1.

Introduo
A microbiologia uma cincia que visa no somente o estudo dos microrganismos, mas como
tambm de suas atividades. Denomina-se microrganismo as Bactrias, Fungos (bolores, leveduras e
orelha de pau), Vrus (limiar da vida), Algas e Protozorios. Reside tambm como rea de interesse ao
microbiologista o estudo da distribuio natural do microrganismo, suas relaes entre espcies, alm
de suas relaes com outros seres vivos, podendo causar efeitos benficos, indiferentes ou
prejudiciais, bem como s alteraes fsicas e qumicas que podem provocar ao meio ambiente.
Apresentando uma estrutura celular bastante simples, as bactrias diferem das clulas animais
e vegetais, pois elas tendem a no apresentam as mesmas
caractersticas, podendo assim apresentar diversas variaes em sua
forma, tamanho, virulncia, etc. Podem ser encontradas de maneira
isolada ou agrupadas em colnias (fig.01), sendo uma forma de vida
unicelular e procarionte, com muitas delas possuindo organelas de
locomoo, como flagelos e clios. Como s vezes necessitam se
manter vivas em ambientes inadequados sua condio at poderem
encontrar uma melhor condio de sobrevivncia, elas podem possuir

Figura 01 Colnia de
bactrias em placa de petri.

esporos (formaes que conferem resistncia s bactrias). As que

no possuem esporos so denominadas de vegetativas. Um dos motivos do estudo das bactrias por
que muitas delas so causadores de inmeras doenas, como ttano, febre tifoide, pneumonia, sfilis,
tuberculose, etc. A infeco pode ocorrer de diversas formas, como por exemplo, atravs do contato, do
ar, alimentos, gua, etc.
Uma tcnica de extrema importncia em microbiologia a assepsia e a esterilizao dos
meios, solues e dos materiais que se usam, sejam de vidro ou metal. Considera-se que um meio
est estreo quando o mesmo no contm nenhuma forma viva de
microrganismo. Uma das tcnicas que se pode usar para se obter a
esterilizao a autoclavao, que utiliza do aparelho (fig.02) para esterilizar
os objetos atravs do calor mido sob presso. J a assepsia o que se
denomina as condies, gestos e atitudes que servem para manterem o
estado de ausncia de microrganismos contaminantes no meio em que atua.
Figura 02 Autoclave.

Cultivo de bactrias feito nos denominados Meios de Cultura,

que so uma juno de substncias fornecedoras de nutrientes que sero

necessrias para que o microrganismo cresa fora de seu meio natural. J que os microrganismos
possuem uma variada diversidade metablica, necessria a existncia de igualmente variados tipos
de meios de cultura, para que possam satisfazer as diversas exigncias nutricionais. Mas s fornecer
nutrientes no o suficiente para manter o microrganismo vivo, havendo tambm a necessidade de
que o meio nutritivo oferea pH, presso osmtica, umidade, temperatura, atmosfera (aerbia,
microaerbia ou anaerbia), dentre outras caractersticas favorveis para a sobrevivncia da espcie.
Podem se classificar os meus de cultura quanto ao seu estado fsico, sendo eles slidos,
semisslidos e lquidos. Inicialmente, os nicos meios nutritivos existentes para cultivo de
microrganismos eram lquidos. Foi apenas em 1880 que Robert Koch (fig.03) e sua equipe introduziram
os meios de cultura slidos, os quais permitiram o estudo de espcies isoladas (culturas puras),

separando-as de espcies contaminantes. Quando contm agentes solidificantes, principalmente o

gar, denominado slido. J semisslidos so aqueles cuja quantidade de gar ou gelatina d
apenas uma consistncia intermediria, permitindo o crescimento de microrganismos em tenses
variadas de oxignio. Os lquidos, por sua vez, no apresentam em sua composio nenhum agente
solidificante, tendo a consistncia de caldo, muito utilizado para ativao das culturas, repiques de
microrganismos, provas bioqumicas, dentre outras anlises.

