MICROBIOLGICA DE
POLPA DE FRUTAS
Profa. Dra. Hassa R. Cardarelli
2014
11. Todos os lquidos e slidos contaminados devem ser descontaminados antes de eliminados
ou reutilizados. Os materiais esterilizados em autoclaves ou incinerados fora do laboratrio
devero ser acondicionados em recipientes fechados, impermeveis e devidamente
indentificados;
12. Use sempre avental ou uniforme enquanto estiver no laboratrio; estas roupas no devem
sair do recinto de trabalho e devem ser desinfetadas por procedimentos adequados;
13. Sempre que for necessrio, proteja os olhos e o rosto de respingos ou impactos usando
culos de segurana, escudos faciais, mscaras ou qualquer outro dispositivo de segurana;
14. As bancadas do laboratrio devem ter a superfcie muito lisa, de maneira a serem
facilmente limpas e desinfetadas;
15. Somente devero ser autorizadas a entrar no laboratrio pessoas que tenham sido
informadas sobre os possveis riscos e satisfaam os requisitos que se exigem para o acesso;
durante o trabalho, as portas devem ser mantidas fechadas; somente tero acesso ao local,
animais e pessoas autorizadas; no se deve permitir a entrada de crianas no laboratrio;
16. No se deve permitir a entrada no laboratrio, de animais que no tenham relao com os
trabalhos que esto sendo efetuados;
17. Deve ser estabelecido um programa de luta contra os insetos e roedores;
18. As pipetas usadas devem ser imediatamente imersas em desinfetantes;
19. Em caso de respingos, cubra imediatamente a rea com desinfetantes;
20. Nunca umedea rtulos com a lngua; use gua ou rtulos auto-adesivos;
21. Use seringas e agulhas hipodrmicas somente para injeo parenteral, aspirao de
lquidos dos animais de laboratrio e de vacinas contidas em frascos com tampas perfurveis.
No as use para manipular lquidos infecciosos; nestes casos, devem ser empregadas pipetas
automticas;
22. No empregue chumaos de algodo ao esvasiar uma seringa contendo ar ou excesso de
lquido. Use um pequeno frasco cheio de algodo embebido em desinfetante;
23. Antes e depois de injetar materiais infecciosos em animais, esfregue o local da infeco
com desinfetante;
24. Utilize seringas com acessrio especial para evitar que a agulha se separe da seringa;
25. Em todos os trabalhos nos quais existem possibilidades de contato direto acidental com
sangue, material infeccioso ou animais infectados, devem ser usadas luvas. Estas luvas, antes
de descartadas, devem ser esterilizadas em autoclaves;
I.
3 - Outros reagentes
Outros reagentes como solues tampes de diluio, gua, soluo de cidos ou lcalis, etc.,
precisam estar estreis se forem entrar em contacto com o alimento, podendo ser esterilizados
na autoclave junto com os demais meios de cultura, ou ento filtrados em filtros de
esterilizao.
Uso de filtros de esterilizao
Ex: Filtros tipo Millipore ou Nuclepore (de celulose).
Colocar a membrana de esterilizao no local adequado, e esterilizar todo o conjunto
(Kitassato, funil, membrana, copo) na autoclave a 121 C, durante 30 minutos.
Colocar o lquido a ser esterilizado no copo do filtro, ligar a extremidade do Kitassato trompa
d'gua (ou bomba de vcuo) e proceder a filtrao, que no deve demorar muito. Filtrado todo
o lquido, transfer-lo assepticamente para um frasco previamente esterilizado.
II.
1 - Alimentos slidos
Pesar, assepticamente, 25 g do alimento e homogeneizar com 225 mL de tampo diluente ou
gua peptonada. *A homogeneizao pode ser feita em homogeneizador prprio para
alimentos ou em liquidificador com o copo "higienizado" pela lavagem, por 3 vezes, com lcool
70% e posteriormente com gua destilada estril. Usar velocidade baixa para no aquecer a
mistura. Transferir a diluio 10-1 assim obtida para um frasco estril e proceder diluio
seriada decimal (1 mL da diluio 10-1 adicionado 9 mL de diluente, e assim por diante).
2 - Alimentos lquidos
Pipetar, assepticamente, 25 mL de alimento e transferir para um frasco contendo 225 mL de
diluente e homogeneizar. Proceder diluio seriada como descrito acima.
*Preferencialmente, a homogeneizao deve ser feita em aparelho do tipo stomacher.
III.
