Anda di halaman 1dari 9

IV.

Isi

Laporan
PCR (kependekan dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction)

merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara


enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, DNA dapat
dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga
memudahkan

berbagai

teknik

lain

yang

menggunakan

DNA.

Gambar 1. Silkus PCR


Reaksi PCR meniru reaksi penggandaan atau replikasi DNA yang terjadi
dalam makhluk hidup. Secara sederhana PCR merupakan reaksi penggandaan
daerah tertentu dari DNA cetakan (template) dengan batuan enzim DNA
polymerase. PCR terdiri atas beberapa siklus yang berulang-ulang, biasanya 20
sampai 40 siklus.

4.1 Komponen PCR


Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase,
komponen lain yang dibutuhkan adalah:
1. Primer
Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek
yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau
polimerisasi

DNA.

Jadi

jangan

membayangkan

kalau

PCR

mampu

menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp


itu. PCR hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang
maksimum 10000 bp saja, dan dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp.

Fuji Aprianti_Biologi UNPAD_2010

Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA template,
jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita inginkan.
2. dNTP (deoxynucleoside triphosphate)
dNTP alias building blocks sebagai batu bata penyusun DNA yang baru.
dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP,
dCTP, dGTP dan dTTP.
3. Buffer
Buffer

yang

biasanya

terdiri

atas

bahan-bahan

kimia

untuk

mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim DNA


polymerase.
4. Ion Logam
Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi
enzim DNA polymerase. Tanpa ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat
bekerja. Ion logam monovalen, kalsium (K+).

4.2 Tahapan PCR


Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu:
1. Denaturasi
Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96oC selama 30-60
detik. Pada suhu ini DNA utas ganda akan memisah menjadi utas tunggal.
2. Annealing
Setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran 40-60oC
selama 20-40 detik untuk memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel
pada DNA template di tempat yang komplemen dengan sekuen primer.
3. Ekstensi/elongasi
Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim
DNA polymerase, biasanya 70-72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan
memasangkan dNTP yang sesuai pada pasangannya, jika basa pada template
adalah A, maka akan dipasang dNTP, begitu seterusnya (ingat pasangan A
adalah T, dan C dengan G, begitu pula sebaliknya). Enzim akan memperpanjang
rantai baru ini hingga ke ujung. Lamanya waktu ekstensi bergantung pada
panjang daerah yang akan diamplifikasi, secara kasarnya adalah 1 menit untuk
setiap 1000 bp.

Fuji Aprianti_Biologi UNPAD_2010

Gambar 2. Tahapan PCR


Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh
tahapan berikut:
1. Pra-denaturasi
Dilakukan selama 1-9

menit

di

awal

reaksi

untuk memastikan

kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start


alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu).
2. Final Elongasi
Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15
menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah
diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir
PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal Cycler yang dapat
menaikkan dan menurunkan suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus
PCR. Pada awalnya orang menggunakan tiga penangas air (water bath) untuk
melakukan denaturasi, annealing dan ekstensi secara manual, berpindah dari
satu suhu ke suhu lainnya menggunakan tangan. Tapi syukurlah sekarang mesin
Thermal Cycler sudah terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan.

Fuji Aprianti_Biologi UNPAD_2010

4.3 Persiapan PCR


Peralatan yang harus disiapkan :
1. Autoklaf

Gambar 3. Autoklaf
Autoklaf adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan
yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan.
Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan
suhu 121oC (250oF). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda
adalah 15 pon tiap inchi2 (15 Psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi
yang dilakukan biasanya 15 menit untuk 121oC.
2. Biological Safety Cabinet

Gambar 4. BSC
Biological Safety Cabinet (BSC) atau dapat juga disebut Laminar Air Flow
(LAF) adalah alat yang berguna untuk bekerja secara aseptis karena BSC

Fuji Aprianti_Biologi UNPAD_2010

mempunyai pola pengaturan dan penyaring aliran udara sehingga menjadi steril
dan aplikasisinar UV beberapa jam sebelum digunakan.
3. Centrifuge dan microcentrifuge

Gambar 5. centrifuge
alat yang digunakan untuk memisahkaan suspensi yang jumlahnya
sedikit.
4. Mikropipet (Micropippete) dan Tip

Gambar 6. Mikropipet dan Tip


Mikropipet adalah alat untuk memindahkan cairan yang bervolume cukup
kecil, biasanya kurang dari 1000 l. Banyak pilihan kapasitas dalam mikropipet,
misalnya mikropipet yang dapat diatur volume pengambilannya (adjustable
volume pipette) antara 1l sampai 20 l, atau mikropipet yang tidak bisa diatur
volumenya, hanya tersedia satu pilihan volume (fixed volume pipette) misalnya
mikropipet 5 l. dalam penggunaannya, mukropipet memerlukan tip.

