidad de filtracin debe estar correctamente ensamblada y esterilizada antes
de usarse
2. La muestra debe transferirse al filtro en condiciones rigurosas de asepsia
3. La muestra es filtrada con ayuda de un sistema de vaco de presin diferencial
4. La membrana debe retirarse aspticamente y cortarse a la mitad.
5. Cada mitad debe colocarse en los medios utilizados (Tioglicolato y Soya tripticasa)
Actualmente se cuenta con sistemas cerrados para realizar las pruebas de esterilizacin,
estos evitan la transferencia abierta de la muestra y por su diseo, no requieren de
apertura para retirar el filtro, simplemente se aade el medio de cultivo y se incuba; de
esta manera se minimizan las desventajas citadas en la Tabla 2.Los sistemas cerrados
pueden ser esterilizados con la membrana o de forma separada, siempre y cuando se
mantengan las caractersticas originales del filtro (3,4).

~7~

Tabla 2. Comparacin del mtodo de filtracin contra el de inoculacin directa (5,6).

Ventajas

Desventajas

o Mayor sensibilidad en cuanto a la

recuperacin de microorganismos.

o Mayor probabilidad de contaminacin

debido a las operaciones manuales
como lo son el ensamblaje del equipo
de filtracin, el corte de la membrana
y su posterior transferencia a los
medios.

o Los agentes antimicrobianos en la

muestra pueden ser eliminados con los
lavados realizados, disminuyendo la
incidencia de falsos negativos.
o Pueden detectarse bajos niveles de
contaminacin en la membrana.

o Es ms difcil diferencial la fuente de

contaminacin
(filtracin,
la
membrana, medios de cultivo).

o Los organismos presentes en un

producto oleoso pueden separarse del
producto en la filtracin y adaptarse
mejor en medios acuosos como lo son el
tioglicolato y soya tripticasa.
o De ser necesario, puede evaluarse el
contenido total de los productos
muestreados,
incrementando
la
capacidad de detectar contaminantes.

~8~

NUEVOS MTODOS
BIOLUMINISCENCIA CON ATP (MILLIFLEX)
El ATP (adenosin trifosfato) es una molcula utilizada por todas las clulas vivas para
proporcionar la energa que se requiere en el metabolismo celular. Por consecuencia, est
presente en todos los residuos orgnicos, clulas de la piel, microorganismos, etc. y por
tanto, constituye un excelente indicador de contaminacin (7).
La reaccin de bioluminiscencia se fundamenta en las mediciones de los niveles de ATP
en una superficie. La tecnologa de amplificacin cataliza y compone la produccin de ATP
adicional. La cantidad total de ATP puede detectarse y medirse fcilmente utilizando una
reaccin enzimtica: luciferina-luciferasa. La enzima reacciona con el ATP emitiendo luz y
la intensidad de sta (expresada en unidades relativas de luz) es proporcional a la
cantidad de ATP y por tanto, equivalente al grado de contaminacin existente (7,8).

DETECCIN DE VIRUS EN PRODUCTOS BIOLGICOS

Los materiales biolgicos que son susceptibles de contaminacin vrica y que no pueden
ser esterilizados antes de su uso, como el caso de sueros, clulas de cultivo primario,
lneas celulares, o stocks de virus para inoculacin, deben ser ensayados antes de su
correspondiente uso (9).
Existen pruebas descritas para detectar virus contaminantes mediante efectos citopticos,
hemoadsorcin, hemoaglutinacin, tcnicas con anticuerpos fluorescentes u otros
mtodos adecuados, como por ejemplo, la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y el
enzimoinmunoensayo (tcnicas ELISA) (9).
o ELISA. Se basa en el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima,
de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como
enzimtica. Al estar uno de los componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con
una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccin
antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente revelada
mediante la adicin de un substrato especifico que al actuar la enzima producir un
color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un
espectrofotmetro o un colormetro.
o Fluorescencia. Los inmunoensayos de fluorescencia son una simple variacin de
los colorimtricos; la enzima convierte el substrato en un producto de reaccin que
emite fluorescencia cuando es excitado a una determinada longitud de onda, siendo
las unidades relativas de fluorescencia (fotones de luz emitidos) proporcionales a la
cantidad de producto analizado.

