Manual de Laboratorio

Manual del Laboratorio de Bioqumica
Jaime Andrs Pereaez Jimnez

Andrs Felipe Zapata Betancur
Francisco Pea Rivera
Maritza Fernndez Culma
Rafael Salamanca Flrez
Docentes Departamento de Farmacia
Universidad de Antioquia
Facultad de Qumica Farmacutica
Departamento de Farmacia
Primera edicin
Medelln, 2012
CONTENIDO
MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUMICA
UNIVERSIDAD DE ANTIOQUIA
FACULTAD DE QUMICA FARMACUTICA
DEPARTAMENTO DE FARMACIA
LABORATORIO DE BIOQUMICA Y TOXICOLOGA
5-324
INTRODUCCIN
OBSERVACIONES GENERALES
Normas de bioseguridad en el laboratorio
Reglamento interno del laboratorio
Normas para el trabajo en el laboratorio
Manejo y disposicin de los residuos
Equipo de proteccin personal (EPP)
Primeros auxilios
EQUIPOS DE LABORATORIO
PRCTICA # 1 Bases de datos y herramientas estadsticas
PRCTICA # 2 Espectrofotometra y curva de calibracin
PRCTICA # 3 Cuantificacin de protenas: mtodo de Bradford
PRCTICA # 4 Actividad enzimtica: Tirosinasa
PRCTICA # 5 Fosfatasa alcalina I
PRCTICA # 6 Fosfatasa alcalina II
PRCTICA # 7 Actividad enzimtica: Fosfolipasa A 2
PRCTICA # 8 Fermentacin alcohlica: Gluclisis anaerobia
PRCTICA # 9 Electroforesis de protenas en geles de poliacrilamida
Pg.
4
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5
5
5
6
7
8
10
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38
42
INTRODUCCIN
5-324
La Bioqumica es el estudio de la estructura, composicin y las reacciones qumicas de

las molculas en los organismos vivos. La Bioqumica emergi como una disciplina
separada cuando cientficos combinaron la biologa con la qumica orgnica, inorgnica
o la fisicoqumica, y comenzaron a estudiar como los organismos obtenan la energa a
partir de los alimentos, las bases qumicas de la herencia y los cambios fundamentales
que ocurren en la en los procesos de salud-enfermedad.
Este manual pretende brindar un acercamiento a diferentes tcnicas usadas para el
estudio de diversos procesos bioqumicos. En esta recopilacin, se hace especial
nfasis en los fundamentos prcticos relacionados con la enzimologa: actividad
enzimtica, influencia de diferentes factores fisicoqumicos sobre la misma, extraccin
de enzimas y productos de reaccin, cintica enzimtica e inhibicin enzimtica. Lo
anterior con el fin de brindar a los estudiantes de qumica farmacutica una visin
global sobre una de las disciplinas de la bioqumica ms usada para el desarrollo de
nuevos frmacos.
Asimismo, en este manual se presentan conceptos terico-prcticos sobre la
cuantificacin de protenas, metabolismo (gluclisis) y electroforesis como parte del
conjunto de tcnicas usadas para visualizar y separar protenas desde muestras
complejas.
OBSERVACIONES GENERALES
5-324
Normas de bioseguridad en el laboratorio

Las normas de seguridad en el laboratorio pretenden crear en los estudiantes una
conciencia de autocuidado y de cumplimientos a las normas internacionales y
nacionales frente al tema, velando por la integridad fsica de las personas en el
laboratorio y el correcto desarrollo de las prcticas acadmicas obteniendo un
resultado confiable y acorde a los procedimientos realizados.
Reglamento interno del laboratorio

El laboratorio es un sitio exclusivo de trabajo experimental, en l se aprende
observando y ensayando, y por tanto, se requiere un comportamiento responsable y
acorde a las normas para evitar perjuicios personales a s mismos, a los compaeros o
a la Institucin, porque su omisin o incumplimiento, puede ocasionarlos.
Normas para el trabajo en el laboratorio:

