Plant Foods Hum Nutr (2012) 67:247255

DOI 10.1007/s11130-012-0301-5

ORIGINAL PAPER

Solubilization, Fractionation, and Electrophoretic Characterization

of Inca Peanut (Plukenetia volubilis L.) Proteins
Shridhar K. Sathe & Harshal H. Kshirsagar &
Girdhari M. Sharma

Published online: 12 August 2012

# Springer Science+Business Media, Inc. 2012

Efectos abstractas de diferentes disolventes, fuerza inica

y pH en la semilla de man del inca, la solubilidad de
protenas se evaluaron mediante el anlisis cuantitativo
de protenas solubilizadas utilizando mtodos de Lowry y
Bradford. Las protenas solubles se fraccionaron
utilizando el procedimiento Osborne y la composicin de
polipptido de las protenas solubilizadas se determin
por uno 25% de gradiente dimensional de acrilamida
lineal monmero SDS-PAGE. Fracciones de protena
Osborne se analizaron por electroforesis en gel de 2D.
Las Protenas totales de semillas eran eficientemente
solubilizado por NaCl 2N entre los disolventes
ensayados. Las protenas de semillas solubles registraron
una solubilidad mnima a pH ~ 4,0. Fracciones Osborne
de protenas, albminas, globulinas, prolaminas, y
glutelinas representaron el 43,7, 27,3, 3,0, y 31,9%,
respectivamente, del total de protenas solubles acuosas.
Protenas de la harina de semillas Soluble se componen
principalmente de polipptidos en el rango de MW de
6-70 kDa de los cuales los predominantes poli-pptidos
estaban en el rango de 20-40 kDa. Fraccin Prolamina se
compone principalmente de cuatro polipptidos (MW
<15 kDa).

Glycoprotein staining indicated 3235 and <14 kDa peptides

to be positive.
Keywords Inca peanut . Protein . Solubility . Protein
fractions . Electrophoresis

Abbreviations
-ME
-mercaptoethanol
CBBR
Azul brillante de Coomassie R
CHAPS 3-[(3-colamidopropil)dimethylammonio]-1propanosulfonato
ditiotreitol
DTT
EtOH
Etanol
El enfoque isoelctrico
IEF
kDa
Kilodalton
Diferencia mnima significativa
LSD
MeOH
Metanol
MW
Ppeso moleculart
Electroforesis en gel de poliacrilamida
PAGE
Isoelctrico de pH
pI
Temperatura ambiente
RT
Sodium dodecyl sulfate
SDS
2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol
Tris
Introduccion

Present Address:
H. H. Kshirsagar
Roquette America Inc.,
2000 South Batavia Avenue, Suite 400,
Geneva, IL 60134, USA
Present Address:
G. M. Sharma
Department of Health and Human Services, Public Health Service,
Food and Drug Administration,
Office of Applied Research and Safety Assessment,
Center for Food Safety and Applied Nutrition, U.S. FDA,
8301 Muirkirk Road,
Laurel, MD 20708, USA

Los alimentos vegetales son importantes en la nutricin

humana y animal. Segn la FAO [1] datos estadsticos, los
alimentos vegetales [los cereales (46,4%), races / tubrculos
(5,1%), aceites vegetales (9,6%), sug-ars / edulcorantes
(8,1%), frutas (5,9%), y pulsos (2,1%)] junto
proporcionaron 77,2% de la energa total de alimentos
consumidos durante 2005-2007. Entre los alimentos
vegetales, los cereales suelen proporcionar la mayor parte de
las caloras (rango 18,5% para Burundi y Ruanda a 78,1% en
el caso de Bangladesh). Legumbres, a pesar de su alto
contenido de protena, contribuyen en mucho menor
porcin de la ingesta calrica global (rango de 0% para
Armenia, Azerbaiyn, Bielorrusia, Georgia, Letonia, Samoa

248

Uzbekistn y Vanuatu al 18,7% para Burundi). Las

legumbres como los frijoles, las arvejas y algunas semillas
oleaginosas, hacen una contribucin significativa al
abastecimiento humano y animal protena alimentaria [2-5]
y por lo tanto se consideran ser valorados cultivos. Reseas
de los alimentos y la nutricin de las leguminosas [6-13]
siguen apareciendo peridicamente indicando la
importancia mundial y el inters por la investigacin y la
utilizacin de leguminosas.
La soja, cacahuetes, guisantes y frijoles secos comunes son
algunos de los cultivos de leguminosas ms ampliamente
investigados y utilizados. Sin embargo, hay muchas especies
de leguminosas nativas que permanecen subutilizados (por
ejemplo, lablab, frijoles polilla, y Tepary). Un extenso
informe sobre leguminosas tropicales compilados por la
Academia Nacional de Ciencias de EE.UU. hace ms de 30
aos [14] es particularmente informativo y til en este
sentido. Adems de su uso en los alimentos, muchas
legumbres tambin son utilizados para usos no alimentarios
(por ejemplo, usos ornamentales de varios Acacia spp. Y la
produccin de maderas de lujo de Pterocarpus spp.) [14].
Plukenetia L. (Euphorbiaceae) es un gnero pantropical que
al parecer consta de 19 especies pertenecientes a Plukenetia
(subfamilia Acalyphoideae) [15, 16]. Especies Plukenetia se
Twining vias se encuentran en las selvas tropicales a los
bosques estacionalmente seco o matorrales. Plukenetia
penninervia Muell. Arg., A pe-cie que se encuentran en las
selvas tropicales de Mxico se utiliza para la canasta de otras
actividades artesanales WEAV-cin y durante varios siglos
que datan del periodo maya [17]. Man del inca (Plukenetia
volubilis L.), tambin conocido como Sacha inchi, es una
planta poco utilizada que crece silvestre en las selvas
tropicales de la regin andina. Esta planta pertenece a la
familia Euphorbiaceae [18]. Alta en aceite (54%, w / w) y la
protena (27%) [19], las semillas de plantas son tpicamente
plana, <2 cm de ancho, y ligeramente en forma en el medio
(Fig. 1) cpula. Las semillas estn protegidas por una
cubierta exterior dura, oscura con capa de tejido fino suave
en el interior. Dado que las semillas son amargas, que
normalmente se comen despus del procesamiento adecuado
(por ejemplo, el tostado) y se valoran como una fuente
importante de protenas de la dieta de la poblacin nativa. A
diferencia de los aceites de soja, man, semillas de algodn y
de girasol con alto contenido de cido linoleico, pero baja en
cido linolnico, el aceite de man del inca contiene

