Engenharia de Cultivos Celulares

para a Produo de Biofrmacos

Profa. Leda Castilho
COPPE/UFRJ - Programa de Engenharia Qumica
Escola Piloto Virtual 2008
Aula 1: Introduo

Introduo

Biotecnologia
9 Definio:

Emprego de clulas ou componentes

celulares para a obteno de
produtos de utilidade para o homem

Processos biotecnolgicos
Biologia x Biotecnologia
Uma
idia

Uma
patente

Um artigo
cientfico

Um
processo

Vai
funcionar?

Funcionou
uma vez

Funcionou
trs vezes

Funciona
sempre

Produtos biotecnolgicos

H
N
O

H H
S

CH3

N
O
MeO

VP 1
VP 2

Antibiticos
e other
outros
Antibiotics
and
secundary metabolites
metablitos
secundrios

Proteins
Protenas
Polypeptides

DNA
DNA
Plasmids
Plasmdeos

Viruses
Vrus
Capsids
Capsidomers

Valor agregado de produtos

biotecnolgicos
Preo por tonelada (US$)
100 milhes

Produto
Protenas teraputicas obtidas pelo
cultivo de clulas animais
Vitamina B12

1 milho
Penicilina
10.000
Levedura de panificao
100
Protena de unicelular
1

Efluentes tratados

Valor agregado de produtos

biotecnolgicos

Valor agregado

Escala de
produo

Grau de pureza

Estrutura geral de um bioprocesso

Organismo sob
conservao

Propagao do inculo
em escalas crescentes
Biorreator

Preparo do
meio de cultivo

Formulao e embalagem

Produto

Esterilizao do meio
e de equipamentos

Processos de recuperao e purificao de

biomolculas (RPB)
RPBn

RPB3

RPB2

RPB1

Estrutura geral de um bioprocesso

Organismo sob
conservao

Propagao do inculo
em escalas crescentes
Biorreator

Todas as reas do desenvolvimento de bioprocessos

empregada,
as condies de cultivo, os equipamentos de
fermentao, as operaes de RPB.
Uma melhoria em uma rea pode gerar desvantagens
Processos
de recuperaode
e purificao
de
em outras, logo
o desenvolvimento
bioprocessos
Formulabiomolculas (RPB)
deve ser feito de
forma integrada.
o e em-

Preparo do
Esterilizao do meio
so interdependentes:
a clula ou enzima
meio de cultivo
e de equipamentos

balagem

Produto

RPBn

RPB3

RPB2

RPB1

Estrutura geral de um bioprocesso

Preparo e
desenvolvimento
do inculo

Preparo e
esterilizao
do meio de cultivo

Cultivo
Processos de recuperao e purificao do produto (downstream processing)
(biossntese)

Sntese qumica x biossntese

9 Molculas obtidas por converso qumica
Matria-prima

Intermedirios

Produto

A
C

B
9 Produtos biotecnolgicos
Matria-prima

Clula

Produto

Produtos biotecnolgicos
9 Exemplos de frmacos obtidos por sntese qumica
z Paracetamol (analgsico)
MM = 151,16 Da
z Cetamina (anestsico)
MM = 237,74 Da
z Aciclovir (anti-viral)
MM = 225,20 Da
z Zidovudine (anti-viral)
MM = 267,20 Da
z Misoprostol (anti-lcera)
MM = 382,50 Da
9 Exemplos de biofrmacos produzidos por via
biotecnolgica
z Insulina
tratamento de diabetes
z Enzimas
agentes trombolticos, digestivos, etc.
z Fatores sanguneos tratamento de hemofilia
z Anticorpos
tratamento de diferentes tipos de
cncer

Produtos biotecnolgicos

O
OH
O
O

cido acetil saliclico

C9H8O4
(MM = 180)

Anticorpo C225
C6466 H9982 N1726 O2024 S40
(frmula da sequncia de aminocidos)

(MM = 146.000)

Produtos biotecnolgicos
Colocando
em escala:

O
OH

O
OH
O
O

cido acetil saliclico

C9H8O4
(MM = 180)

Anticorpo C225
C6466 H9982 N1726 O2024 S40
(frmula da sequncia de aminocidos)

(MM = 146.000)