Los estudiantes deben ser puntuales y disponer adecuadamente de su tiempo,
para no trastornar las prcticas de los grupos siguientes. Es indispensable leer,
analizar y aclarar las dudas antes de comenzar su trabajo en el laboratorio.
Siempre deben usar bata blanca de manga larga con cierre y con bolsillos
internos, las gafas de seguridad, el respirador, los guantes y gorro (estos tres
ltimos para casos especficos y si se hace necesario). La bata debe permanecer
cerrada durante toda la prctica.
Los celulares se deben apagar o poner en modo silencioso o vibracin, con el
fin de no perturbar el desarrollo normal del laboratorio y las llamadas, si el
profesor lo permite, se deben contestar afuera del laboratorio.
El uso de audfonos al interior del laboratorio no est permitido, ya que
generan distraccin y pueden desencadenar accidentes.
Las gorras, cachuchas o vsceras se deben guardar en el morral o bolso.
El cabello, si es largo, se debe llevar recogido para evitar accidentes.
Se recomienda no portar reloj, anillos, cadenas, aretes o pulseras, los cuales
pueden generar accidentes o deteriorarse por accin de los reactivos o equipos
de trabajo.
Nunca colocar sobre las mesas de trabajo morrales, sacos y dems objetos
personales. No utilizar las mesas de trabajo como asientos.
Revisar el material asignado antes de iniciar la prctica, verificar si est
completo y en buen estado. Informar al tecnlogo o monitor cualquier
anomala.
TODO EL GRUPO ES RESPONSABLE DEL MATERIAL DE USO GENERAL.
Identificar y hacer uso correcto, si es necesario, del extintor de incendios y el
botiqun de primeros auxilios.
Se prohbe fumar e ingerir cualquier tipo de alimento dentro del laboratorio y
durante la prctica.
El laboratorio es un sitio de trabajo serio, donde las bromas y los juegos pueden
ocasionar graves accidentes. Se debe mantener el buen comportamiento y la
disciplina, y se debe manejar un tono de voz adecuado.
Durante la prctica mantener ORDEN Y LIMPIEZA en las mesas de trabajo, as
como en el sitio asignado para materiales y reactivos de uso general.
Al iniciar y finalizar una prctica, se deben lavar las manos con agua y jabn.
Antes de usar un reactivo o solucin leer las etiquetas e interpretar los
smbolos de seguridad. Evitar el contacto con los ojos, la piel y la ropa.
Utilizar adecuadamente pipetas, pipeteadores o esptulas asignadas para cada
uno de los reactivos o soluciones preparadas para evitar contaminaciones y por
ende la prdida total de los reactivos. LOS REACTIVOS Y/O SOLUCIONES NO SE
DEBEN RETIRAR DE LOS SITIOS ASIGNADOS, taparlos despus de su uso.
Manejar cuidadosamente los equipos siguiendo las instrucciones dadas por el
profesor, el tecnlogo o el monitor. No descuidar los equipos que se
encuentren en funcionamiento.
Rotular adecuadamente con nombre, cdigo del curso y fecha, los ensayos
realizados que requieren un seguimiento por varios das. Ubicarlos en el sitio
asignado dentro del laboratorio.
El laboratorio es un espacio para el aprendizaje, por lo cual no se permiten
visitas durante el tiempo de clase, los encuentros con los compaeros de
estudio se deben realizar en sitios y horas diferentes a los del laboratorio.
Por seguridad y cuidado personal se debe evitar al mximo trabajar solo en el
laboratorio, siempre se debe estar acompaado de otra persona.
Manejo y disposicin de los residuos

No se deben arrojar residuos slidos, papeles, servilletas por las pocetas, al piso o a
las mesas de trabajo, desecharlos en forma adecuada y en los recipientes asignados
para tal fin:
Color Caneca
Tipo de Residuo
Clasificacin
Gris
Papel, Cartn
Reciclable
Blanca
Vidrio limpio
Reciclable
Roja
Muestras y material
contaminado
Riesgo Qumico y Biolgico
Verde
Basura, servilletas, guantes

no contaminados
No Reciclable
Al finalizar la prctica y despus de disponer correctamente de los residuos, lavar el

material con precaucin, limpiar el sitio de trabajo y ubicar las butacas en el sitio
correspondiente, informar a la persona encargada para recibir el visto bueno de
entrega. LOS ESTUDIANTES NO SE DEBEN RETIRAR DEL LABORATORIO SIN HABER
REALIZADO CORRECTAMENTE LA ENTREGA.
En caso de prdida, ruptura de materiales o contaminacin de algn reactivo, los
estudiantes debern reportarlo en el formato especificado y retornarlo al laboratorio
en los 15 das siguientes. El material debe tener las mismas condiciones o
especificaciones del perdido y debe presentarse la factura correspondiente. La no
reposicin a tiempo de los elementos genera impedimentos para la prxima matricula.
Equipo de proteccin personal (EPP)