O que fornece as primeiras informaes para que um microrganismo seja identificado o seu
crescimento em diferentes meios, portanto uma etapa de extrema
importncia para a anlise de microrganismos. Para que os resultados
sejam satisfatrios e que no haja contaminao das amostras,
existem cuidados e procedimentos que se devem tomar nos mais
diversos casos: quando distribuir o meio antes de autoclavar, os tubos
no precisam estar esterilizados; quando distribuir o meio aps a
autoclavao, os tubos, frascos, placas, pipetas e vidrarias ou
materiais auxiliares obrigatoriamente devem ser estreis e os meios
devem ser autoclavados com as tampas semiabertas, para que a
Figura 03 Robert Koch.
esterilizao seja por igual em todo o contedo dos tubos - tampas
fechadas no permitem a entrada do vapor. Estes passos, se
seguidos corretamente e feitos com cuidado, iro garantir os melhores resultados possveis.

2. Objetivo
Se familiarizar e treinar na prtica as diversas tcnicas que englobam as analise de
microrganismos, como esterilizao, o preparo de meios de cultura, utilizao de manobras asspticas
para o manuseio de amostras com bactrias e seus respectivos procedimentos de inoculao, para
posteriormente observar o crescimento bacteriano.
3. Materiais e Reagentes
1. Agar nutritivo;
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

gua destilada;
Ala de inoculao;
Algodo;
Autoclave;
Barbante;
Bico de Bunsen;
Caldo nutritivo;

9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.

Cepa: Serratia marcescens;

Erlenmeyer;
Tubos de ensaio.
Estante para tubo de ensaio;
Jornal;
Lata de alumnio;
Luva;
Pra de suco;

17. Pina;

18. Pipeta graduada;

19. 4. Procedimentos
20.
21.

Para evitar acidentes laboratoriais, conseguir com xito uma cultura

pura e evitar possveis contaminaes dos meios de cultura com microrganismos

presentes no meio ambiente, utilizam-se de tcnicas de esterilizao e manobras
asspticas, que so indispensveis para a deteco de microrganismos. Para tanto,
seguiram-se as regras as seguintes regras de assepsia e segurana:

A ala de platina deve ser flambada antes e depois de qualquer operao de

inoculao. Para tanto, devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve
ser passada na chama de 2 a 3 vezes. A posio correta para a flambagem da ala

que a mesma faa um ngulo de 45 em relao mesa de trabalho.

Antes de retirar o material para a elaborao da inoculao deve-se esfriar a ala na
parede interna do tubo ou na tampa da placa de Petri, evitando a morte dos

microrganismos devido alta temperatura da ala aps esterilizao;

Para a inoculao em tubos de ensaio, deve-se flambar rapidamente a boca dos
mesmos logo aps a retirada do tampo de algodo (boneca). Este dever ser mantido
seguro pelo dedo mnimo da mo que est segurando a ala. Aps a retirada do
material com a ala, flambar novamente a boca do tubo e recolocar o tampo de

algodo. Flambar a ala aps o uso. No pousar os tampes sobre a bancada;

As pipetas utilizadas em Microbiologia so previamente embrulhadas em jornal e
esterilizadas. Para uso, torcer o papel na regio central da pipeta, retirar primeiramente
o papel na parte superior e depois a inferior (correspondente ponta da pipeta). Esta
sequncia evita que a pipeta seja contaminada pelas mos do operador. Uma vez
usada, a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba de vidro ou plstico, contendo

desinfetante;
As placas de Petri devero ser abertas prxima ao bico de Bunsen para evitar
contaminao com germes do ar. Uma vez inoculadas, as placas devem ser incubadas
em estufas com tampa voltada para baixo.
22.
23.

Para o cumprimento do objetivo proposto, foi necessria a realizao

de 02 prticas para alcanar o resultado final.

24.
25.
26.

4.1 Prtica I: Esterilizao

27.

Primeiramente, desinfetou-se a superfcie da bancada de trabalho com lcool

70% antes e aps o trabalho prtico;

Preparou-se uma rolha de algodo (tambm chamada de "boneca") que
tampasse completamente a boca do erlemeyer, para evitar que o interior deste
entrasse em contato com o ar externo;

Envolveu-se toda a parte superior do erlenmeyer com jornal, e amarrou-se com

um barbante. Ento, identificou-se apropriadamente, anotando no jornal o nome

do grupo e a data do experimento;

Vedou-se a parte superior das pipetas com algodo;
Envolveu-se as pipetas com jornal, amarrando com barbante e identificando o

lado da ponta, o nome do grupo, o volume da pipeta e a data do experimento;

Formou-se duas colunas com as placas, com 5 de cada lado, envolvendo-as a
seguir com jornal, identificando a parte superior, o nome do grupo e a data do

experimento;
Levou-se todas as vidrarias previamente vedadas e envolvidas no jornal para

autoclave;
Autoclavaram-se os materiais por aproximadamente 20 minutos;

28.
29.

