ELISA en el diagnstico clnico

La tcnica ELISA es una tcnica de inmuno-ensayo en la cual un antgeno inmovilizado se detecta

mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable, como
cambio de color o algn otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos
encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antgeno y que a su vez es
reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada.
La aparicin de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometra el antgeno
en la muestra.
Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular est presente en una
muestra de sangre. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran nmero de
variables, tales como seleccin de reactivo, temperatura, medicin de volumen y tiempo, que si no
se ajustan correctamente, puede afectar los pasos sucesivos y el resultado de la prueba.
Las cuatro fases de un ensayo ELISA son las siguientes:
1. Conjugacin del anticuerpo o del antgeno con una enzima (peroxidasa, fosfatasa
alcalina...).
2. Unin del antgeno (o del anticuerpo) a los pocillos.
3. Formacin de una o ms capas de inmunocomplejos.
4. Revelado de la reaccin enzimtica.
Se han desarrollado mltiples variantes de ensayos ELISA que permiten la cuantificacin de un
antgeno en solucin, la deteccin de un anticuerpo en una solucin o la determinacin de la
subclase de un anticuerpo. A continuacin se describen los ms comunes.

ELISA directo: es la forma ms bsica de realizar la tcnica. Consiste en recoger una

muestra a estudiar y ponerla en un pocillo (un recipiente pequeo) en frente de una
muestra igual pero contaminada con el germen a estudiar, y otra muestra en la que se
sabe que no hay germen. Se aplica el anticuerpo con la enzima en los tres pozos y se
compara la muestra a estudio con las otras dos.
ELISA indirecto: se realiza de forma similar al ELISA directo, pero en este caso se aade
primero un anticuerpo sin enzima y despus uno con enzima. De esa forma, la seal que
emite el enzima es mucho ms potente y la prueba es ms sensible.
ELISA sndwich: en este caso en los pocillos primero se aade un anticuerpo y despus la
muestra, para que los antgenos queden ya retenidos en el fondo del pozo. Despus se
aade el anticuerpo con la enzima. Es la forma ms eficaz de realizar la prueba.
ELISPOT: se trata de un tipo de ELISA que permite conocer de forma cuantitativa el
antgeno, incluso identifica el nmero concreto de clulas donde se encuentra.

Wikipedia
http://es.wikipedia.org/wiki/ELISA
8:00 pm
Webconsultas
http://www.webconsultas.com/pruebas-medicas/elisa-13695
8:00 pm

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

La reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en ingls, es una
tcnica de biologa molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis .Su objetivo es obtener un gran
nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta
partir de una nica copia de ese fragmento original, o molde. Esta tcnica sirve para amplificar un
fragmento de ADN.
Para realizar la tcnica se necesitan:

Los 4 desoxirribonucletidos-trifosfato (dNTP).

Dos cebadores o iniciadores (en ingls, primers).
Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comnmente como cloruro de
magnesio (MgCl2), actan como cofactores de la polimerasa.
Iones monovalentes, como el potasio.
Una solucin tampn o buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la
ADN polimerasa.
ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura ptima alrededor de
70 C (la ms comn es la polimerasa Taq).
ADN molde, que contiene la regin de ADN que se va a amplificar.
Termociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las
etapas que conforman un ciclo.

Conceptos de la PCR

Sensibilidad: se refiere a la cantidad mnima de ADN necesaria para que se produzca la

amplificacin, es decir, para obtener una banda. Se relaciona con los falsos negativos, ya
que puede que una muestra sea positivas pero sea dada como negativa porque no se ha
amplificado por no tener suficiente cantidad de ADN.
Especificidad: se refiere a la obtencin de un solo producto amplificado. Viene determinada
por los oligos y la especificidad con la que se unen al ADN molde. De esta forma, si los
oligos tienen ms de un sitio al que se pueden unir aparecer ms de un producto
amplificado.
Eficiencia: se refiere a la amplificacin mxima que se puede obtener en un nmero
determinado de ciclos.
Fidelidad: se refiere a los errores que comete la ADN polimerasa durante la amplificacin.
Este concepto es de especial importancia en la secuenciacin, pero en otros casos no es
tan importante. Una buena fidelidad permite evitar falsos positivos y/o negativos.

Se han diseado PCR ms especficas que se pueden elegir segn sea la muestra a estudio. Los
diferentes tipos de PCR, adems de la bsica, son:

PCR anidada: consigue amplificar muestras mnimas de ADN a miles de millones de

fragmentos. Es capaz por lo tanto de detectar trazos minsculos.
PCR in situ: permite la deteccin de ADN en el mismo lugar de la muestra, sin tener que
procesarla primero con tcnicas de laboratorio. Se suele utilizar para biopsias o raspados
de clulas.
PCR mltiple: con este tipo de PCR se consiguen detectar varios trazos de ADN a la vez y
con una sola muestra.