Fuji Aprianti_Biologi UNPAD_2010

5. Vortex mixer atau vortex

Gambar 7. Vortex mixer


Alat yang digunakan untuk mencampur atau menghomogenisasi cairan
dalam tabung.
6. Lemari Es -20 dan -80

Gambar 8. Lemari Es
Lemari es digunakan untuk menyimpan sampel, DNA, RNA, dan juga
reagen. Lemari es -20 C untuk menyimpan reagen, DNA. Sedangkan lemari es 80 C untuk menyimpan DNA, RNA, jaringan.
7. Elektroforesis

Gambar 9. Elektroforesis

Fuji Aprianti_Biologi UNPAD_2010

Alat untuk memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan


sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran
bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam
elektroforesis). Hasil isolasi DNA, RNA, atau amplifikasi PCR dideteksi dengan
menggunakan alat elektroforesis pada suatu gel agarosa.

4.4 Contoh Kasus PCR


Analisis Mikrodelesi Kromosom Y Pada Pria Azoospermia di Indonesia
Penelitian yang mengetahui frekuensi mikrodelesi kromosom Y pada pria
azoospermia di Indonesia. Penelitian ini menggunakan metode PCR dengan lima
STS untuk melihat delesi yang timbul pada tiga subregio (AZFa, AZFb, dan
AZFc) dan satu STS untuk mengamplifikasi gen SRY yang merupakan kontrol
internal. Dari 35 sampel pria dengan azoospermia terdeteksi dua orang (5,7%)
yang mengalami mikrodelesi pada kromosom Y (Yq).
Mikrodelesi yang terdeteksi dengan enam STS adalah satu orang
mengalami delesi pada sY84 (subregio AZFa) dan RBMY1 (subregio AZFb), dan
satu orang mengalami delesi pada sY254 dan sY255 (subregio AZFc).
Pemeriksaan delesi kromosom Y sangat dianjurkan pada pria azoospermia yang
ingin mengikuti program ICSI untuk menghindarkan kelainan genetic pada
keturunannya.
Pemeriksaan mikrodelesi kromosom Y dapat digunakan sebagai salah
satu metode untuk menegakkan diagnosis dan

pemberian

terapi

pada

infertilitas pria. Pada pria infertil yang mengikuti teknik reproduksi berbantuan
perlu dilakukan skrining mikrodelesi kromosom Y karena adanya risiko
diturunkannya cacat genetik pada anak laki-laki yang dihasilkan dari teknik
tersebut.
Metode yang digunakan yaitu sampel darah tepi pria azoospermia lalu di
Isolasi DNA kemudian amplifikasi fragmen kromosom Y dengan 6 STS dengan
teknik PCR lalu dilakukan elektroforesis pada gel agarosa 2% konfirmasi dengan
DNA sequencing.

Fuji Aprianti_Biologi UNPAD_2010

Daftar Pustaka
Dede, 2010. Lemari Es Sharp. http://www.ddelectroputra.com/2010/07/lemari-essharp.html. diakses 15 Desember 2011 pada 20.32 WIB
Firebiology07, 2009. Teknik Pengenalan Alat,
http://firebiology07.wordpress.com/2009/04/19/teknik-pengenalanpenyiapandan-penggunaan-alat-laboratorium-mikrobiologi/, diakses 15 Desember 2011
pada 20.24 WIB
Hopes, 2011. Electro. http://cg.scs.carleton.ca/~morin/teaching/compbio/electro.html,
diakses 15 Desembar 2011 pada 20.27 WIB
Iphaenk , 2010. Laboratorium Mikrobiologi.
http://iphaenk.blogspot.com/2010/11/instrumen-laboratoriummikrobiologi.html, diakses 15 desember 20011 pada 20.29 WIB
Neversurrender, 2011. Autoklaf.
http://agrojamurtirambogor.wordpress.com/2011/05/07/alat-sterilisasi-bibityaitu-autoklaf/, diakses 15 desember 2011 pada 20.25 WIB
NN, 2011. Reaksi berantai polymerase.
http://id.wikipedia.org/wiki/Reaksi_berantai_polimerase, diakses 15 desember
2011 pada 20.21 WIB
NN,2009. Mengenal PCR,http://sciencebiotech.net/mengenal-pcr-polymerase-chainreaction/, diakses pada 15 Desember 2011 ppada 20.22 WIB
NN, 2011. Centryfugate. http://www.dynamicstar.com.hk/page12.html, diakses 15
desember 2011 pada 20.28 WIB
NN, 2010. Micropipet. http://sciencebiotech.net/yang-wajib-anda-ketahui-tentangpipet/. Diakses 15 Desember 2011 pada 20.30 WIB
NN, 2011. Vortex Miixer. http://www.labsource.co.uk/shop/grant-bio%C2%99-grantbio-vortex-mixers-c-127_128.html. Diakses 15 desember 2011 pada 20.31 WIB

Fuji Aprianti_Biologi UNPAD_2010

Lampiran
Lampiran berupa jurnal file pdf berjudul ANALISIS MIKRODELESI KROMOSOM
Y PADA PRIA AZOOSPERMIA DI INDONESIA

Fuji Aprianti_Biologi UNPAD_2010