4.2 Prtica II: Manobras Asspticas e Inoculao de Microrganismos

30.
31.

Com cuidado, acendeu-se o bico de Bunsen para dar incio as quatro

manobras asspticas que foram realizadas, atentando-se as regras de assepsia e

segurana dispostas acima.
I.

Manobra 01: Transferncia de caldo nutritivo estril para tubo vazio estril.
32.

Primeiramente, identificaram-se os tubos utilizados com: nome dos

responsveis, data do preparo, turma e numerao dos tubos (o tubo 1 continha caldo
nutritivo puro; o tubo 2 estava vazio; o tubo 3 continha o caldo nutritivo recebe a
bactria; o tubo 4 possui caldo nutritivo com gar, tornando-o slido). Em seguida,
ligou-se o bico de bnsen, de forma que se tivesse uma chama de cor azul (local de
maior taxa de energia). Ao redor da chama determina-se um rea chamada de zona
estril de segurana (por volta de 15cm). Utilizando uma das pipetas, e trabalhando
dentro da zona de proteo da chama, pipetou-se 2mL de cada um dos caldos
nutritivos para os tubos vazios. importante ressaltar que a parte superior dos tubos
devem ser flambados toda vez que os mesmos forem abertos e fechados. Em seguida
os tubos foram fechados e ambos colocados na estufa 36C por 48h para que
posteriormente pudesse ser observado o crescimento bacteriano.
33.

As pipetas aps serem utilizadas foram levadas uma soluo de

limpeza, a qual utilizada para preencher a pipeta repetidas vezes e depois deixada
de molho dentro da prpria soluo, onde posteriormente ser levada autoclavao e
lavagem.
34.
II.

Manobra 02: Inocular uma CEPA (Serratia marcescens) em um caldo nutritivo

estril.

35.

Primeiramente,

identificaram-se os tubos utilizados com: nome dos responsveis, data do preparo,

turma, nome do microrganismo utilizado: Serratia marcescens. Liga-se o bico de
bunsen e esquenta-se a ala de inoculao na chama para esterilizao (fig.05), at a
mesma atingir uma colorao avermelhada (rubra), seguindo tcnica adequada, como
descrito anteriormente. Com o bico de Bunsen ainda aceso e a ala estril, pde-se
dar incio a inoculao. Seguindo, aproximou-se o tubo com a CEPA da rea de
segurana do bico e com a ala estril, flambando-se a boca do tubo nota-se que
importante esperar a ala esfriar para no matar a colnia mergulhou-se a ala na
soluo. Em seguida, o tubo novamente flambado, tampa-se a CEPA e recoloca-se a
mesma na estante. Aproximou-se tubo contendo o meio de cultura, que fora flambado
quando aberto, mergulhando-se a ala com a CEPA no meio logo em seguida. Flambase novamente o tubo antes de fechar, o meio fora tampado e recolado na estante, e a
ala de inoculao fora esterilizada novamente.
36.
III.

Manobra 03: Inocular uma CEPA (Serratia marcescens) em um tubo contendo Agar
nutriente inclinado.
37.

Nesta manobra repetiram-se os procedimentos realizados na manobra

02, diferenciando-se somente no modo de inoculao. Para tanto, identificaram-se os

tubos utilizados com: nome dos responsveis, data do preparo, turma, nome do
microrganismo utilizado: Serratia marcescens. Liga-se o bico de bnsen e esquenta-se
a ala de inoculao na chama para esterilizao, at a mesma atingir uma colorao
avermelhada (rubra). Com o bico de Bunsen aceso e a ala estril, pde-se iniciar a
inoculao. Em seguida, aproxima-se o tubo com a CEPA rea de segurana do bico
de Bunsen e, com a ala de inoculao j estril, flamba-se a boca do tubo, mergulhase a ala na soluo, aps esperar aproximadamente 15 segundos para a mesma
resfriar, evitando matar a colnia de bactrias com o calor excessivo. A partir deste
ponto, flambou-se a boca do tubo novamente, tampou-se a CEPA e recolocou-se a
mesma na estante. Aproximou-se o tubo de ensaio contendo o meio de cultura de gar
nutriente inclinado, e com cuidado para no ferir o meio, passado a ala de
inoculao

na

superfcie

do

meio

com

movimentos a formar linhas sinuosas em zig-

Figura 05: Tcnica de inoculao

em meio lquido.

