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Degustao de trechos de livros sugeridos

Enzimas
Fonte: Wilson & Walker. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular
Biology, 7ed. Pgina 581Quando uma enzima misturada com um excesso de substrato h um perodo de tempo
inicial curto (algumas centenas de microsegundos) em que os intermedirios levando a
formao do produto aumentam gradativamente (Figura 15.1 pg 585 do livro). Esta
etapa chamada de estado pr-estacionrio requer tcnicas especiais para o estudo os
quais sero discutidos na Seo 15.3.3. Aps o estado pr-estacionrio, a velocidade da
reao e a concentrao dos intermedirios alteram-se relativamente de forma lenta com
o tempo constituindo a chamada cintica do estado estacionrio. Medidas do progresso
da reao durante esta fase resultam na relao mostrada na Figura 15.2. As tangentes
desenhadas a partir da origem das curvas de concentrao de substrato (S) e de produto
(P) versus o tempo permitem calcular a velocidade inicial (o). Esta a velocidade
mxima para uma determinada concentrao de enzima e substrato sob as condies
experimentais definidas. Medidas da velocidade inicial de uma reao catalisada
enzimaticamente so essenciais para o completo entendimento do mecanismo de ao
da enzima, bem como para a estimativa da atividade de uma enzima em uma amostra
biolgica. Seu valor numrico influenciado por vrios fatores, incluindo concentrao
de substrato e enzima, pH, temperatura e a presena de ativadores ou inibidores.
Para vrias enzimas, a velocidade inicial, o, varia hiperbolicamente com a
concentrao do substrato para uma concentrao fixa de enzima (Figura 15.3). A
equao matemtica que expressa essa relao hiperblica entre velocidade inicial e a
concentrao de substrato conhecida como equao de Michaelis-Menten:
o = Vmax[S]
Km + [S]
Onde Vmax o valor mximo da velocidade inicial quando todos os stios ativos esto
ocupados, Km a constante de Michaelis e [S] a concentrao do substrato. Em baixas
concentraes do substrato a ocupao dos stios ativos das enzimas baixa e a
velocidade da reao diretamente relacionada ao nmero de stios ocupados. Isto ,
prxima da cintica de primeira-ordem em que a velocidade proporcional
concentrao do substrato. Em concentraes altas do substrato, todos os stios ativos
so ocupados e a reao torna-se independente da concentrao do substrato, pois no
h como formar mais complexos enzima-substrato (ES), observando-se assim uma
cintica de ordem-zero ou de saturao em relao ao substrato. Sob estas condies a
velocidade da reao somente dependente da converso do complexo enzimasubstrato, ES, em produto (P) e da difuso dos produtos a partir da enzima.
Pode ser observado a partir da equao 15.1 que quando o =0.5 Vmax, Km=[S]. Ento,
Km numericamente igual concentrao do substrato quando a velocidade inicial
igual metade da sua velocidade mxima (Figura 15.3) tendo como unidade a
molaridade. Valores de Km esto na faixa de 10-2 a 10-5 M e so importantes pois
permitem calcular a concentrao do substrato necessria para saturar todos os stios
ativos da enzima. Quando a [S]>>Km, a equao 15.1 reduzida a o Vmax, mas um
simples clculo revela que quando [S] = 10 Vmax, o somente 90% Vmax e que quando
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[S] = 100 Km, o =99 % Vmax. Apreciaes deste tipo so importantes para os ensaios
enzimticos.
Como mencionado anteriormente, reaes catalisadas enzimaticamente ocorrem por
meio da formao de um complexo enzima-substrato em que o substrato (S) liga-se nocovalentemente ao stio ativo da enzima (E). A formao deste complexo para a maioria
das enzimas rpido e reversvel e caracterizado por uma constante de dissociao, Ks
do complexo:

Onde k1 e k-1 so as constantes de velocidade para as reaes de formao e dissociao

do complexo ES, respectivamente. No equilbrio, as velocidades de formao e
dissociao so iguais e a lei de ao das massas pode ser aplicada para a reao
reversvel:
k1[E][S] = k-1[ES]
Portanto,
Ks = [E][S] = k-1 = 1
[ES]
k1 Ka
Onde Ka a constante de associao (ou afinidade).
Pode ser observado que quando o Ks numericamente grande, o equilbrio est a favor
das formas E e S livres. Por outro lado, quando o Ks numericamente pequeno, o
equilbrio est a favor da formao do complexo ES. Portanto, Ks inversamente
proporcional afinidade da enzima pelo substrato.
A converso de ES em produto (P) pode ser representada pela equao:

Onde k2 uma constante de primeira ordem para a reao.