PCR con transcriptasa inversa: en este caso se utilizan cadenas de ARN para detectar
moldes de ADN. Se utiliza la enzima transcriptasa inversa, la misma que utiliza el VIH entre
otros virus.
PCR en tiempo real o PCR cuantitativa: se aade un componente fluorescente que permite
medir la luz. A ms luz, ms cantidad del ADN detectado.

Wikipedia
http://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_en_cadena_de_la_polimerasa
8:09 pm

Webconsultas
http://www.webconsultas.com/pruebas-medicas/pcr-13299
8:09 pm
Comparacin con la tcnica de ELISA
El PCR puede determinar tanto si el virus existe como si el sistema inmunolgico est totalmente
anulado y es incapaz de producir anticuerpos. No suele emplearse como un test de rastreo, sino
para confirmar otro test o en los anlisis de la autopsia.
ELISA no puede determinar el material gentico. En cambio, puede mostrar si el sistema
inmunolgico del individuo ha detectado un elemento extrao ante el cual ha generado anticuerpos,
como ocurre en el caso de un virus invasor. De modo que ELISA busca los anticuerpos, no el
material gentico. Conviene utilizarlo como test de rastreo, ya que puede detectar si el individuo se
ha encontrado expuesto a algn virus antes de que se manifieste ningn sntoma externo de
enfermedad. El individuo generar gran nmero de anticuerpos incluso si existe apenas una
pequea cantidad de invasores. Sin embargo, este test no resulta til en un estado de enfermedad
muy avanzada, cuando el sistema inmunolgico probablemente ya ha sido destruido por la
enfermedad, ni como confirmacin en una autopsia, porque los daos irreversibles del sistema
inmunolgico conllevan la ausencia total de anticuerpos, de modo que el ELISA no podr encontrar
ningn anticuerpo (en esta situacin, por el contrario, el test PCR puede localizar muchos
invasores).
angorasturcos.es
http://www.angorasturcos.es/vetfel_PCR.htm
8:22 pm
Hibridaciones tipo Southern, Northern y Western.
La hibridacin de cidos nucleicos (ADN o ARN) es un proceso por el cual se combinan dos
cadenas de cidos nucleicos antiparalelas y con secuencias de bases complementarias en una
nica molcula de doble cadena, que toma la estructura de doble hlice, donde las bases
nitrogenadas quedan ocultas en el interior. Esto hace que si irradiamos la muestra con la longitud
de onda a la que absorben estas bases (260 nm), la absorcin de energa ser mucho menor si la
cadena es doble que si se trata de la cadena sencilla, ya que en esta ltima los dobles enlaces de
las bases nitrogenadas, que son las que captan la energa, estn totalmente expuestos a la fuente
emisora de energa.

Si se trata de protenas, la tcnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados

con radioactividad para identificar cul es la banda que presenta la protena que me
interesa localizar.
Si se trata de DNA, la tcnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA
(molculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para
identificar qu bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda
Si se trata de RNA, la tcnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA
(molculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para
identificar qu bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda.

Wikipedia
http://es.wikipedia.org/wiki/Hibridaci%C3%B3n_%28biolog%C3%ADa_molecular%29
8:38 pm
Slideshare
http://es.slideshare.net/CarolinaHerrera151/fundamentos-de-tcnicas-blotting-southern-northernwestern
8:38 pm
Secuenciacin de ADN
La secuenciacin del ADN es un conjunto de mtodos y tcnicas bioqumicas cuya finalidad es la
determinacin del orden de los nucletidos (A, C, G y T) en un oligonucletido de ADN. La
secuencia de ADN constituye la informacin gentica heredable que forma la base de los
programas de desarrollo de los seres vivos (de procariotas, de eucariotas en el ncleo celular, y en
los plsmidos, en la mitocondria y en cloroplastos de las plantas). As pues, determinar la
secuencia de ADN es til en el estudio de la investigacin bsica de los procesos biolgicos
fundamentales, as como en campos aplicados, como la investigacin forense. Adems, se puede
utilizar la secuenciacin del ADN para conocer las mutaciones somticas, como las sustituciones
de bases, generadas entre distintos organismos.

Wikipedia
http://es.wikipedia.org/wiki/Secuenciaci%C3%B3n_del_ADN
8:48 pm