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proporciones aproximadamente iguales de los cidos grasos

esenciales, linoleic- el C18: 2, -6 (36,8% w / w) y
linolnico-C18: 3, -3 (45,2%, w / w). Un reciente informe
indi-cados que estos dos cidos grasos representaron 35,34
y 46,92%, respectivamente, con promedio reportado de los
datos publicados de 33,74 y 44,79%, respectivamente. La
cantidad de cido monoinsaturado oleico (9,6% w / w) en
los lpidos de man del inca es menor en comparacin con
los importes correspondientes en la soja (22,3%), man
(41,3%), algodn (18,7%) y girasol (29,3%) aceites de
semillas [19]. Las protenas de semillas de cacahuete Inca
son solubles en tampones acuosos y una albmina soluble
en agua ha sido reportado para constituir ~ 25% (w / w) de
la harina de semilla desgrasada peso o 31% de las protenas
totales en la semilla. Esta protena albmina es una
dimrica, glicosiladas [CON-contiene 4,8% (w / w) de
azcar], protena bsica (pI ~ 9,4) con un valor de
sedimentacin de ultracentrfuga 3S [20]. Los resultados de
los anlisis de composicin de aminocidos indican altos
niveles de cistena, tirosina, treonina y triptfano y bajas
cantidades de fenilalanina en las protenas de semillas [19,
21]. Protenas de leguminosas son conocidos por ser
deficientes en los aminocidos de azufre [6, 22]. Protenas
de semillas de man del inca contienen altas cantidades de
aminocidos azufrados (metionina + cistena), / 100 g de
protena harina de semilla de 37 mg, en comparacin con la
FAO / OMS / UNU recomienda patrn puntuable para
estos cidos-25 aminocidos de azufre mg / g de protena
100 [1, 19]. En conjunto, las protenas de la harina de
semilla de man del inca son una valiosa fuente de protenas
de la dieta. Sin embargo, a excepcin de algunos de los
estudios publicados, se sabe poco sobre las protenas de
semillas de man del inca. Aqu mostramos nuestras
conclusiones sobre la solubilidad de protenas y
propiedades-elec trophoretic de protenas de semillas de
man del inca.
Materiales y Metodos
Materiales
La fuente de semillas utilizadas para la Fig. 1 se ha
informado anteriormente [19]. Harinas desgrasadas de
semillas hexano (dos lotes separados, ~ 5 kg cada uno)
utilizados para las investigaciones en curso fueron un regalo
de Cristina Thibaut (Cobiosa, Industrias Asociadas SL,
Madrid, Espaa). Los lotes de harina desgrasada se
almacenaron a -20 C hasta su uso posterior. Fuentes de los
reactivos y productos qumicos utilizados se han reportado
anteriormente [21, 23].
Metodos
Todos los experimentos se llevaron a cabo al menos
por duplicado utilizando lotes separados de harinas
desgrasadas.
Solubilizacion y Extraccion de Proteinas

Fig. 1 Man inca toda semilla y grano. El ncleo est lleno dentro de
una cscara dura de color marrn oscuro con un forro de seda blanco
suave interior

Efecto de Buffer Las protenas se disuelve en el disolvente

seleccionado y el tiempo de extraccin se indica mediante
desgrasada

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harina de semilla a disolvente proporcin de 1:10 (w / v) a