Em alguns casos a converso de ES em E e P pode envolver vrios estgios e pode no
ser essencialmente irreversvel. A constante de velocidade k2 geralmente menor que
k1 e k-1, e em alguns casos muito menor. Em geral, portanto, a converso e ES em
produtos a etapa limitante tal que a concentrao de ES essencialmente constante,
mas no necessariamente a concentrao de equilbrio. Nestas condies a constante de
Michaelis, Km, dada por:
Km = k2 + k-1 = Ks + k2
k1
k1
evidente, que nestas circunstncias, Km deve ser numericamente maior que Ks e
somente quando k2 muito pequeno o Km se aproxima do valor de Ks. A relao entre
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estas duas constantes torna-se mais complicada pelo fato de que para algumas reaes
enzimticas dois produtos (P1 e P2) so gerados sequencialmente, cada um deles
controlado por constantes de velocidade diferentes. Portanto, cuidados devem ser
tomados na interpretao do significado de Km em relao ao Ks. A relao matemtica
entre Km e Ks e Km e afinidade da enzima pelo substrato s pode ser apreciada
totalmente somente quando o mecanismo completo da reao conhecido.
Embora a equao de Michaelis e Mentem possa ser usada para o clculo de Vmax e Km,
seu uso sujeito a dificuldades na determinao experimental de o em altas
concentraes de substrato, em outras palavras, na extrapolao da curva hiperblica
para obteno de um valor exato de Vmax. Transformaes lineares da equao de
Michaelis e Mentem so alternativas comumente utilizadas. O mais popular destes a
equao de Lineweaver-Burk obtida tomando-se o recproco da equao de Michaelis
e Mentem.
1 = Km 1 + 1
o
Vmax [S] Vmax
O grfico de 1/o (y) versus 1/[S] (x) resulta em uma reta, onde a inclinao Km/Vmax,
o intercepto no eixo 1/o igual a 1/Vmax e o intercepto no eixo 1/[S] igual a -1/Km.
Grficos alternativos so baseados na equao de Hanes e na de Eadie-Hofstee.
Tambm existem softwares de regresso no linear como o DynaFit (www.biokin.com)
e BRENDA (www.brenda-enzymes.info), os quais so utilizados preferencialmente em
casos onde se requer dados precisos de cintica.
importante notar que enquanto o Km uma caracterstica da enzima e de seu substrato
e o seu valor independente da quantidade da enzima utilizada para a sua determinao
experimental, o mesmo no verdade para o Vmax. No existe um valor absoluto de Vmax
e o seu valor depende da quantidade de enzima usada. Essa caracterstica ilustrada na
Figura 15.3 (pgina 586) e adicionalmente discutida no Exemplo 1 (pgina 589).
Alm de Km e Vmax, uma outra constante cataltica de importncia kcat, ou nmero de
renovao (turnover number), definido como:
kcat = Vmax
[Et]
Onde [Et] a concentrao total de enzima. O nmero de renovao o nmero
mximo de mols de substrato que podem ser convertidos em produto por mol de enzima
em uma unidade de tempo. Sua unidade dada pelo recproco do tempo em segundos (s1
). Seus valores variam de 1 a 107 s-1. Catalase possui um nmero de renovao de 4
107 s-1 e uma das enzimas mais eficientes conhecidas. O potencial cataltico de um alto
valor de nmero de renovao s pode ser atingido em altas concentraes de substrato
(concentraes saturantes) e isso raramente atingida em condies celulares. Uma
constante alternativa, chamada de constante de especificidade, definida como kcat/Km,
uma medida de quo eficientemente uma enzima converte substrato em produto em
baixas concentraes de substrato. Sua unidade dada por M-1s-1.
Para um substrato ser convertido em produto, molculas de substrato e da enzima
precisam primeiramente colidir por difuso randmica e ento combinar-se e uma
orientao correta. Difuso e coliso possuem constantes de velocidades tericas
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limitantes em torno de 109 M-1s-1 e vrias enzimas, incluindo acetilcolina esterase,
anidrase carbnica, catalase, -lactamase e triosefosfato isomerase, possuem constantes
de especificidade prximas deste valor indicando que elas esto prximas ao mximo de
eficincia cataltica. Como a constante de especificidade uma razo entre duas outras
constantes, enzimas com constantes de especificidade similares possuem valores
bastante diferentes de Km. Como exemplo, catalase possui constante de especificidade
de 4 107 M-1s-1 com um Km de 1.1 M (bastante alto), por outro lado, fumerase possui
uma constante de especificidade de 3.6 107 M-1s-1com um Km de 2.5 10-5 M (bem
baixo). Complexos multienzimticos conseguem superar limitaes decorrentes de
difuso e coliso. Neste caso, o produto de uma reao passada diretamente por um
processo de direcionamento (channelling) para o stio ativo da prxima enzima na via
como consequncia da justaposio no complexo, portanto eliminando limitaes
referentes difuso.
Efeito da concentrao do substrato
Pode ser observado para reaes enzimticas monosubstrato que eles obedecem a
cintica de Michaelis e Mentem:
o = k2[E][S]
Km + [S]
E, portanto,
o = k2 [E]
(Km/[S]) + 1
Ento, quando a concentrao do substrato grande, a equao anterior reduz-se a
o = k2 [E]
Onde a velocidade proporcional concentrao do susbstrato. Esta a base para
determinao experimental da atividade enzimtica de uma amostra biolgica.