Produtos biotecnolgicos
aplicados rea da sade
9 Produtos biotecnolgicos para a sade humana:
z

Biofrmacos

Protenas recombinantes

Anticorpos monoclonais

cidos nucleicos para terapia gnica ou RNAi

Vacinas

Virais

Bacterianas

Sub-unidade, recombinantes

Gnicas

Molculas para diagnstico

Terapias celulares

Principais reas de aplicao de produtos

biotecnolgicos aplicados rea da sade

Imunologia/
Inflamao
Virologia*
Oncologia
Cardiovascular
Pneumologia
Metabolismo
Genito-Urologia
ZNS
Outros

*principalmente vacinas

NBEs

NCEs

% NBEs

(biol.)

(qum.)

(biol.)

28

23

55

19
40
8
5
7
3
5
21

28
76
40
30
53
27
89
48

40
34
17
14
12
10
5
30

136

414

NCE: new chemical entity; NBE: new biological entity

Aplicaes do cultivo de clulas

animais in vitro
Protenas
e anticorpos
teraputicos
Vacinas (virais
e recombinantes)

Terapia gnica

Cultivo de
clulas animais

Diagnstico (in
vitro e in vivo)

Terapias celulares
e clulas tronco

Protenas teraputicas
9 Protenas teraputicas:
z avanos no entendimento da base molecular das doenas
revelaram a existncia de protenas de potencial
teraputico
z produzidas naturalmente pelo organismo em mnimas
quantidades inicialmente desincentivou a sua produo
para aplicao mdica em larga escala
9 Produo em larga escala possibilitada a partir de:
z tecnologia do DNA recombinante
z tecnologia de hibridomas

Protenas teraputicas
9 Protenas teraputicas obtidas por meio que no a
extrao a partir de fontes naturais biofrmacos
9 Usados no tratamento de doenas importantes:
z cncer (anticorpos monoclonais)
z anemia (eritropoetina, EPO)
z hemofilia (fatores de coagulao VIII e IX recombinantes)
z neutropenia (estimulantes hematopoticos: G-CSF e
GM-CSF)
z infarto agudo do miocrdio (ativador de plasminognio
tecidual, t-PA)

O exemplo do Fator IX humano

Hidroxilao
(OH)
-carboxilao (Gla)

Glicosilao
(CHO),
sulfatao
(SO3) e
fosforilao
(PO3)

O exemplo da EPO recombinante

N-Glicosilao:

Asn (24,38,83)
1-6

Nac-Glc

1-4

Fuc

Nac-Glc

1-4

Ser (126)
2-6

1-4

Gal
2-3
S

Man

-6

O-Glicosilao:

Nac-Glc

1-2
Nac-Glc

1-3

Nac-Glc

1-2
Nac-Glc
1-4

Gal

Gal

2-3

2-3
S

Gal

Man

1-4

Nac-Gal

1-3
1

Eritropoetina

Man

-4

1-6

2-3
S

Fonte: Kratje (2004)

1-4

Gal
2-3
S

Tecnologia do DNA
recombinante
9 Empregada, entre outras
coisas, para expressar
protenas humanas de
interesse mdicofarmacutico em diferentes
hospedeiros, tais como
microrganismos e clulas
animais
9 Permite a produo destas
protenas em larga escala

Hibridomas e anticorpos
monoclonais
9 Hibridomas (Khler e Milstein, 1975):
z clulas

hbridas: fuso de mielomas, linfcitos tumorais de

crescimento infinito que perderam a capacidade de produzir
anticorpos, com linfcitos B normais, extrados do bao (de
roedores) que, antes da fuso, tm vida em cultura in vitro
limitada

9 Anticorpos monoclonais (AMs):

z derivados

de 1 nico clone, com especificidade nica ao seu

alvo, menor risco de reaes adversas

z normalmente

murinos:

dificuldades de obteno de AMs humanos devido instabilidade de

mielomas humanos e dificuldade de imunizar voluntrios humanos
para muitos imungenos

risco de resposta HAMA (human anti-mouse antibody)

reduo da HAMA atravs da humanizao de

AMs murinos

Tecnologia de hibridomas
(anticorpos monoclonais)

Anticorpos monoclonais
quimricos e humanizados

~30% murino

5 a 10% murino

Fonte: Maranho e Brgido (2001)

Clulas animais - Histrico

Ano

Evento

1949

Crescimento de vrus em cultivo de clulas (Enders e col.)