temperatura ambiente (RT, ~ 25 C) con agitacin
mecnica constante. acuoso disolventes utilizados para la
solubilizacin de protenas fueron: A) destilaron
agua desionizada, B) 2 M NaCl, C) 0,1 M Tris-HCl (pH 8,1),
D) 0,05 M de tampn Na3PO4 (pH 7,5), E) 0,1 M de borato
de solucin salina tampn (BSB, 0,1 M H3BO3, 0,025 M
Na2B4O7, 0,75 M NaCl, pH 8,45), F) 0,1 M NaOH, G) 0.1 M
HCl, H) 2% (w / v) de dodecil sulfato de sodio (SDS), I) 70%
(v / v) acuosa etanol (EtOH), J) 10% (v / v) de cido actico,
2
K) 0. 1 M NaHCO3, L) 10% (w / v) Na2SO4. El pH de la
suspensin se ajust usando HCl 1 M y NaOH 1 M
(intervalo de pH 1-12). Al final del perodo de extraccin, la
suspensin se se centrifugaron (12,300g, 15 min, RT), se
recogi el sobrenadante y se utiliza para su posterior anlisis.
Efecto de la extraccin Condiciones en la protena Efectos
solubilidad de fuerza inica (NaCl 0-4M), el tiempo de
extraccin (1-5h, 1 M NaCl), pH (intervalo de pH 1-13, 1 M
NaCl extraccin), y repetida (cinco ) extracciones
consecutivas en 1 M NaCl en la solubilidad de la protena se
determinaron mediante la extraccin de 100 mg de harina
desgrasada con el disolvente apropiado (1 ml) [por ejemplo,
la harina a disolvente relacin de 1:10 (w / v)] a temperatura
ambiente con agitacin con vrtex continua en habitacin
temperatura (RT, ~ 25 C) seguido de centrifuga-cin a
16.000 g durante 15 min a RT. Para investigar los efectos del
pH sobre la solubilidad de la protena de harina de semillas,
harinas desgrasadas (2 g cada uno) fueron dispersados
primero, ya sea en agua destilada desionizada o acuosa 1 M
de NaCl y el pH de la dispersin se ajust al valor deseado
con diluido (0. 1 M) NaOH y / o HCl y continu la agitacin
durante 30 min hasta que el pH se estabiliz. Entonces, la
harina final a disolvente relacin de 1:10 (w / v) se ajust y las
protenas solubles se extrajeron durante 1 h con agitacin
magntica constante. Al final de la extraccin, la suspensin
se centrifug (15.000 g, 30 min, 4 C), el sobrenadante
recogido y analizado para la protena soluble dentro de 48 h.
Fraccionamiento de Osborne Protein fraccionamiento de las
protenas de la harina de semilla desgrasada se realiz por el
mtodo de Osborne [24]. Brevemente, la harina desgrasada
de semilla (100 g) cada una se extrajo secuencialmente con
NaCl 2 M (+ albminas globulinas), etanol acuoso al 70%
(prolaminas), y 0,1 M NaOH (gluteninas) en la harina a
disolvente relacin de 01:10 (w / v) a temperatura ambiente
(RT) durante 1 h con agitacin magntica constante. El pH
de las suspensiones de harina en agua destilada, NaCl 2 M, y
70% de EtOH acuoso fue de aproximadamente 6.6 a 6.7,
mientras que en 1 N NaOH el pH fue de ~ 12,6. Al final de
cada extraccin, la suspensin se centrifug (15.000 g, 30
min, 4 C), se recogi el sobrenadante, y el residuo se us
para la siguiente extraccin. El residuo se desech despus de
la etapa de extraccin de 0,1 M NaOH. Cada sobrenadante se
filtr a travs de papel de filtro Whatman nmero 4 y se
dializ (peso molecular de corte de la tubera de dilisis 06-8
kDa, Spectra-Por Dilisis, Spectrum Laboratories, Inc.,
Rancho Dominguez, CA) contra dis-labrados agua
desionizada durante 48 h (4 C, 10 iluminados cada uno, seis

249

cambios); cada extracto dializado, excepto para el extracto

2 M NaCl, se liofiliz por separado. Los verdaderos
albminas fueron separados de los verdaderos globulinas
sometiendo el dializado 2 M NaCl extracto a
centrifugacin (15.000 g, 30 min, 4 C). Las albminas
separadas verdaderas (sobrenadante) y los verdaderos
globulinas (residuos) se liofilizaron separado. Las
fracciones de protenas liofilizadas se almacenaron a -20
C en botellas con tapn de rosca de plstico hasta su uso
posterior.
Gel Electrophoresis

SDS-PAGE electroforesis en gel de poliacrilamida sodio

dodecil sulfato (SDS-PAGE) se llev a cabo por el mtodo
de Fling y Gregerson [25] como se describe en Sharma et al.
[26]. Muestras de protenas apropiadas se cargan en 8-25%
de gradiente de acrilamida lineal de separacin de gel y 4%
de monmero de acrilamida gel de apilamiento. El gel era
tpicamente a cabo a 10 mA / gel hasta que el colorante de
seguimiento migr hasta el borde gel (tpicamente 20 h).
Los geles se tieron con azul Coomassie Brilliant R (CBBR)
o tincin de plata seguido de destaining apropiado como se
describe anteriormente [23].
2D Electroforesis en gel se llevaron a cabo como se describe a
continuacin
(a) Geles de SDS-PAGE sin el agente reductor [2% v /
vmercaptoethanol (-ME)] were run in the first dimen-sion
followed by SDS-PAGE in the presence of the reducing
agent. Gels were typically run at a constant current (10 mA/
gel) with tap water cooling provided during the gel run. The
gels were stained with Coo-massie Brilliant Blue R and
appropriate lanes were excised for 2D analysis. The excised
gel strips were soaked in SDS-PAGE sample buffer
[0.05MTris-HCl, pH 6.8; 0.1 % (w/v) SDS; 0.01 % (w/v)
bromophenol blue; 30 % (v/v) glycerol] containing 2 % (v/v)
-ME and heat-denatured (~100 C) in a microwave oven
(Kenmore, model 565.68301790, Sears, Hoffman
Estates, IL) for 30 s at 1,000 W. The strips were then cooled
to RT, turned 90 counterclockwise, laid on top of the 4 %
stacking gel with a 825 % linear monomer acrylamide
gradient SDS-PAGE separating gel, and electrophoresed as
indicated above. The gels were then stained (CBBR) and
destained as described by Sathe et al. [23]. Briefly, the gels
were stained overnight with 0. 25 % Brilliant blue R
(B0149-100 G, Sigma-Aldrich) in 50 % methanol and 10 %
acetic acid. The gels were destained with destain solution
(50 % methanol and 10 % acetic acid) once followed by
diluted destaining solution (~1:1 with water) until the
background was clear.
(b)
Protenas fraccionadas IEF-SDS-PAGE fueron
sometidos
a
separaciones
2D
gel
utilizando
isoelectroenfoque (IEF) en la primera dimensin seguido
por SDS-PAGE como se describe por Sharma et al. [26].
Acerca de 1.1 a 1.4 mg de

250

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liofilizado fracciones de protena se suspendieron en