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Inibio de reaes enzimticas
- Inibio reversvel competitiva
Inibidores reversveis combinam-se no covalentemente com as enzimas e, portanto
podem ser removidas facilmente por dilise. Inibidores reversveis competitivos
combinam-se no mesmo stio que o substrato e deve ser, portanto ser relacionado
estruturalmente com o substrato. Como exemplo pode-se citar a inibio da succinato
desidrogenase por malonato:
CH2COOH

CH2COOH

CH2COOH

COOH

cido succnico (Substrato)

cido malnico (Inibidor)

Succinato desidrogenase

Succinato desidrogenase

CHCOOH

CHCOOH

Nenhuma reao

cido fumrico (Produto)

Todos os inibidores reversveis so caracterizados por uma constante de dissociao, Ki,

chamada de constante de inibio, que pode estar relacionada com a constante de
dissociao de EI (KEI) ou de ESI (KESI). Para inibidores competitivos as duas equaes
seguintes pode ser escritas como:

E+S

ES

E+P

E+I
EI
sem reao
Como a ligao do substrato e do inibidor ocorrem no mesmo stio, o efeito do inibidor
pode ser desfeito aumentando-se a concentrao do substrato. O resultado que o Vmax
no se altera, mas a concentrao necessria para atingir o Vmax aumentada de forma
que quando o = 0.5 Vmax:
[S] = Km 1 + [I]
Ki

Onde a [I] a concentrao do inibidor.

Pode ser observado pela equao acima que Ki igual concentrao do inibidor que
aparentemente dobra o valor de Km. Com este tipo de inibidor, Ki igual a KEI, enquanto
KESI infinito pois ESI no formado. Na presena de inibidor competitivo, a equao
de Lineaweaver-Burk torna-se:
1

Km
Vmax

1
[S]

1+

[I]
Ki

1
Vmax

Aplicao desta equao permite o diagnstico de inibio competitiva (Figura 15.5a,

pgina 593). O valor numrico de Ki pode ser calculado a partir do grfico de
Lineaweaver-Burk para a reao sem o inibidor e com o inibidor. Na prtica, no
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entanto, valore mais preciso obtido atravs de um segundo grfico (Figura 15.6,
pgina 593). A reao conduzida para vrias concentraes do substrato na presena
de algumas concentraes de inibidor, e em seguida constri-se um grfico de
Lineawever-Burk para cada concentrao do inibidor. Um segundo grfico construdo
plotando-se os diferentes valores de inclinao ou de Km aparente [Km, que igual a Km
(1+ [I]/Ki) e que pode ser determinado atravs do intercepto no eixo 1/[S] ] versus
concentrao do inibidor. Em ambos os grficos o intercepto no eixo de [I] d o valor de
Ki.
-Inibidor reversvel no-competitivo
Um inibidor reversvel no-competitivo combina-se com a enzima em um stio diferente
do stio ativo do substrato. Por mais que o substrato ainda possa se ligar ao complexo EI
formando um complexo ternrio ESI, este complexo no capaz de converter substrato
em produto e chamado de complexo final suicida. Como a inibio envolve um
stio distinto do stio cataltico, a inibio no pode ser revertida pelo aumento da
concentrao do substrato. A consequncia que Vmax e no o Km reduzido, pois o
inibidor no afeta a ligao do substrato enzima, mas afeta a quantidade de ES que
pode prosseguir em direo formao do produto. Neste tipo de inibio KEI e KESI so
idnticos e Ki numericamente igual a ambos. Neste caso a equao de LineaweaverBurk torna-se:
1

Km
Vmax

1
[S]