~9~

REFERENCIAS
1. Gennaro, Alfonso R. (2003). Remington: Farmacia. Tomo uno. 20 edicin.
Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires Argentina. Pp. 875, 900-903.
2. Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos (FEUM). (2014) Undcima
edicin. Volumen I. Pp. 366-372
3. Gonzlez Pacheco Mario, Ribas Jaimes Rosa Mara et al. (2015). Manual de
Prcticas de Produccin y Control de Biolgicos. Escuela Nacional de Ciencias
Biolgicas del Instituto Politcnico Nacional. Mxico. Pp. 97-111
4. Farmacopea de los Estados Unidos de Amrica (USP). (2012). 35 revisin. Pp.
73-78
5. Caro Cortes Natalia, Cruz Mndez Yehimy. (2006). Validacin de las pruebas de
esterilidad por la tcnica de filtracin por membrana y endotoxinas
bacterianas por el mtodo de LAL en 3 productos farmaceticos. Pontificia
Universidad Javeriana, Facultad de Ciencias Bsicas. Bogot, Colombia. Pp. 6-14
6. Corts Alejandra, Sandino Cecilia, Arias Janeth (2003) Validacin de la prueba de
esterilidad para vacunas virales en vehculos oleoso y acuoso. Revista de la
facultad de Farmacia. Vol. 45. Bogot, Colombia. Pp. 36-42
7. Gua de Monitoreo de Higiene por Bioluminiscencia. (Junio, 2015) Disponible
en: http://www.3msalud.cl/enfermeria/files/2012/11/Protocolo_MonitoreoBiolominiscencia.pdf
8. Celsis, Rapid detection. Tecnologa de enzimas: Mejorando los beneficios de la
deteccin microbiana rpida. (Juno, 2015) Disponible en: http://www.celsis.com/
sites/default/files/media/Translations/Spanish-LA/AMPi-WP_ES-LA_6-13.pdf
9. Manual de la OIE sobre animales terrestres. (2008). Pruebas para comprobar la
esterilidad y la ausencia de contaminacin de los productos biolgicos.
Captulo 1.1.7. Pp. 116-123

~ 10 ~

ANEXO 1
Corts Alejandra, Sandino Cecilia, Arias Janeth (2003) Validacin de la prueba de
esterilidad para vacunas virales en vehculos oleoso y acuoso. Revista de la facultad
de Farmacia. Vol. 45. Bogot, Colombia. Pp. 36-42

~ 11 ~

~ 12 ~

~ 13 ~

~ 14 ~

~ 15 ~

ANEXO 2
Gua de Monitoreo de Higiene por Bioluminiscencia.
http://www.3msalud.cl/enfermeria/files/2012/11/Protocolo_Monitoreo-Biolominiscencia.pdf

~ 16 ~

~ 17 ~

~ 18 ~

ANEXO 3
Tecnologa de enzimas: Mejorando los beneficios de la deteccin microbiana rpida.
http://www.celsis.com/sites/default/files/media/ Translations/Spanish-LA/AMPi-WP_ESLA_6-13.pdf

~ 19 ~

~ 20 ~

INDICACIONES DEL TRABAJO

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

No hay prrroga en la entrega del trabajo

Palabras en ingls deben traducirse al espaol
Citar libros, revistas, publicaciones, pginas de internet
Extensin MINIMA del escrito: 8 pginas ms portada, ndice, referencias y anexos.
Incluir anexo: slo de referencias de internet (pgina inicial e informacin relevante)
Referencias en orden de aparicin y con numero arbigo
No descripcin de mtodos ni fotocopias de imgenes de tablas o texto. Citar, si es

necesario, la clave de los mtodos de anlisis.

8. NO se acepta TRANSCRIPCIN
9. Anexar slo las figuras indispensables y explicarlas. No anexar figuras decorativas
ni usar papel reciclado
10. Se anular todo el trabajo si se citan referencias no relacionadas al tema.
Por fa chequen que coincidan los nmeros de las referencias y todo lo subrayado, ya
que supongo que se movern cuando ustedes anexen su parte. Y mucho ojo con ellas,
me dijeron que Pacheco si las revisa.
Tapar con un cuadrito o algo el nmero de pag. 1 de la parte de hasta debajo de la hoja
en el ndice.
Sitios que tal vez le sirvan y que ya estn citados en referencias:
o http://www.saber.ula.ve/bitstream/123456789/23820/1/cortes_a.pdf
o http://repository.javeriana.edu.co/bitstream/10554/8294/1/tesis272.pdf

~ 21 ~