500 l de tampn de rehidratacin [8 M urea, 2% w / v
3 - [, portador (3-Cholami-dopropyl) dimetilamonio]
-1-propanosulfonato (CHAPS), 0,002% de azul de
bromofenol 0,5% anfolito, y ditiotreitol 20 mM
(DTT)] durante 1 h a temperatura ambiente, seguido
por centrifugacin a 16.000 g durante 15 min. Una
cantidad apropiada (30-50 l) del sobrenadante se
mezcl con el tampn-cin Rehydra a un volumen
final de 250 l y se utiliz para rehidratar pH 3-10NL
tiras IPG 13 cm (17-6001-15, GE Healthcare) durante
la noche (por lo tanto la carga de la muestra de
protena en las tiras). Las tiras se cubrieron con
aceite mineral para evitar la evaporacin. Las tiras
rehidratadas (que contienen las muestras de
protena) se utilizaron para IEF segn la
recomendacin del fabricante (IEF100, Hoefer
Scientific Co., CA) usando las condiciones siguientes:
1- voltios gradiente, 1000 V, 1 h; 2- voltios
degradado, 12.000 V, 1 h; 3- voltios constante, 12.000
V, 25 000 V, 1 h; 4- voltios constante, 1000 V, 1 h.
Para la segunda dimensin, las tiras enfocadas se
incubaron 15 min en tampn de equilibrio (6 M
urea, 75 mM Tris-HCl pH 8,8, 29,3% de glicerol, 2%
SDS, 0,002% de azul de bromofenol) que contiene 10
mg / ml de DTT, seguido por 15 min en tampn de
equilibrado que contienen 25 mg / ml de
yodoacetamida. Las tiras IPG fueron entonces
colocados horizontalmente en un monmero de
gradiente de gel de acrilamida lineal 8-25% y sellados
con 1% (w / v) de agarosa. Una cantidad apropiada
(10 l) de sobrenadantes mismos y los marcadores de
protenas se cargaron en el cada lado del gel, y correr
durante la noche a corriente constante de 10 mA / gel
seguido de 20 mA / gel da siguiente, hasta que el
colorante de seguimiento alcanz borde gel . Los
geles se tieron entonces (CBBR) y destained como
se describe por Sathe et al. [23]).

Proteina Soluble La protena soluble se determin

utilizando los mtodos de Lowry et al. [28] y Bradford [29].
Cada muestra se diluy y se analiz por duplicado
tpicamente adecuadamente.
Taninos un peso conocido de la muestra (0,1 g) se extrajo
durante 1 h en metanol absoluto (MeOH) y se acidific
(HCl al 1%, v / v) MeOH con agitacin con vrtex continua
seguido por centrifugacin (15.000 g, 10 min, RT). Las
alcuotas del sobrenadante se analizaron inmediatamente
para tanino utilizando un 4% (w / v) de ensayo vainillina
[30]. Una curva estndar catequina (0-1 mg / ml) se prepar
de forma simultnea. Contenido de taninos se expresa como
equivalentes de catequina.
Statistical Analysis
Todos los anlisis estadsticos se realizaron utilizando el
software estadstico SPSS (versin 15, Chicago, IL). Todos
los experimentos se llevaron a cabo al menos por duplicado,
y los datos se expresan como la media desviacin estndar
(SD). ANOVA de una va y de Fisher diferencia menos
significativa (LSD) de prueba como se describe por Ott [31]
se utilizaron para determinar la significacin estadstica, y
los resultados se consideraron significativas si las
diferencias entre los dos medios excedieron el valor LSD
(p00.05) .
Results and Discussion
Harina Desgrasada
Se analizaron tres muestras de cada una de las dos harinas
desgrasadas lotes (N06) para la composicin proximal. La
protena promedio de porcentaje (% N x 5,7), humedad,
cenizas, y soluble contenido carbo-hidratos de las harinas
desgrasadas fueron 59,1 3,3, 8,32 0,11, 6,46 0,05 y 1,03
0,06, respectivamente. Los fenoles solubles totales medios
en las harinas desgrasadas fueron 0,117 0,021 y 0,112
0,016 g / 100 g de harina, cuando se extrajo con

Tincion de Glicoproteina
Tincin de glicoprotena se realiz en geles de SDS-PAGE
utilizando el procedimiento de tincin de glicoprotena
GelCode (Pierce Chemical Co., Rock-vado, IL) siguiendo las
instrucciones del fabricante
Composiciuon Proximal
Humedad Una muestra exactamente pesada (0,1 g) se
coloc en un recipiente de aluminio y se sec en un
previamente calentada vacu-um horno (Barnstead LabLine, Melrose Park, IL; modelo 3608- 5; 95 a 100 C, 25 en .
de Hg) hasta un peso constante AOAC Mtodo Oficial
925.40 [27].
Proteina AOAC Mtodo Oficial 950.48 [27]. El mtodo de
micro-Kjeldahl se utiliz para determinar protenas totales
utilizando 0,1 g de muestra. Se calcul el contenido de
nitrgeno de la muestra usando la frmula: Protein ( %
total N ( %  5:7.

Fig. 2 Semilla de protena de harina de solubilidad en un agua

desionizada destilada, NaCl 2 M b, c 0. M Tris-HCl 1 (pH 8,5), d
tampn de fosfato de sodio 0,05 M (pH 7,5), 0,1 M e BSB (pH 8,45), f
0,1 M NaOH, HCl 0,1 M g, h 2% (w / v) SDS, i 70% (v / v) EtOH, j
10% (v / v) de cido actico, K 0,1 M NaHCO3, l 10% (w / v) Na2SO4.
LSD (p00.05) es 7,76 (Lowry) y 0,97 (Bradford), n=6 para ambos

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251

Fig. 3 Efectos de una

concentracin de NaCl
indicado, b tiempo de
extraccin, c extraccin
consecutiva (1 h cada una) en
solucin acuosa de NaCl 2
M, y d pH sobre la
solubilidad de protena de
harina de semillas. Para by d,
acuosa 1 M NaCl se utiliz
para extractos de protenas.