METODOLOGIAS
1.4. Esquema
25gg/25
amostra
25
mL da amostra
225 mL de diluente
10
-1
Homogeneizao
9 mL de diluente
1 mL
1 mL
10
0,1 mL
PCA
(Superfcie)
Mesfilos
35-37C/48h
9 mL de diluente
-2
0,1 mL
PCA
(Superfcie)
Mesfilos
35-37C/48h
10
-3
0,1 mL
PCA
(Superfcie)
Mesfilos
35-37C/48h
2. ENUMERAO DE FUNGOS
Vidraria esterilizada:
Placas de Petri
Pipetas de 1 mL
Basto de vidro
Alas de Drigalski
Banho-maria a 45 C
Contador de colnias
2.2.
Metodologia
2.2.1. Preparar a quantidade necessria de gar batata dextrose com cloranfenicol
(adicionar ao meio de cultura pronto, aps resfriamento antes do plaqueamento),
conforme instrues do frasco, e esterilizar em autoclave a 121 C durante 15 min.
Distribuir o meio de cultura em placas de Petri esterilizadas.
2.2.2. Efetuar a pesagem, homogeneizao e a diluio seriada adequada da
amostra.
2.2.3. Procedimento
a) De cada diluio do alimento, transferir 0,1 mL para a superfcie das placas de
gar batata dextrose.
b) Espalhar com a ala de Drigalski.
c) Incub-las a 25 C, sem inverter, durante 3-5 dias.
d) Decorrido o perodo de incubao, selecionar as placas contendo entre 15 e 150
colnias e contar as colnias.
e) Determinar o nmero de colnias de fungos por grama ou mL de alimento,
conforme o item 1.2.4.
2.3. Resultados
Expressar os resultados em Unidades Formadoras de Colnias por grama ou mL
de alimento (UFC/g ou UFC/mL).
2.4. Esquema
25 g/ 25 mL amostra
225 mL de diluente
10
9mL de diluente
9mL de diluente
-1
Homogeneizao
1 mL
1 mL
-2
-3
10
0,1 mL
gar BD (superfcie)
25C/3-5dias
Contagem total
10
0,1 mL
0,1 mL
gar BD (superfcie)
gar BD (superfcie)
25C/3-5dias
Contagem total
25C/3-5dias
Contagem total
3.1.
3.1.2. Metodologia
3.1.2.1. Preparo do alimento para anlise
Efetuar a pesagem, homogeneizao e a diluio seriada do alimento. Preparar,
no mnimo, 3 diluies decimais subsequentes.
3.1.2.2. Procedimento
Teste presuntivo para coliformes totais, coliformes termotolerantes e E.
coli
a) De cada diluio do alimento, transferir alquotas de 1 mL para 3 tubos
contendo o caldo Lauril Sulfato Triptose (LST).
Homogeneizar atravs de
agitao cuidadosa.
b) Incubar a 35 C durante 48 horas.
c) Decorrido o tempo de incubao, separar os tubos positivos, ou seja, os que
apresentarem turvao do meio e gs no interior do tubo de Durham; dispensar
os demais.
Teste confirmatrio para coliformes totais
a) Transferir, com o auxlio de ala, um inculo de cada tubo positivo de LST para
outro tubo contendo caldo Bile Verde Brilhante (VB).
b) Incubar a 35 C durante 48 horas.
c) Selecionar os tubos positivos (turvos e com gs no interior dos tubos de
Durham) e anotar os resultados.
d) Utilizar a Tabela NMP adequada para calcular o "Nmero Mais Provvel" (NMP)
de coliformes totais por grama ou mL de alimento.
3.1.3. Tabelas
Tabela 1: Nmero Mais Provvel (NMP) e intervalo de confiana a nvel de 95% de probalidade,
para diversas combinaes de tubos positivos e negativos na inoculao de 10 pores de 10 mL
da amostra por tubo (APHA, 1985)
NMP/100
mL
<1,1
1,1
2,2
3,6
5,1
6,9
Mnimo
Mximo
0
0,03
0,26
0,69
1,3
2,1
3,0
5,9
8,1
10,6
13,4
16,8
6
7
8
9
10
9,2
12,0
16,1
23,0
>23,0
3,1
4,3
5,9
8,1
13,5
21,1
27,1
36,8
59,5
Infinito
Tabela 2: NMP por grama e intervalo de confiana (95%), para sries de 3 tubos com 0,1, 0,01 e
0,001 g/mL de inculo.
Pos. tubes
Conf. lim.
Pos. tubes
Conf. lim.