1954

Vacina inativada Salk contra a poliomielite (cl. rim de macaco)

1955

Vacina atenuada Sabin contra a poliomielite (cl. rim de macaco)

1963

Vacina contra o sarampo (clulas de embrio de galinha)

1964-69 Vacinas contra raiva, caxumba e rubola (cl. WI-38)

1975

Produo de anticorpos monoclonais (Khler e Milstein)

1979

Primeira linhagem de clula recombinante

1980

Ampliao para escala de produo de 8.000 L (vac. febre aftosa)

1981

Primeiro kit diagnstico com anticorpo monoclonal

1982

1 frmaco oriundo da tecnologia do rDNA (insulina; microrganismo)

1986

1 biofrmaco produzido em clulas animais (CHO): t-PA recombin.

1986

1 AM de uso teraputico: OKT3 (rej. a transplante; produz. camund.)

desde
1990

Testes clnicos e aprovao de diversos produts oriundos da

tecnologia do DNA recombinante e tecnologia de hibridomas
(fatores sanguneos VIII e IX, AMs, interferon, EPO)

Linhagens celulares comumente

empregadas
Linhagem

Tecido de origem

Aplicaes

CHO

Ovrio de hamster chins

Prot. recombinantes

BHK-21

Rim de filhote de hamster

Vacinas veterinrias
Prot. recombinantes

Vero

Rim de macaco verde africano Vacinas p/ humanos

HeLa

Tumor humano

Estudos

HEK-293

Rim de embrio humano

Terapia gnica
Estudos

Produo de protenas recombinantes

em clulas animais
9 Sistema de expresso preferido para a produo de
protenas recombinantes de uso teraputico:
z

secretam a protena no meio de cultivo

facilidade de purificao

modificaes ps-traducionais

carboxilao, hidroxilao, sulfatao, fosforilao e

especialmente a glicosilao

conferem atividade biolgica e estabilidade

sua ausncia pode causar problemas de imunogenicidade

CHO.K1

BHK-21

Glicosilao
9 Em glicoprotenas, a glicosilao influi fortemente sobre a atividade

biolgica da protena, a sua eficcia in vivo e o seu perfil

teraputico
9 Bactrias no glicosilam, leveduras tm padres distintos de

glicosilao
9 Nenhum sistema heterlogo de expresso realiza a glicosilao de

modo absolutamente idntico ao da fonte original da protena

9 Clula hospedeira mais usada:

clulas CHO (Chinese hamster ovary cells)

z padro de glicosilao adequado
z baixa susceptibilidade a vrus que afetam humanos

Exemplos de protenas j aprovadas

Produto
Avonex (-interferon)

Indicao
esclerose mltipla

Clula
CHO

Aprov.
1996

Benefix (fator IX)

hemofilia B

CHO

1997

Epogen (EPO)

anemia

CHO

1989

TNKase (t-PA)

doenas cardacas

CHO

2000

Herceptin/Trastuzumab (AM)

cncer de seio

CHO

1998

Refacto (fator de coagulao)

hemofilia A

CHO

2000

Prosta Scint (AM diagnstico in vivo)

cncer de prstata

n.d.

1996

Simulect/Basixilimab (AM)

rejeio a
transplante de rim

mieloma 1998
de rato

Campath (AM)

leucemia

CHO

2001

Avastin/Bevacizumab (AM)

cncer colorretal

CHO

2004

Xolair/Omalizumab (AM)

asma

CHO

2003

Soliris/Eculizumab (AM)

hemoglobinuria (PNH) NS0

2007

Aspectos de mercado

Mercado biofarmacutico mundial

Worldwide revenues of $41.3 billion
Canada
2002
4%
Asia/Pacific
3%

Europe
20%

U.S.
73%

(~10-15% das vendas mundiais da indstria farmacutica)

Mercado biofarmacutico mundial

45

Sales (billion
Vendas
(109USD)
US$)

40
35

andere
Outros (1500 Firmen).
Top 4 - 10
Top 3

30
25
20
15
10
5
0
1996

1997

1998

1999

2000

2005*

2002
IST

2.5

2.5

12

Top 4 - 10

1.5

3.5

10

17

Top 3

4.5

4.5

16

15

andere
Outros (1500 Firmen).