Los valores para el mtodo de

Lowry LSD (p = 0,05) fueron
2,81, 6,8, 4,46, y 8,18,
respectivamente, para a, b, c, y
d. LSD (p = 0,05) valores para
el mtodo de Bradford fueron
1,52, 1,76, 0,82, y 1,26,
respectivamente, para a, b, c, y
d, n = 6 para ambos

metanol y metanol acidificado, respectivamente, indicando los

compuestos fenlicos ambos disolventes. La composicin
qumica de la harina desgrasada encontrado en la presente
investigacin es coherente con la soja [32], de man [33],
ssamo [34], y el altramuz [35, 36] harinas de semillas. El
contenido de protena de la harina desgrasada encontrado en
la investigacin actual es comparable a el contenido de
protena reportado (53%) para la harina desgrasada de Inca de
man crecido en el Per [19].
Solubilidad de Proteinas
Entre los disolventes ensayados, 0,1 N NaOH y NaCl 2 M
fueron los disolventes ms eficaces para solubilizar las
protenas de la harina (Fig. 2). Dado que la fraccin de
albmina constituye una porcin significativa de las
protenas totales de la semilla, una buena solubilidad se
esperaba en disolventes acuosos [21]. Aunque NaOH 0,1
M fue el solubilizante protena ms eficaz, la exposicin a
alcalino se sabe que altera las protenas a travs de la
desamidacin de aminocidos y por lo tanto puede
alterar propiedades de la protena [37, 38]. Alkali
exposicin tambin puede causar la destruccin de
algunos de los aminocidos esenciales, tales como lisina,
disminuyendo de ese modo el valor nutritivo de las
protenas solubilizadas. Por estas razones, M NaCl 2 fue
considerado como el mejor disolvente para solubilizar las
protenas de la harina de semillas de Inca en esta
investigacin. Cuando las protenas solubles se
analizaron por Lowry et al. [28] y Bradford [29] MethODS, el ltimo mtodo consistentemente menor
contenido
de
protena
registrada
(Fig.
2),
independientemente del disolvente usado. Mtodo de
Bradford es segn se informa ~ 4 ms sensible que el
mtodo de Lowry y susceptibles a la interferencia por 1%
de SDS, 1% de Triton X-100, y en menor medida por 1%
Hemosol, 2 M Tris, acetona y 5% de fenol. Ensayo de
protenas Lowry es

susceptible a una serie de reactivos y productos qumicos

encontrados comnmente en las muestras biolgicas. Entre estos,
el aminocido estos, glicina (al 0,5%) se conoce para disminuir el
color con la protena por 50%. La glicina, en 118 mg / g de
protenas, es el segundo aminocido ms abundante, detrs de
cido glutmico (133 mg / g pro-protena), en las protenas de la
harina de man del inca [19]. Se espera un rendimiento de color
ms baja y menor contenido de protena, todo glicina siempre
estaba en forma de aminocido libre cuando se utiliz el mtodo de
Lowry. Es poco probable que todos los residuos de glicina en
semillas de man Inca estaran en la forma de aminocido libre. Los
disolventes utilizados para la solubilizacin de protenas son
tambin poco probable que contienen cantidades significativas de
glicina. El menor contenido de protena (mtodo de Bradford) de
0,1 M Tris-HCl (pH 8,1) extrae muestras de protenas Aunque es
posible, no es probable debido a la interferencia por Tris como la
concentracin final en el ensayo de Tris (0.1 mM) era mucho
menor que el reportado 2 M Tris interferir en el ensayo de
Bradford. La estimacin consistente protena inferior en Bradford

Fig. 4 Semilla de protena de harina de solubilidad en agua

desionizada destilada a pH indicado (mtodo de Lowry). Tenga en
cuenta la solubilidad mnimo de protena a pH 4. LSD (p = 0,05)
01,26, n = 6

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Fig. 5 SDS-PAGE (8-25% de monmero de acrilamida gradiente

lineal) el anlisis de la harina de semilla total protenas solubles
utilizando plata una tincin b y c glicoprotena en disolventes
indicados (AL, igual que en la Fig. 2) en ausencia y la presencia de una
b, c de un agente reductor (2% v / v ME).

La carga de protenas en cada carril fue de 10 mg a, b, y 40 mg c. Esta

cifra es un compuesto de 3 geles diferentes (15 pocillos cada una).
Normas (P) de protenas (S) y de polipptido utilizadas se indican por
sus pesos moleculares (kDa) a la izquierda

ensayo [28] en comparacin con el procedimiento Lowry

[27], en todas las muestras analizadas, sigue sin resolverse y
por lo tanto garantiza nuevas investigaciones para
determinar la causa (s) de esta diferencia.

se caracterizaron por polipptidos en el rango de 10-70 kDa.

Las protenas de la harina de semillas soluble se componen
principalmente de dos especies moleculares (32-35 kDa y ~
60-62 kDa). Perfiles electroforticos en ausencia del agente
reductor -ME (Fig. 5a) tambin indicaron que las
protenas de semillas contienen disulfuro polipptidos de
bonos-vinculado. Tras la reduccin, el perfil de
electroforesis (Fig. 5b) indic que el polipptido 60-62 kDa
se compone de un dmero unido enlace disulfuro de 32-35
kDa y 60-62 kDa un polipptido monomrico. Aunque
disulfuro de reduccin de enlaces facilit una significativa
desaparicin de los polipptidos 60-62 kDa, que no permita
su eliminacin (por ejemplo, comparar el ancho de banda y
la intensidad de estas bandas en los carriles J, K, L y en la
Fig. 5a frente