Proteccin ocular
Las gafas de seguridad deben ofrecer una buena proteccin frontal y lateral.
Son de uso permanente durante toda la prctica.
Proteccin de las manos
Para cada prctica se debe portar guantes protectores de laboratorio, los
cuales se utilizaran cuando sea necesario, ya sean de latex o de nitrilo
Proteccin de los pies
La proteccin de los pies est diseada para prevenir heridas producidas por
sustancias corrosivas, objetos pesados, descargas elctricas, as como para
evitar deslizamientos en suelos mojados, motivo por el cual debe ser un zapato
que cubra todo el pie. No se permiten chanclas, sandalias, etc. Adems se debe
utilizar ropa que cubra en su totalidad las piernas y que sea resistente, como lo
son jeans o pantalones, no se permiten minifaldas, shorts, etc.
Proteccin pulmonar
Las mascarillas individuales, deben contener el adsorbente adecuado al tipo de
sustancia que se va a manipular y se deben portar cuando sea necesario.
Ropa de proteccin
La bata de laboratorio est diseada para proteger la ropa y la piel de las
sustancias qumicas que pueden derramarse o producir salpicaduras. Es de
obligatorio uso.
Primeros auxilios
Quemaduras
Para la atencin de pequeas quemaduras producidas por material caliente,
como lo son los baos mara, las placas o mantas de calentamiento , etc. Se
debe efectuar primero un lavado con abundante agua fra en la zona afectada
durante 10-15 minutos. Luego del lavado se debe aplicar una crema o pomada
indicada para estas lesiones, como lo es la Sulfadiazina de Plata (Sulfaplata ) la
cual se encuentra en el botiqun de primeros auxilios del laboratorio.
Las quemaduras ms graves y que comprometan mucho tejido epitelial se debe
proceder con el lavado con agua fra sobre el tejido afectado y remitir
inmediatamente al servicio medico para recibir atencin especializada.
Cortes
Si durante el desarrollo de las practicas se presenta algn corte, este se debe
lavar inmediatamente con agua y jabn desinfectante y se debe cubrir con un
apsito indicado, si la hemorragia persiste se debe acudir inmediatamente al
servicio medico.
Derrame de productos qumicos sobre la piel
Los productos qumicos que se hallan vertido sobre la piel han de ser lavados
inmediatamente con agua corriente abundante, como mnimo durante 15
minutos. Las duchas de seguridad son usadas en aquellos casos en que la zona
afectada del cuerpo sea grande y no sea suficiente el lavado con un grifo. Se
debe retirar toda la ropa contaminada a la persona afectada lo antes posible
mientras est bajo la ducha. Recuerda que la rapidez en el lavado es muy
importante para reducir la gravedad y la extensin de la herida. No intentar
neutralizar y proporcionar asistencia mdica a la persona afectada.
Salpicaduras en ojos
En este caso el tiempo es esencial (menos de 10 segundos). Cuanto antes se
lave los ojos, menos grande ser el dao producido. Lava los ojos con agua
corriente abundante durante 15 minutos como mnimo. Para esto se debe
utilizar el lavaojos ubicado en la ducha de seguridad. Es necesario mantener los
ojos bien abiertos con la ayuda de los dedos para facilitar el lavado debajo de
los parpados y siempre se debe recibir asistencia mdica por pequea que sea
la lesin.
Incendios
Evacuar inmediatamente el laboratorio, por pequeo que sea el fuego, para
esto utilizar la salida principal o por la salida de emergencia si la principal est
bloqueada. Avisar a todos los compaeros de trabajo sin que se cree pnico y
conservando siempre la calma.
o Fuego leve
Si el fuego es pequeo y localizado, apagar utilizando extintor adecuado,
arena, o cubriendo el fuego con recipientes de tamao adecuado que lo
ahogue. Retirar los productos qumicos inflamables que estn cerca del
fuego. No utilice nunca agua para extinguir fuego provocado por
inflamacin con un disolvente.
o Fuegos alto
Aislar el fuego. Utilizar los extintores adecuados: el de CO2 para
incendios de gases (tipo A) y el de agua a presin con CO2 en solucin,
para slidos y lquidos.
Fuego corporal
Si se genera fuego sobre ti en tu ropa, pide ayuda inmediatamente, estrate
sobre el suelo y comienza a rodar sobre ti mismo, si el fuego continua la
persona que te este auxiliando te debe cubrir con una manta o cobija con el fin
de ahogar el fuego o trasladarte a la ducha de seguridad para extinguirlo con
agua y si se requiere se debe retirar su ropa, siempre y cuando no se encuentre
adherida a su piel, si es as utilizar una tijera y cortar la no adherida. No se debe
utilizar el extintor directamente sobre la persona y se debe acudir
inmediatamente al servicio medico.
EQUIPOS DE LABORATORIO
5-324
Bao Mara
Equipo utilizado para hacer calentamientos
indirectos de diferentes lquidos o solidos mediante la
transferencia de calor a travs de la conveccin trmica
del medio. El calentamiento se realiza de una forma
lenta y constante.
Para realizar el calentamiento en el bao mara el lquido o el solido se dispone en
un recipiente resistente al calor y se ubica al interior del equipo, de esta forma el agua
se calienta y poco a poco va transfiriendo el calor a la sustancia de inters. Antes de
comenzar a usar se debe verificar el nivel del agua.
Estufa de Secado
Se utiliza para secar el material utilizado en el
laboratorio ya sea de vidrio, plstico o acero inoxidable
entre otros. Tambin se puede utilizar para la
esterilizacin del vidrio o el metal de acuerdo con el
tiempo y el calor programado.
Existen diferentes tipos de estufas de secado (hornos de secado) de acuerdo con el
tipo de conveccin del calor, ya sea natural o forzada.
El calor utilizado por la estufa para realizar el secado y la esterilizacin se denomina
calor seco.
Tabla de temperatura / tiempo de esterilizacin por calor seco
TEMPERATURA C
180
170
160
TIEMPO (Minutos)
30
60
120
TEMPERATURA C
140
150
121
TIEMPO (Minutos)
150
180
360
http://www.medifesas.com/mdf/images/stories/documentos/metodos_de_esterilizar_el_instrumental.pdf
Espectrofotmetro
Consiste en un instrumento que nos permite
determinar la cantidad de radiacin absorbida o
trasmitida por un compuesto.
El espectrofotmetro nos permite realizar lecturas
de la radiacin absorbida o transmitida en la regin visible del espectro, la cual se
encuentra entre 400 y 750 nm de longitud de onda.
Cada compuesto posee una longitud de onda de mxima de absorbancia en la cual
se realiza la lectura para posterior determinacin de la concentracin.
Balanza Analtica
La balanza analtica es uno de los equipos ms
utilizados e importantes al interior de un laboratorio
tanto de anlisis como de investigacin. De esta
depende la correcta medida de muchas de las
sustancias a trabajar lo cual permite tener resultados
ms exactos y confiables.
Estas balanzas poseen caractersticas de precisin y
exactitud, por lo cual su manipulacin requiere mucho
cuidado y limpieza, garantizando as la conservacin de
sus partes un buen estado y mejor funcionamiento.
El correcto funcionamiento de las balanzas tambin depende de los factores
ambientales y ubicacin al interior del laboratorio, motivo por el cual deben estar en
un lugar exclusivo de pesado donde incidan en lo menos posibles factores como
corrientes de aire, rayos del sol o dems perturbaciones.
pH-Metro
Equipo que permite realizar la determinacin del
diferencial del potencial elctrico en una disolucin, el
mtodo se basa en la corriente elctrica generada
entre dos disoluciones con diferente potencial.
Para realizar la lectura de este diferencial se utiliza un electrodo, el cual al ser
sumergido en una disolucin establece un potencial elctrico a travs de la membrana
de vidrio, el cual es comparado con el potencial invariable del electrodo de referencia y
puede estar al interior del electrodo o estar ubicado externamente.
El electrodo al ser un elemento de vidrio y tan delicado, requiere que sea
manipulado con mucho cuidado y cada vez que se usa debe de ser enjuagado con
abundante agua destilada o desionizada, adems debe de conservarse de manera