zag (fig.04). O meio tampado, recolocado na estante, a ala esterilizada

novamente. Os tubos so levados para estufa por 36C por 48h para posteriormente
observar-se o crescimento bacteriano.
38.
39. 5. Resultados e Discusso
40.
41.

Durante a realizao da primeira prtica (esterilizao) foram

abordados termos que so de grande importncia e que no devem ser confundidos,

como: desinfeco, esterilizao e limpeza. Antes de iniciar qualquer trabalho e aps o
seu trmino, assim como as mos do tcnico, a superfcie de todas as bancadas
devem ser desinfetadas. Este processo definido como eliminao ou destruio de
todos

os

vegetativa,

microrganismos
independente

na

forma

destes

serem

patognicos ou no pode ocorrer de

ocasionar a destruio de algumas bactrias
na forma esporulada, mas no se tem o
controle e a garantia desse resultado.

No

caso das vidrarias, as mesmas precisam

estar estreis, por isso so levadas ao
processo de autoclavagem neste aparelho
o aumento da presso permite a morte de
Figura 04: Tcnica de inoculao
com gar inclinado.

todo e qualquer tipo de organismo que

poderia

inclusive

esporos

de

estar

infectando

as

vidrarias,

bactrias, que so resistentes o suficiente para

sobreviver a 100C. Sabendo disso, pode-se prosseguir com os demais procedimentos

com a preocupao de contaminao reduzida.
42.

Os

procedimentos

da

segunda

prtica

foram

baseados

na

aprendizagem do preparo de meios de cultura. Os cultivos de bactrias exigem

diferentes fontes de nutrientes, os quais sempre devem ser acrescentados a
formulao dos meios destes microrganismo como, por exemplo, fonte de carbono,
fonte de energia, fonte de enxofre e fsforo, e, at mesmo, vitamina em caso de
microrganismos fastidiosos. Estes meios so a juno de substancias fornecedoras de
nutrientes para que o microrganismo cresa fora de seu habitat natural. Deve-se
considerar que os microrganismos possuem uma diversidade metablica muito grande,
tendo-se a necessidade de existir variados tipos de cultura, para que desta forma seja
possvel atender as exigncias nutricionais de todos os microrganismos. Para tanto,
atualmente observa-se a existncia de meios de cultura com sete funes diferentes:
meio seletivo, enriquecido, diferenciado, de dosagem, de contagem, de identificao e
estocagem. Os meios de cultura tambm podem ser classificados de acordo com o seu
estado fsico (vide introduo). Para tanto, criaram-se os meios: lquido e o meio com
gar (agente solidificante) inclinado. Todos os procedimentos foram feitos em

repetibilidade, pois, de acordo com a ISO 11.133, este um dos critrios essencias
para o controle de qualidade interno e, com documentao apropriada ir permitir o
monitoramento efetivo dos meios de cultura, o que contribui para a gerao de dados
precisos e exatos.
43.

Com as devidas esterilizaes e preparo dos meios de cultura, fez-se

possvel a terceira prtica manobras asspticas e inoculao de microrganismos.

Inicialmente, realizou-se a transferncia de caldo nutritivo estril para tubo vazio estril
como manobra 01 para que pudesse ser visualizado como efetivar o procedimento de
inoculao sem contaminar o meio. Tal objetivo fora atingido, pois aps 48 horas na
estufa 36C (temperatura tima para o crescimento da bactria), observou-se que
ambos os tubos de ensaio apresentaram aparncia lmpida, ou seja, no houve
crescimento de bactria em nenhum dos tubos, j que caso tivesse ocorrido o meio
apresentaria uma aparncia turva.
44.

Manobra 02: Inocular uma CEPA (Serratia marcescens) em um caldo nutritivo

estril.
45.