En NaCl 0.5 concentracin de protena M solubilidad

aument significativamente la concentracin 0.05NaCl
(Fig. 3a). Tiempo de extraccin de 15-30 min se consider
adecuada para solubilizar al mximo las protenas de la harina
en NaCl 2 M (Fig. 3b) y dos extracciones consecutivas fueron
capaces de solubilizar la mayora de las protenas de la harina
(Fig. 3c). Ensayo de Bradford una vez registrado lecturas de
protenas ms bajos que el ensayo de Lowry cuando se
analizaron las muestras solubilizadas procedimiento de NaCl
(Fig. 3a, b, y c). En presencia de NaCl 1 M la influencia del
pH sobre la solubilidad de la protena (Fig. 3d), tal como se
determina por el mtodo de Lowry [27], era estadsticamente
no significativo, como se indica por el estrecho rango (40,93 a
47,00 g protena solubilizada / harina desgrasada 100g a pH 1
y 12, respectivamente). La diferencia en la solubilidad de la
protena era menor que el LSD 0 8,18 (p 0 0.05) para esta
prueba intervalo de pH (1-13). Protena solubilidad de estos
sam-ples, determinado por el mtodo de Bradford, exhibi un
estrecho rango [8,42 a 13,38 g de protena solubilizada /
harina desgrasada 100g a pH 4;]. Con la excepcin de la
solubilidad a pH 3, solubilidad de la protena como se
determina por el mtodo de Bradford, disminuy
significativamente a pH 4. La baja solubilidad de la protena
en el intervalo de pH 3-5 se confirm adicionalmente cuando
la influencia del pH sobre la solubilidad de la protena en
agua destilada, es decir, en ausencia de NaCl 2 M, se
determin (Fig. 4). La dependencia observado pH de
solubilidad de la protena es consistente con el dominio
informado de aminocidos cidos en la composicin de las
protenas de la harina de semillas [19]. Tomados en conjunto,
los resultados de solubilidad de protenas en-dican la
importancia de la fuerza inica en la solubilizacin de
protenas de semillas de man del inca.

Fig. 6 Dos dimensional SDS-PAGE de BSB (0,1 M, pH 8,45) protenas

solubles. Primera dimensin (arriba gel) se llev a cabo en ausencia de
un agente reductor (2% (v / v) -ME). Protena (100 mg de carga) la
migracin era de izquierda a derecha. Gel de segunda dimensin se
llev a cabo por la presencia de un agente reductor (2% (v / v) -ME)
usando protena soluble (50 g) en el carril de referencia izquierda y
marcadores de peso molecular en el carril derecho de referencia. La
migracin de protena fue de arriba a abajo

Osborne de fraccionamiento de protenas y Electroforesis

Con la excepcin de 70% EtOH acuoso, protenas solubilizadas
exhibieron un patrn polipptido consistente, respecto-menos del
disolvente utilizado (Fig. 5). Las protenas de semillas solubles

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253

protenas en SDS-PAGE (Fig. 6) confirm adems la presencia de dos

tipos diferentes de protenas de 60-62 kDa. Los polipptidos
solubilizados por 70% (v / v) EtOH acuoso manchado mal usando
tincin de plata (carril I, Fig. 5a y b). Glicoprotena de tincin (Fig. 5c)
de las protenas solubilizadas demostr que los polipptidos 32-35 kDa
estn glicosilados. La tincin de glicoprotena tambin revel que los
70% (v / v) acuosas polipptidos solubles EtOH (rango de 10-30 kDa)
que fueron mal manchada en la tincin de plata fueron reconocidos
fcilmente (Fig. 5c, pista I).

Fig. 7 SDS-PAGE (8-25% de gradiente de acrilamida lineal

monmero) en presencia de un agente reductor (2% (v / v) -ME)
para las fracciones de protena de Osborne. Carga de protena, a
excepcin de las normas, fue de 75 g cada uno. Tenga en cuenta los
diferentes polipptidos en globulina (*) en comparacin con el perfil
fraccin de albmina. El polipptido marcado () en el lcali perfil
fraccin glutelina era claramente diferente en comparacin con el
perfil polipptido fraccin globulina

5b). La comparacin de los carriles correspondientes de la

Fig. 5a y b demuestran el aumento de la concentracin y el
nmero de poli-pptidos con MW <30 kDa que indica la
importancia de los enlaces disulfuro en la organizacin de
protena de semilla. Estos resultados indican la presencia de
dos tipos diferentes de protenas de 60-62 kDa. Un anlisis
2D de las soluble acuosa 2 M de NaCl
Fig. 8 2D (gel IEF superior izquierda
a derecha- rango de pH 3-10, seguido
de SDS-PAGE- arriba a abajo) de gel
de anlisis electrofortico de las
protenas fraccionadas pre-Pared de la
harina de semilla desgrasada. Carga de
protena fue de ~ 60 g cada una en
ambas direcciones. Pesos Molec-lares
(kDa) de las protenas de Stan-Dard se
indican en cada gel a la izquierda. Las
fracciones de protenas en el segundo
gel dimen-sin estn en el gel
correspondiente (carril derecho)
indica como una albmina, globulina
Prolamina Gb y un lcali glutelina

Del total de protenas solubles, verdadera albmina, globulina

y glutelina fueron las principales fracciones de la harina de
semilla de protenas solubles con prolamina contribuir en una
pequea proporcin (Fig. 7b). Tpicamente, ms del 90% de las
protenas de la harina de semillas podra ser solubilizado por
los disolventes acuosos utilizados para el fraccionamiento proprotena. Un anlisis SDS-PAGE de las fracciones dimensional
Osborne (Fig. 7) indica (juzgados cualitativamente basan en
ancho de banda y la intensidad) que los polipptidos
principales (30-40 kDa) de rango que constituyen la fraccin de
albmina tambin parecen ser los principales polipptidos en
globulina y glutelina fracciones. La principal diferencia entre la
fraccin de albmina y globulina eran los muy diferentes
polipptidos presentes en la fraccin globulina (indicado por
un * junto al polipptido a la derecha de la pista de la
globulina). Glob-ulin y fracciones glutelina tenan polipptido
com-posicin comparable con la fraccin de glutelina
exhibiendo mayor proporcin de polipptido marcado por la
flecha (lado derecho de la pista glutelina). Fraccin Prolamina
era en su mayora