permanente y mientras no este en uso en una solucin de KCl.
Plancha de agitacin con calentamiento

Este equipo posee un imn central fijo el cual es el
encargado de hacer girar un barra magntica que
depositamos en las disoluciones, al producirse la
repulsin de cargas el magneto gira brindando as una
agitacin constante a la disolucin.
Este equipo es de gran ayuda el momento de
preparar disoluciones con sustancias poco solubles en el solvente utilizado y adems
nos brinda la posibilidad de calentamiento con lo podemos acelerar el proceso de
disolucin en muchos casos.
Tambin se puede utilizar sin agitacin y solamente utilizando el calentamiento,
pues posee controles independientes para estas funciones.
Cabina de Extraccin de gases

La cabina de extraccin de gases nos permite
trabajar al interior del laboratorio de forma segura al
momento de manipular sustancias toxicas voltiles,
minimizando el contacto del personal del laboratorio
con estos vapores y una menor contaminacin al
medio. Adems de la proteccin contra los vapores y
humo, la cabina tambin ofrece proteccin frente a derrames y posibles explosiones.
El funcionamiento de esta se basa en la extraccin de los vapores generados en el
rea de trabajo, los cuales van por conductos hacia el exterior luego de pasar por un
filtro que minimiza la contaminacin del medio ambiente.
Centrifuga
La centrifuga es un equipo que nos permite separar
lquidos o solidos de lquidos, mediante la diferencia de
densidades. La mezcla es introducida a la centrifuga en
tubos de ensayo y es sometido a una fuerza rotativa, la
cual genera que el liquido de mayor densidad o el
solido se precipite hacia el fondo del tubo de ensayo.
Agitador tipo vrtex
Se usa para agitar lquidos dispuestos en tubos de

ensayo o frascos pequeos. Mediante un motor se
genera un movimiento circular de una pieza de goma
que posteriormente trasmite el movimiento al
recipiente que contiene el lquido y finalmente se
forma un vrtice. La mayora de agitadores tipo vrtex tienen la posibilidad de
considerar diferentes configuraciones, entre ellas la de funcionar solo cuando una
dbil presin se aplica sobre la pieza de goma.
PRCTICA # 1 BASES DE DATOS Y HERRAMIENTAS

ESTADSTICAS
5-324
El uso de las bases de datos en el mundo acadmico es ms comn da a da, sin

embargo muchos estudiantes no tienen xito en sus bsquedas, ya sea por
desconocimiento de los buscadores o por imprecisin en las palabras claves utilizadas.
En esta prctica se darn conceptos bsicos sobre el uso de las bases datos a las que
nuestra biblioteca tiene acceso.
Science Direct
Springer
Pubmed
EBSCO
Y otras ms.
Como ingresar a las bases de datos de la Universidad de Antioquia
Ingresar al sistema de bibliotecas y solicitar contrasea
Ingresar a las diferentes bases de datos
Seleccionar la base de datos requerida y realizar la bsqueda
La estadstica es una herramienta valiosa que debe ser aprovechada por personas que
trabajan en diferentes areas. En ciencias biolgicas la estadstica nos ayuda a
establecer diferencias entre tratamientos, concentraciones, tiempos, ensayos,
estndar y muestras, entre otras. Adicionalmente sta ciencia es de gran apoyo al
momento de discutir los resultados obtenidos experimentalmente, sin embargo
muchas personas no conocen los anlisis que deben ser realizados a sus datos y mucho
menos la interpretacin de los mismos. Por esta razn en esta prctica se darn
nociones del uso de Excel en algunos anlisis estadsticos simples, asi como la
interpretacin de los mismos.
PRCTICA # 2 ESPECTROFOTOMETRA Y CURVA DE