NMP/g
0.10
0.01
0.001
MPN/g
Low
High
0.10
0.01
0.001
Low
High
<3.0
--
9.5
21
4.5
42
3.0
0.15
9.6
28
8.7
94
3.0
0.15
11
35
8.7
94
6.1
1.2
18
29
8.7
94
6.2
1.2
18
36
8.7
94
9.4
3.6
38
23
4.6
94
3.6
0.17
18
38
8.7
110
7.2
1.3
18
64
17
180
11
3.6
38
43
180
7.4
1.3
20
75
17
200
11
3.6
38
120
37
420
11
3.6
42
160
40
420
15
4.5
42
93
18
420
16
4.5
42
150
37
420
9.2
1.4
38
210
40
430
14
3.6
42
290
90
1,000
20
4.5
42
240
42
1,000
15
3.7
42
460
90
2,000
20
4.5
42
1100
180
4,100
27
8.7
94
>1100
420
--
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-a2.html#tables
3.1.4. Esquema
25g amostra
225 mL de diluente
-1
10
9 mL de diluente
9 mL de diluente
1 mL
1 mL
Homogeneizao
-2
-3
10
10
1 mL
1 mL
1 mL
Caldo LST
(Teste
Presuntivo)
35-37C/48h
Multiplicao e produo de gs
(tubos positivos)
Caldo VB
(Teste confirmativo
para Coliformes
Totais)
1 alada
Caldo EC
(Teste confirmativo
para Coliformes a
45C)
Multiplicao e
produo de gs
NMP coliformes a
45C
E. coli
E. aerogenes
35-37C/48h
Multiplicao e
produo de gs
NMP coliformes
totais
45/24h
Citrato de
Simmons
35-37C/96h
1 ala
gar EMBA
(Teste confirmativo
para E. coli)
1 ala
35-37C/24h
Caldo
MR-VP
Caldo
Triptona
Citrato (-)
35-37C/48h (VP)
35-37C/96h (VM)
35-37C/24h
VP (-) e VM (+)
4. Pesquisa de Salmonella
4.2. Metodologia
4.2.1. Pr-enriquecimento
Homogeneizar 25 g ou 25 mL do alimento com 225 mL de caldo Lactosado.
Incubar a 35-37 C, por 18-24 horas.
4.2.2. Enriquecimento
Transferir 1 mL do homogeneizado para um tubo contendo 10 mL de caldo
tetrationato e 0,1 mL para um tubo contendo 10 mL de caldo RappaportVassiliadis. Incubar o primeiro a 35 C e o segundo a 43 C em banho-maria por
24 horas.
4.2.3. Semeadura em gar seletivo
Semear superficialmente por esgotamento os caldos de enriquecimento em placas
de gar Bismuto Sulfito (BS) e Agar xilose lisina deoxicolato (XLD), de modo a
obter colnias isoladas. Incubar a 35-37 C por 24 horas.
4.2.4. Identificao de colnias suspeitas
gar BS: as colnias podem ser de cor marrom, cinza ou preta; algumas vezes
apresentam-se com brilho metlico.
gar XLD: as colnias so vermelhas e algumas com centros negros. O Agar se
torna vermelho pela presena de Salmonella.
4.2.5. Identificao bioqumica
Semear uma colnia em tubo contendo gar Trplice Acar Ferro (TSI), inclinado,
e gar Lisina Ferro (LIA). Incubar a 35-37 C/24h.
TSI: rampa alcalina (vermelha) e fundo cido (amarelo), com ou sem produo de
H2S (escurecimento do gar). Reao atpica em TSI que no deve ser descartada
se as demais reaes em LIA se apresentarem tpicas: rampa e fundo cidos
(amarelos), com ou sem produo de H2S.
LIA: fundo e rampa alcalinos (prpura, sem alterao da cor do meio), com ou
sem produo de H2S (escurecimento do meio). Reao atpica em LIA que no
deve ser descartada se as demais reaes em TSI se apresentarem tpicas: fundo
amarelado com rampa alcalina, com ou sem produo de H2S.
4.3. Resultados
Expressar os resultados como ausncia ou presena de Salmonella spp. em 25
g ou 25 mL de alimento.
4.4. Esquema
25g amostra
Homogeneizao
Incubao 35-37C/18-24h
1 mL
Enriquecimento
seletivo
gar BS
0,1 mL
Caldo Tetrationato
(TT) 10 mL
35C/24h
43C/24h
gar BS
gar XLD
gar XLD
35-37C/24h
Identificao
gar
TSI
gar LIA
35-37C/24h
IV.
MEIOS DE CULTURA
1g
1 litro
3,0 g
5,0 g
5,0 g
1000 mL
6g
5g
20 mL
V.
BIBLIOGRAFIA
Analytical
Manual.