*estimado
em 2000

Os dez biofrmacos
mais vendidos no mundo (Top 10)
Nome comercial

Empresa

Produto

Erypo/Procrit
Epogen
Remicade
Neupogen
MabThera/Rituxan
Avonex
Enbrel
Viraferon
Betaferon
Humalog

Amgen
Amgen
Centocor
Amgen
Genentech
Biogen
Amgen
Schering-Plough
Chiron
Eli Lilly

Eritropoetina
Eritropoetina
AM Infliximab
G-CSF
AM Rituximab
Interferon--1a
TNF--Receptor
Interferon--2b
Interferon--1b
Insulina

Dados de 2002

Aprovao de produtos
biotecnolgicos
9 Atualmente, ~30% dos produtos aprovados so de origem
biotecnolgica

Frao de produtos aprovados

(FDA) que so biofrmacos (%)

9 Em 2010, este nmero deve chegar a 50%

35
30
25
20
15
10
5
0
94-95
Fonte: Pharma Projects (2003)

96-97

98-99
Ano

00-01

02-03

Tipos de produtos aprovados nos

ltimos anos
9 Produtos biotecnolgicos aprovados em 2004
(UE e EUA)
z

12 produtos

~60% produzidos em clulas animais

anticorpos monoclonais: 50%

1 oligonucleotdeo sinttico

Produtos aprovados e em
desenvolvimento

Fonte: Walsh (2003)

Produtos em desenvolvimento clnico

por tipo de molcula
Total: ~370

Fonte: Walsh (2003)

Desenvolvimento de anticorpos
monoclonais teraputicos
Probabilidade de aprovao de anticorpos monoclonais
Target
Lead
Validation Compound

Preclinic
29%

Phase II
53%

Phase III
55%

MAb Murine

9000
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0

Chimar

Registration
95%
Human

Other

Phase III
Phase II
Phase I

05

20

04

03

20

20

02

01

20

20

00

99

20

19

98

97

19

19

96

95

Preclinic
19

19

Phase I
23%

Vendas de monoclonais teraputicos

(em milhes de US$)
Fonte: Pharma Projects (2003)

100

200

Monoclonais teraputicos em
desenvolvimento (2002)

300

Mercado brasileiro
9 Produtos de elevado valor agregado:
z princpios ativos importados em sua totalidade
z incio da produo em 2009/2010: EPO e IFN na Fiocruz
9 Altos gastos do Ministrio da Sade:
z medicamentos excepcionais (EPO, G-CSF, interferons, etc)
z fatores de coagulao sangunea
81,363

48,888

27,059

39,581

88,284

47,125

2001

2000

1999

1998

1997

1996

17,807

1995

Gastos do Governo
Federal apenas com
eritropoetina (EPO):

90,000
80,000
70,000
60,000
50,000
Mil R$
40,000
30,000
20,000
10,000
0

Mercado brasileiro

Jornal do Brasil,
27/07/2004
Jornal do Brasil,
13/03/2004

Mercado brasileiro

Jornal do Brasil - 05/04/2003

Jornal do Brasil - 10/04/2004

G-CSF, GM-CSF,
EPO, monoclonais

Grande demanda por um AM

anti-cncer j ao longo de seu
ciclo de desenvolvimento
100000

Demanda (g)

10000
1000
100
10
1
Pr-Clnica

Fase I/II

Fase II/III

Comercial I Comercial II

Fase do desenvolvimento

Como produzir em grandes

quantidades?
prod .anual = produtivid ade * Vbiorreat * t

Produo anual (kg)

1000

500
100

300
100
50

10

30
10 mg/L/dia
1
100

1000

10000

Volume do(s) biorreator(es) (L)

100000

Como aumentar a produtividade?

9 Otimizao do meio de cultivo
9 Engenharia metablica

Engenharia de
cultivos celulares!

9 Otimizao da expresso de protenas

9 Otimizao de biorreatores
9 Otimizao do modo de operao
de biorreatores
z processos em perfuso

Patentes expirando:
inovao tecnolgica

9 Otimizao das etapas de recuperao e purificao