CALIBRACIN
5-324
Objetivos
Conocer los aspectos bsicos de la tcnica instrumental espectrofotometra.
Elaborar una curva de calibracin de un compuesto coloreado (Paranitrofenol
(PNP) o Azul de metileno).
Determinar la concentracin de una muestra problema a partir de la curva de
calibracin.
Aspectos Tericos
La espectrofotometra es una tcnica til para hallar concentraciones de diferentes
muestras y para seguir el curso de una reaccin. El mtodo se basa en la medicin de
la intensidad de la luz absorbida (A) o transmitida (T) por una solucin coloreada, que
puede ser de uno o varios compuestos. La absorcin mxima de energa ocurre a una
longitud de onda ( ) especfica para cada molcula. La intensidad de la energa
absorbida (absorbancia) es directamente proporcional a la concentracin del
compuesto en una solucin.
Radiacin electromagntica y absorbancia de la luz

La radiacin electromagntica es una clase de energa que se transmite por el
espacio a enormes velocidades. Adopta muchas formas, siendo la ms fcilmente
reconocible la luz. Otras manifestaciones menos evidentes son la radiacin gamma, los
rayos X, el ultravioleta (UV), el microondas y la radiofrecuencia. La radiacin
electromagntica viaja en forma de ondas, con una longitud de onda especfica ( )
(distancia entre puntos consecutivos de una onda). Otra propiedad importante de las
ondas es la frecuencia ( ), definida como nmero de oscilaciones por unidad de
tiempo. La frecuencia tambin es importante para definir la energa de la onda, ya que
como se muestra en la ecuacin E= h , siendo h la constante de Plank (= 6.62 10 -34
Joule x segundo), la frecuencia es directamente proporcional a la energa de la onda. El
espectro electromagntico entonces, est constituido por ondas electromagnticas de
diferente frecuencia. Una regin del espectro electromagntico es la visible, entre
~400~800 nm. Cualquier energa producida en esta estrecha banda producir la
sensacin de visin cuando estimula el ojo humano normal. As, radiaciones entre
~400~420 producirn color violeta y radiaciones entre ~570~585 producirn color

amarillo.
Absorbancia y ley de Beer

Cuando una molcula absorbe radiacin visible, sus electrones se excitan y pasan a
un nivel de energa mayor, sin embargo los electrones tambin pueden caer a niveles
de menor energa y pueden emitir radiacin electromagntica. Cuando un haz de luz
incide sobre un cuerpo traslcido (ej. una solucin), una parte de esta luz es absorbida
por el cuerpo, y el haz de luz restante atraviesa dicho cuerpo. La absorbancia es la
cantidad de luz absorbida, mientras que la transmitancia es la cantidad de luz que
logra pasar el cuerpo. A mayor cantidad de luz absorbida, mayor ser la absorbancia
del cuerpo, y menor cantidad de luz ser transmitida por dicho cuerpo.
Por su parte, la ley de Beer, establece que la absorbancia est relacionada
linealmente con la concentracin de la especie absorbente y con la longitud de la
trayectoria de la radiacin en el medio absorbente. Adicionalmente, esta ley involucra
la absortividad molar (), la cual es una constante para cada especie que absorba
energa en la regin visible. Finalmente la ecuacin de la ley de Beer es: A = bc,
donde () es el coeficiente de extincin molar, b es la longitud de paso del haz de luz
por la muestra y c es la concentracin. Se puede notar en la ecuacin que la
absorbancia esta directamente relacionada con la concentracin de la especie
problema.
Materiales:
Espectrofotmetro
Celdas para el Espectrofotmetro
Tubos de ensayo
Vaso de precipitados
Frasco lavador
Reactivos:
Solucin de Paranitrofenol (139.1088 g/mol) 1 x10-4 Molar o Azul de metileno
319.85 g/mol) 4.01 x 10-5 Molar
Solucin acuosa NaCl 0.9% (Si se trabaja con PNP)
Agua destilada o desionizada
Seccin Experimental
Manejo del Espectrofotmetro.
Antes de empezar a tomar lecturas en el instrumento, este debe calibrarse siguiendo
las siguientes indicaciones o remitirse al manual del equipo:
o Seleccione la longitud de onda deseada (PNP 410 nm Azul de Metileno

665 nm)
o Introducir la celda que contiene la solucin blanco, la cual se prepara
mezclando 3ml de solucin salina o agua.
o Calibrar el 0 de Absorbancia / 100% de transmitancia.
o Retirar la celda que contiene la solucin blanco.
o Realizar las lecturas correspondientes.
Curva de calibracin para soluciones coloreadas.
o Rotule 7 tubos de ensayo y prepare las soluciones indicadas en la siguiente
tabla mediante diluciones dobles sucesivas.
TUBO
Dilucin
Solucin
Patrn (ml)
Cantidad de
solucin
anterior (ml)
Solucin salina
(ml)
Concentracin
(mol/l)
Absorbancia
obtenida
BLANCO
0
1
1/1
2
1/2
3
1/4
4
1/8
5
1/16
6
1/32
7
1/64
o Grafique los resultados de absorbancia y concentracin tabulados y