1
Vmax

1+

[I]
Ki

Uma vez que inibidores no-competitivos tenham sido diagnosticados, o valor de Ki

melhor determinado atravs de um segundo grfico obtido plotando-se os diferentes
valores de inclinao ou de 1/Vmax (intercepto no eixo 1/o) versus concentrao de
inibidor ([I]). Em ambos os grficos o intercepto no eixo de [I] d o valor de Ki.
- Inibidor reversvel acompetitivo
Um inibidor reversvel acompetitivo pode-se ligar somente ao complexo ES e no
enzima livre e, portanto o inibidor se liga a um sitio que criado durante a alterao
conformacional da enzima promovida pela ligao ao substrato. O complexo ternrio,
ESI, resultante chamado de complexo final suicida.
Assim como com o inibidor no-competitivo, o efeito do inibidor no pode ser revertido
pelo aumento da concentrao do substrato, mas neste caso ambos Km e Vmax so
reduzidos por um fator de (1+ [I]/Ki). Uma concentrao de inibidor igual ao Ki,
portanto ir diminuir o valor de Km e Vmax pela metade. Com este tipo de inibidor, KEI
infinito, pois o inibidor no pode se ligar enzima livre e, portanto Ki igual a KESI.
Neste caso a equao de Lineaweaver-Burk torna-se:
1
Km
1
1
[I]
1+
=

+
Vmax [S]
Vmax
Ki
0
O valor de Ki mais precisamente determinado a partir de um segundo grfico de
1/Vmax ou I/Km versus a concentrao do inibidor. Em ambos os grficos o intercepto
no eixo de [I] d o valor de Ki.

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- Inibidor reversvel misto
Para alguns inibidores o complexo ESI possui alguma atividade cataltica ou o KEI e
KESI no so iguais e nem infinitos. Nestes casos so obtidas cinticas de inibio do
tipo misto. Na inibio mista as retas obtidas nas reaes sem inibidor e com inibidor
sofrem interseco acima ou abaixo do eixo 1/[S]. O valor de Ki pode ser determinado
atravs de um segundo grfico de inclinao ou de 1/Vmax versus a concentrao do
inibidor. Em ambos os grficos o intercepto no eixo de [I] d o valor de Ki. A inibio
no-competitiva pode ser classificada como um tipo especial de inibio mista.

Inibio irreversvel
Inibidores irreversveis, tais como compostos organofosforados e organomercricos,
cianeto, monxido de carbono, sulfito de hidrognio, combinam com enzima para
formar ligao covalente estvel. A extenso da inibio de uma enzima dependente
da constante de velocidade (e, portanto do tempo) para a formao da ligao covalente
e tambm da concentrao do inibidor presente. O efeito de inibidores irreversveis, que
no podem ser removidos por tcnicas fsicas como a dilise, reduzir a quantidade de
enzima disponvel para a reao. A inibio envolve reaes com grupos funcionais,
como hidroxilas e sulfidrilas, ou com tomos de metais no stio ativo ou alostrico.
Assim, compostos organofosforados, diisopropil-fofofluoridato, reage com a serina do
stio ativo de esterases tais como a acetilcolinesterase, enquanto compostos
organomercricos como o p-hidroximeriobenzoato reage com cistenas, em ambos os
casos resultando na formao de ligaes covalentes e inibio enzimtica. Tais
inibidores so valiosos n estudo de stio ativo de enzimas.

Aplicaes da inibio enzimtica

O estudo da classificao e dos mecanismos de inibio enzimtica de importncia em
diversos aspectos:
- fornece informaes sobre o mecanismo pelo qual a enzima promove a atividade
cataltica (mais detalhes na seo 15.4.1 pgina 611);
- fornece informaes de possveis mecanismos de regulao de atividades metablicas
in vivo;
-permite a sntese de inibidores especficos para serem utilizadas como agentes
teraputicos bloqueando vias metablicas chaves envolvidas em condies clnicas
(mais detalhes na seo 18.1.2, pgina 709).

Link para as figuras

http://www.cambridge.org/gb/knowledge/isbn/resources/item2713153/?site_locale=en_GB#

Chapter 15
GR01: Fig.15.1 Figura do estado pr-estacionrio
GR02: Fig.15.2 Clculo de o
GR03: Fig.15.3 Efeito da [S] na o e efeito de diferenes concentraes de inibidores
GR04: Fig.15.4 Grficos Lineaweaver-Burk, Hanes e Eadie-Hofstee
GR05: Fig.15.5 Grficos Lineaweaver-Burk mostrando o efeito de 3 tipos de inibidores (a)
GR06: Fig.15.6 Grfico Lineawever-Burk (a) e Grfico para determinao de Ki determination (b)