254

compuesto de cuatro polipptidos en el peso molecular van 6-12

kDa. Electroforesis en gel bidimensional de las fracciones de
solubilidad de la protena (IEF en la primera dimensin seguido
por la SDS-PAGE en presencia de -ME (Fig. 8) confirm
adems que las protenas de la harina de semillas estaban
compuestas principalmente de dos tipos de polipptidos con
estimada pesos moleculares en el rango de 32-35 kDa que
estaban vinculados entre s por enlaces disulfuro. Estos
resultados tambin demostraron que la fraccin de glutelina es
diferente de la fraccin de globulina (comparar el perfil
globulina a la del perfil para glutelina frac-cin en la Fig. 8 ),
principalmente con respecto al pH isoelctrico de polipptidos
individuales. Un examen ms detenido indi-Cates que la
fraccin de globulina contena polipptidos que son ligeramente
ms bsica (juzgados en base a su movilidad en la primera
dimensin) que los de la fraccin glu-telin aunque el peso
molecular, indicado por su movilidad en la segunda dimensin,
parece ser similar. Aunque la exposicin alcalino de los
polipptidos Glob-ULIN insolubles durante la preparacin de la
fraccin de glutelina puede causar un posible desamidacin
resultante en la forma-cin de polipptidos cidos, no explica
por qu los polipptidos globulina no se solubilizaron durante 2
extraccin de NaCl (el primer paso) durante semilla protena de
harina fraccionamiento sobre todo porque la harina al
disolvente proporcin de 1:10 (w / v) proporcionan ms de la
cantidad suficiente de disolvente. Es posible que cuando
albminas y globulinas estn presentes juntos, su
comportamiento colectivo, como op-que representa para su
comportamiento individual, puede variar signifi-cativamente,
una observacin similar a la que se inform anteriormente en el
Gran Norte de frijol (Phaseolus vulgaris L.) protenas
[39] .Onepossiblereason de thedifferent ser-conducta entre
albminas y globulinas, cuando estn presentes juntos, es decir,
las interacciones protena-protena. Estas interacciones
protena-protena son facilitadas por fuerzas de enlace dfferent
(por ejemplo, inico, de hidrgeno, hidrofbico, y disulfuro) en
funcin de las condiciones ambientales permitidas por las
condiciones experimentales utilizadas (por ejemplo, pH, fuerza
inica y temperatura). Tales interacciones protena-protena
pueden conducir a la formacin de grandes complejos de
protenas (soluble e insoluble) que afectan tanto su solubilidad.
Si solubilidad globulina es limitado debido a la presencia de las
albminas, las globulinas insolubles luego se extraen como los
glteos-Lins solubilizados por la solucin de lcali. Tenga en
cuenta la aparicin de nuevos polipptidos [> 56 kDa y <72 kDa
y varios polipptidos en> 26 y ~ 34 kDa gama)] en la segunda
dimensin que no formaban parte de la fraccin globulina. El>
26 kDa y ~ 34 kDa polipptidos tienen pIs ms cidos en
comparacin a los IP de la fraccin globulina originales. Desde
solubilizacin alcalino sera posiblemente desamidado
susceptibles de globulina polypep-mareas, que pueden aparecer
como parte de la fraccin de glutelina (Fig. 8). Nuevas
investigaciones en la comprensin de las propiedades
moleculares, nutricionales y funcionales de Inca

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protenas de semillas de cacahuete sera til en la

utilizacin de esta fuente de protena para una variedad de
propsitos y son por lo tanto en marcha.