obtenga la ecuacin de la lnea recta mediante el uso de los conceptos
bsicos de estadstica que le fueron ensaados en la prctica anterior.
o Obtenga el valor de concentracin de su muestra problema, utilizando la
ecuacin antes encontrada.
Residuos
Todos los desechos se adicionan a residuos orgnicos NO clorados.
Preguntas
Qu es una curva de calibracin?
Qu caractersticas debe cumplir?
Se puede construir una curva de calibracin con sustancias no coloreadas?
Por qu razn se eligi una sola longitud de onda para hacer todas las
mediciones de la curva de absorcin?
Qu significado tiene la pendiente de la grfica?
Que son las desviaciones de la ley de Beer y cules son sus principales causas?
Bibliografa
Schmid, F.-X. Biological Macromolecules: UV-visible Spectrophotometry.
Encyclopedia of Life Sciences. Macmillan Publishers Ltd, Nature Publishing
Group. 2001.
PRCTICA # 3 CUANTIFICACIN DE PROTENAS: MTODO

DE BRADFORD
5-324
Objetivo
Determinar la concentracin de protenas de una muestra desconocida a partir de
una curva de calibracin de albmina, usando el mtodo de Bradford.
Aspectos Tericos
El mtodo de Bradford est basado en la unin del colorante Azul de Coomassie
G250 a las protenas. Estudios han indicado que el colorante puede existir en cuatro
formas inicas pKa 1.15, 1.82, y 12.4. La forma ms aninica es la azul, la cual se une a
la protena y tiene un mximo de absorbancia a 590nm. Por lo tanto, la cantidad de
protena puede ser estimada al determinar la cantidad de colorante en la forma azul.
Esto usualmente se obtiene al medir la absorbancia de la solucin a 595 nm.
Materiales
Espectrofotmetro.
Celdas para espectrofotmetro.
Agitador.
Micropipeta 1001000 l.
Reactivos
Solucin acuosa de buffer fosfatos (PBS) pH: 7.2, 0.1M.
Solucin de Albumina 1 mg/ml.
Suero Fetal Bovino 1/20.
Reactivo de Bradford.
o Azul de Coomasie.
o Etanol.
o cido Ortofosfrico.
Seccin experimental
Realice la siguiente curva de calibracin mediante diluciones dobles sucesivas:
Patrn: Albmina (BSA) 1mg/ml = 1g/1L.
Diluyente: Solucin buffer fosfatos (PBS) pH: 7.2, 0.1M.
Tubo
Dilucin (v/v)
Concentracin (g/100L)
1
1/1
100
2
1/2
50
3
1/4
25
4
1/8
12.5
5
1/16
6.25
6
1/32
3.12
7
1/64
1.56
Prepare una serie tubos en los cuales depositar 200 L de cada una de las
diluciones preparadas, posteriormente adicione 3 ml del reactivo Azul de
Coomasie, deje en reposo por 5 min en la oscuridad y lea Absorbancia a 595
nm contra un blanco correctamente preparado.
Utilizar anlisis de regresin lineal simple para el anlisis de los datos.
Para determinar la concentracin de una muestra problema, adicionar a 100 L
de sta 3 ml de Azul de Coomasie, y proceda interpolando en la recta de
calibracin y haciendo los ajustes a que hubiere lugar.
Preguntas
Cul es la base del mtodo?
Cules son las interferencias del mtodo?
Investigue otros mtodos de cuantificacin de protenas?
Bibliografa
Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt.
Biochem. 1976; 72: 248-254.
Spector, T. Refinement of the Coomassie Blue method of protein quantitation.
A simple and linear spectrophotometric assay for <0.5 to 50 g of protein.
Analyt. Biochem. 1978; 86: 142-146.
PRCTICA # 4 ACTIVIDAD ENZIMTICA: TIROSINASA

5-324
Objetivo
Determinar la actividad enzimtica de la tirosinasa y la influencia de diferentes
factores fisicoqumicos sobre la misma.
Aspectos Tericos
Actividad enzimtica e influencia de factores fisicoqumicos sobre esta
Las enzimas son los catalizadores de los sistemas biolgicos, son altamente
especficas y se recuperan al final de cada ciclo de reaccin. En general son de carcter
proteico pero tambin se conocen algunos RNAs con propiedades catalticas. Estos
catalizadores tienen parmetros enzimticos como Km y Vmax, sin embargo estos
varan de acuerdo al sustrato y la concentracin de enzima. La forma ms adecuada de
cuantificar la actividad enzimtica es medir la cantidad de producto que se forma por
unidad de tiempo. Sin embargo, tal actividad se ve influenciada por el pH y la
temperatura del microambiente donde ocurre la reaccin, la concentracin de
sustrato y coenzimas o cofactores, entre otras.
Todas las enzimas tienen condiciones ptimas de catlisis, es decir un pH, temperatura
y fuerza inica del medio a las cuales la enzima cataliza la reaccin de la forma ms
eficiente posible. Sin embargo, los cambios de pH en el ambiente donde ocurre la
reaccin pueden provocar que las cadenas laterales de los aminocidos del sitio activo
se protonen o desprotonen lo que provocara una perdida en la capacidad de la enzima
para llevar a cabo la reaccin.
De igual forma cambios en la temperatura y la fuerza inica del medio, provocan
cambios conformacionales en la enzima que finalmente conducen a disminucin en la
eficiencia cataltica.
Tirosinasa y pardeamiento enzimtico