A inoculao em meio lquido um procedimento bastante indicado

pelo fato de possibilitar a rpida multiplicao de microrganismos, sendo um ensaio

qualitativo para o crescimento bacteriano. Com o auxlio de uma ala de inoculao
previamente flambada, realizou-se a inoculao da Serratia marcescens. Este gnero
de bactria gram-negativa e anaerbia facultativa que produz colnias com pigmento
avermelhado e circulares. Com base nestas informaes, conclui-se que o experimento
fora bem sucedido, j que os tubos inoculados apresentaram colorao vermelha aps
serem levados a estufa por 48 horas em uma temperatura de 36C. Tanto em
condies aerbias e anaerbias, o controle da temperatura importante para se obter
o

crescimento

dos

microrganismos

na

taxa

adequada.

Enquanto

muitos

microrganismos crescem em temperatura ambiente ou at mesmo em condies

extremas, outros tm a melhor taxa de crescimento a 37C e, assim, devem ser
mantidos em estufas com a temperatura regulada.
46.

Manobra 03: Inocular uma CEPA (Serratia marcescens) em um tubo contendo

Agar nutriente inclinado.
47.

Este procedimento, assim como o procedimento de inoculao em

meio lquido, pode ser utilizado como um ensaio qualitativo para o crescimento
bacteriano. Contudo, este tambm muito utilizado como meio de estocagem
quando se utiliza esta manobra para inoculao de um meio de estocagem evita-se a
adio de glicose e outros acares, pois desta forma seria fornecido aos
microrganismos uma das fontes de nutrientes, fazendo com que seu crescimento
continuasse, provocando alteraes na cultura. O cultivo contendo gar nutriente

inclinado mais indicado quando se deseja priorizar microrganismos aerbicos, pois

desta

forma

aumenta-se

superfcie

de

contato

com

ar, aumentando

consequentemente a rea oxigenada.

48. 6. Concluso
49.
50.

Aps o termino de todas as etapas do procedimento de anlise, e da

espera pelos resultados e a discusso feito sobre os mesmo, pode-se chegar

concluso que a prtica foi bem sucedida.
51.

No que tange a esterilizao e a familiarizao com esta tcnica, o

experimento foi devidamente cumprido e obteve resultados satisfatrios, j que foi

possvel no s observar a tcnica, mas tambm sua importncia. Podendo observarse, alm disso, a eficincia do mtodo de autoclavao, que foi o utilizado para a
prtica em questo.
52.

Conclui-se que para que se possa obter um resultado satisfatrio em

um experimento envolvendo microorganismos, necessrio evitar qualquer tipo de

contaminao do meio a ser analisado atravs da assepsia e autoclavagem.

53.
54.
55. 6. Referncia Bibliogrfica
56.
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57.
<http://www.portaleducacao.com.br/biologia/artigos/21224/o-que-e-microbiologia>

Acesso em 30/1/2015
58.
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Disponvel em: <http://www3.uma.pt/gcosta/docs/microbiology/prat1.pdf> - Acesso em
29/1/2015
59.
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60.

microrganismos. In: Departamento de Microbiologia. Disponvel em:

< http://www.icb.ufmg.br/mic/index.php?secao=material&material=42> - Acesso em

30/1/2015
61.
Equipe Toda Biologia. Bactrias. In: Toda Biologia. Disponvel em:
62. <http://www.todabiologia.com/microbiologia/bacterias.htm> - Acesso em 29/1/2015
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64.
< http://abrapaalimentos.com.br/documentos/simposio%209/Palestras/Palestra
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65.
NICSIO. Meios de Cultura. In: Biomedicina Brasil. Disponvel em:
66. <http://www.biomedicinabrasil.com/2010/09/meios-de-cultura.html> - Acesso em
30/1/2015
67.
68.
69.

70.
71. Disciplina: Microbiologia
72.
73.
74.

75. Manobras asspticas e

inoculao
76.
77. CAM 171
78. Professora: Danielle Bisaggio
79. Alunos: Igor Machado
80. Gabriella Santos
81. Luiz Feliphe Targino
82. Michelle de Oliveira
83. Raquel Ribeiro
84. Fernanda Ceclia
85.
86.
87.
88.
89.
90. Nilpolis, 5 de Fevereiro de 2015