References
1. FAO Statistical Yearbook (2010) Food and Agricultural Organization, FAOSTAT, Table D.2. Accessed January 14, 2012
2. Derbyshire E, Wright DJ, Boulter D (1976) Review: Legumin and
vicilin, storage proteins of legume seeds. Phytochem 15:324
3. Duranti M, Gius C (1997) Legume seeds: Protein content and
nutritional value. Field Crops Res 53:3145
4. Deshpande SS (1992) Food legumes in human nutrition- a personal
perspective. CRC Crit Rev Food Sci Nutr 32:333363
5. Sathe SK (2002) Dry bean protein functionality. CRC Crit Rev
Biotechnol 22:175223
6. Sathe SK, Deshpande SS, Salunkhe DK (1984) Dry beans of
phaseolus: a review. Part I. Proteins. CRC Crit Rev Food Sci Nutr
20:146
7. Sathe SK, Deshpande SS, Salunkhe DK (1984) Dry beans of
Phaseolus: A review. Part II. Chemical composition. CRC Crit
Rev Food Sci Nutr 21:4193
8. Ekanayake S, Jansz ER, Nair BM (2000) Literature review of an
underutilized legume: canavalia gladiata L. Plant Foods Hum
Nutr 55:305321
9. Schwenke KD (2001) Reflections about the functional potential of
legume proteins. A review. Nahrung 45:377381
10. Pugalenthi M, Vadivel V, Siddhuraju P (2005) Alternative food/
feed perspectives of an underutilized legume Mucuna pruriens var.
Utilis- A review. Plant Foods Hum Nutr 60:201218
11. Phillips RD, McWatters KH, Chinnan MS, Hung Y-C, Beuchat
LR, Sakyi-Dawson E, Ngoddy P, Nnanyelugo D, Enwere J,
Komey NS, Liu K, Mensa-Wilmot Y, Nnanna IA, Okeke C,
Prinyawiwatkul W, Saalia FK (2003) Utilization of cowpeas for
human food. Field Crops Res 82:193213
12. Montoya CA, Lalls J-P, Beebe S, Leterme P (2010) A review:
phaseolin diversity as a possible strategy to improve the nutritional
value of common beans (Phaseolin vulgaris). Food Res Int
43:443449
13. Sprent JI, Odee DW, Dakora FD (2010) African legumes: A vital
but under-utilized resource. J Exp Bot 61:12571265
14. National Academy of Sciences (NAS) (1979) Tropical legumes:
sources for the future. Washington, D. C., pp. 332
15. Bussmann RW, Tllez C, Glenn A (2009) Plukenetia huayllabambana sp. Nov. (Euphorbiaceae) from the upper Amazon of Peru.
Nord J Bot 27:313315
16. Gillespie LJ (2007) A revision of paleotropical Plukenetia
(Euphorbiaceae) including two new species from Madagascar.
Syst Bot 32:780802
17. Martnez-Romero MM, Castro-Ramrez AE, Fernndez JC (2004)
Use and availability of craft vines in the influence zone of the
biosphere reserve Sian Kaan, Quintana Roo. Mex Econ Bot
58:8397
18. Guilln MD, Ruiz A, Cabo N, Chirinos R, Pascual G (2003)
Characterization of Sacha inchi (Plukenetia volubilis L.) oil by
FTIR spectroscopy and 1H NMR. Comparison with linseed oil. J
Am Oil Chem Soc 80:755762
19. Hamaker BR, Valles C, Gilman R, Hardmeier RM, Clark D, Garcia
HH, Gonzales AE, Kohlstad I, Castro M, Valdivia R, Rodriguez T,
Lescano M (1992) Amino acid and fatty acid profiles of the Inca
peanut (Plukenetia volubilis). Cereal Chem 69:461463
20. do Prado IM, Guifrida WM, Alvarez VH, Cabral VF, Quispe-Condori
S, Saldaa MDA, Cardozo-Filho L (2011) Phase equilibrium

Plant Foods Hum Nutr (2012) 67:247255

21.

22.
23.

24.
25.

26.

27.
28.

29.

30.

measurements of Sacha inchi oil (Plukenetia volubilis) and CO2 at

high pressures. J Am Oil Chem Soc 88:12631269
Sathe SK, Hamaker BR, Sze-Tao KWC, Venkatachalam M (2002)
Isolation, purification, and biochemical characterization of a novel
water soluble protein from Inca peanut (Plukenetia volubilis L.). J
Agric Food Chem 50:49064908
Friedman M (1996) Nutritional value of proteins from different
food sources. A review. J Agric Food Chem 44:629
Sathe SK, Venkatachalam M, Sharma GM, Kshirsagar HH, Teuber
SS, Roux KH (2009) Solubilization and electrophoretic characterization of select edible nut seed proteins. J Agric Food Chem
57:78467856
Osborne TB (1924) The vegetable proteins, 2nd edn. Longmans,
Green and Co., London, p 154
Fling SP, Gregerson DS (1986) Peptide and protein molecular
weight determination by electrophoresis using a high-molarity tris
buffer system without urea. Anal Biochem 155:8388
Sharma GM, Irsigler A, Dhanarajan P, Ayuso R, Bardina L, Sampson
HA, Roux KH, Sathe SK (2011) Cloning and characterization of 2S
albumin, Car i 1, a major allergen in pecan. J Agric Food Chem
59:41304139
Official Methods of Analysis 16th ed (1995) Association of Official Analytical Chemists (AOAC): Arlington, VA
Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ (1951) Protein
measurement with Folin phenol reagent. J Biol Chem 193:265
275
Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of
protein dye binding. Anal Biochem 72:248254
Deshpande SS, Cheryan M, Salunkhe DK (1986) Tannin
analysis of food products. CRC Crit Rev Food Sci Nutr
24:401449

255
31. Ott L (1977) An introductuion to statistical methods and data
analysis. Duxbury Press (a division of Wadsworth Publishing
Co.), Belmont
32. Crowe TW, Johnson LA, Wang T (2001) Characterization of
extruded-expelled soybean flours. J Am Oil Chem Soc 78:775
779
33. Adsule RN, Kadam SS, Salunkhe DK (1989) Peanut. In: Salunkhe
DK, Kadam SS (eds) Handbook of world food legumes: nutritional
chemistry, processing technology, and utilization, Vol. II, pp. 193
214
34. Tokusoglu O, Unal MK, Alakir I (2004) Proximate chemical
composition, amino acid and fatty acid properties of sesame seed
flours. J Food Sci Technol (Mysore, India) 41:409412
35. Gmes-Vera N, Pea-Bautista RJ, Jimnez-Martnez C,
Dvila-Ortiz G, Caldern Dominguez G (2008) Effective detoxification and decoloration of Lupinus mutabilis seed derivatives, and
effect of thoese derivatives on bread quality and acceptance. J Sci
Food Agric 88:11351143
36. Kadam SS, Chougule BA, Salunkhe DK (1989) Lupine. In Handbook of World Food Legumes: Nutritional Chemistry, Processing
Technology, and Utilization, Salunkhe DK and Kadam SS (eds.),
Vol. II, 163175
37. Cabra V, Arreguin R, Vazques-Duhalt R, Farres A (2007) Effect of
alkaline deamidation on the structure, surface hydrophobicity, and
emulsifying properties of the Z19 -zein. J Agric Food Chem
55:435445
38. Zhao J, Tian Z, Chen L (2011) Effects of deamidation on aggregation and emulsifying properties of barley glutelin. Food Chem
128:10291036
39. Sathe SK, Salunkhe DK (1981) Solubilization and electrophoretic
characterization of the Great Northern bean (Phaseolus vulgaris L.)
proteins. J Food Sci 46:8287