El oscurecimiento de algunas frutas y verduras (banano, pera, manzana, papa),
despus de que son expuestas al medio ambiente, se conoce como pardeamiento
enzimtico. Este proceso es llevado a cabo por la Tirosinasa, (o-difenol O2
oxidorreductasa E.C. 1.14.18.1.). Esta metal-enzima es la que est en el interior de las
frutas antes mencionadas y como la reaccin requiere de oxgeno molecular, la

pigmentacin, no ocurre si la parte interior de estas frutas no est expuesta al aire. La
reaccin catalizada por la enzima se muestra en la figura 1, esta reaccin conduce a la
formacin de un pigmento color caf, conocido como melanina, el cual se produce tras
oxidacin de la tirosina y posterior polimerizacin de los productos de reaccin.
Figura 1. Reaccin catalizada por la Tirosinasa

COOH
COOH
HO
O2
NH2
HO
NH2
Enz
NH2
Enz
O
HO
Tirosina
Dopa quinona
DOPA
HO
O
HO
COOH
O2
COOH
HO
COOH
NH
CO2
NH
NH
HO
Dopa crome, 420 nm

O
O
N
O
NH
O
O
O
Melanina
En el desarrollo de esta prctica se pretende extraer la enzima tirosinasa de la papa

y hacerla reaccionar con el sustrato L-metildopa, hasta convertirlo en el compuesto Lmetildopacromo, que es de color caf; la aparicin de este se puede seguir
espectrofotomtricamente a una de 420nm, que es donde se presenta su mxima
absorcin.
Reactivos y Equipos
Solucin buffer glicina 0.05 M pH 10.4.
Solucin buffer fosfato 0.1 M pH 7.2.
Solucin buffer fosfato 0.1 M pH 6.0.
Solucin buffer citrato pH 3.
Solucin DOPA 0.03 M (en buffer fosfato de pH 6.0).
Papas.
Arena de mar.
Lienzo o pauelo limpio.
Mortero.
Espectrofotmetro.
Hielo picado.
Seccin Experimental
Extraccin de la enzima.
Coloque 10 g de la papa en el mortero pre-enfriado y adicione 10 ml de buffer
de fosfato 0.1M (pH=7.2).
Adicione unos pocos gramos de arena de mar a la mezcla anterior y triture
hasta que no haya fruta solida.
Filtre utilizando un pao y centrifugue el filtrado durante 10 minutos a 3500
RPM.
La solucin sobrenadante se decanta y se coloca en un bao de hielo.
Diluya la solucin sobrenadante 1/10 con buffer pH=7.2 hasta completar 20 ml.
Rotule esta solucin como extracto enzimtico.
Medida de la actividad enzimtica.
Mezcle en un tubo de ensayo:
o 1ml de extracto enzimtico.
o 3 ml de buffer pH=7.2.
o 1 ml de solucin de L-metildopa.
Prepare un blanco de reactivos.
Calibrar el espectrofotmetro a = 420 nm.
Inmediatamente despus de agregar el sustrato (L-metildopa), agite, colquelo
en el espectrofotmetro y lea la absorbancia; tome esta lectura como tiempo
cero.
Registre las Absorbancias registradas en el espectrofotmetro cada 20
segundos durante 3 minutos.
Calcule la actividad enzimtica de la pendiente de la grfica Absorbancia vs
tiempo.
Influencia de la concentracin de enzima sobre la actividad enzimtica.

o 2 ml de extracto enzimtico (otros grupos pueden hacerlo con 1.5, 2.5
ml de extracto enzimtico).
o 2 ml de buffer pH=7.2.
Prepare un blanco de reactivos de acuerdo a la cantidad de extracto enzimtico
utilizado.
Calibrar el espectrofotmetro a =420 nm.
cero.
segundos durante 3 minutos. (Tabla 1)

tiempo.
Compartir los resultados y compararlos con los obtenidos en el punto anterior.
Tabla 1: Influencia de la concentracin de enzima sobre la actividad enzimtica
Mililitros de extracto enzimtico

Absorbancia
1.0
1.5
2.0
2.5
Tiempo (seg) tubo

0.0
20
40
60
80
100
120
150
180
Nota: Los datos de 1.0 ml debe tomarlos del ensayo de Medida de la actividad
enzimtica.
Influencia del pH sobre la actividad enzimtica.

Mezcle en un tubo de ensayo}:
o 3 ml de buffer pH 3 (otros grupos lo pueden hacer con buffer pH 10)
cero.
segundos durante 3 minutos (Tabla 2).
tiempo.
Compartir los resultados y compararlos con los obtenidos en el punto de
Tabla 2: Influencia del pH sobre la actividad enzimtica
pH
Absorbancia
3.0
7.2
10.0
Tiempo(seg)tubo
0.0
20
40
60
80
100
120
150
180
Nota: Los datos de pH 7.2 debe tomarlos del ensayo de Medida de la actividad
enzimtica.
Influencia de la temperatura sobre la actividad enzimtica.

o 3 ml de buffer pH= 7.2.
Introduzca el tubo en un bao mara a 37 0C durante 5 minutos. Otros grupos lo
pueden hacer incubando a 2C en un bao de hielo.
Sin dejar enfriar el tubo de reaccin, agregar el sustrato (L-metildopa), agite,
colquelo en el espectrofotmetro y lea la absorbancia; tome esta lectura
como tiempo cero.
segundos durante 3 minutos (Tabla 3).
tiempo.
Compartir los resultados y compararlos con los obtenidos en el punto de
Tabla 3: Influencia de la temperatura sobre la actividad enzimtica
Absorbancia
Tiempo(seg)tubo
0.0
20
40
2C
25C
37C
60
80
100
120
150
180
Nota: Los datos de 25C debe tomarlos del ensayo de Medida de la actividad
enzimtica.
Se recomienda a los docentes que todos los estudiantes realicen la extraccin de la

enzima, pero que los ensayos de influencia de concentracin de enzima, pH y
temperatura sean realizados por diferentes grupos. Al final de la prctica los datos
deben ser compartidos.
Preguntas
La enzima acta mejor a pH cido, bsico o neutro?
Explique cmo afecta la concentracin de enzima la actividad enzimtica.
La enzima acta mejor a temperaturas bajas, ambiente o fisiolgicas?
Documntese sobre el mecanismo cataltico de la tirosinasa y responda lo
siguiente: Como pueden los pH cidos y bsicos influenciar sobre la actividad
enzimtica?
Bibliografa
Decker H, Dillinger R, Tuczek F. How Does Tyrosinase Work? Recent Insights
from Model Chemistry and Structural Biology . Angew. Chem. Int. Ed. 2000;
39: 1591-1595.
PRCTICA # 5 FOSFATASA ALCALINA I

5-324
Objetivo
Comprender la reaccin bsica de las fosfatasas.
Construir una curva de calibracin con el producto de la reaccin, la cual ser
usada para calcular la cantidad de producto liberado despus de la catlisis.
Aspectos Tericos
Generalidades y principio del mtodo
La fosfatasa alcalina (E.C. 3.1.3.1.) hidroliza los fosfosteres, liberando el fosfato
inorgnico.
RCOOP + H2O
RCOO- + Pi
Ejerce su accin a pH elevado, del orden de 10. La presencia de iones Zn 2+ es

necesaria para su actividad, mientras que el fosfato la inhibe.
La especificidad de la enzima por R es dbil (estructuralmente es posible variar R
conservando la actividad enzimtica) y R puede ser un radical alqulico o fenlico. R-OH
puede ser un alcohol primario o secundario, un fenol o un alcohol cclico. El sustrato
que usaremos en este ensayo ser el p-Nitrofenilfosfato. (PNPP).
OPO3--
OH
H2O
Enz
--
NO2
HPO3
NO2
PNPP
PNP
Este sustrato es incoloro pero por hidrlisis se libera el p-Nitrofenol (PNP), que es
amarillo y absorbe a
= 410 nm, lo cual posibilita seguirlo
espectrofotometricamente. Este es el principio fundamental de esta prctica.
En resumen:
Si por accin de la enzima se produce el p-nitrofenol, precisamos de un mtodo que
nos permita cuantificar sta sustancia, para as calcular la velocidad de la reaccin
medida por la enzima. Para ello debemos hacer una curva de calibracin.
Reactivos
Buffer de glicina 0.05 M, pH 10.4.
Solucin fosfato disdico 0.5 M.
Solucin de p-Nitrofenol (PNP) 10-4M. (Para esta solucin y las disoluciones
sucesivas, utilice el buffer de Glicina como solvente).
Solucin acuosa de ZnCl2 6 10-4M.
Solucin enzimtica: Suero sanguneo diluido 1/2 con buffer de glicina.
Solucin acuosa de p-Nitrofenilfosfato (PNPP) 5 10-3M.
Solucin acuosa de Na2HPO4 5.0 10-3M.
Seccin experimental
Construccin de la curva de calibracin con el producto de la reaccin.
Prepare una serie de tubos con las diluciones indicadas de PNP.
Utilicen como solucin diluyente el buffer de Glicina.
Luego de haber realizado las diluciones adicione 1 ml de la solucin de Fosfato
0.5 M y 0.5 ml de la solucin de ZnCl 2 6 10-4 M a cada uno de los tubos.
Prepare un blanco para este experimento.
Seleccione una longitud de onda de 410 nm en el espectrofotmetro y realice
las lecturas.
Registre las absorbancias obtenidas.
Tubo
Dilucin PNP 10-4M
Volumen final 2 ml
Fosfato de sodio 0.5M
Sln de ZnCl2 6 10-4M
Absorbancia
Concentracin PNP
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
1
0.5
1
0.5
1
0.5
1
0.5
1
0.5
Blanco
2 ml
Glicina
1
0.5
Calcule la concentracin de PNP en cada una de las diluciones.

Realice el grfico de Absorbancia en funcin de la concentracin de PNP.
Exprese la concentracin en mol/l.
Nota:
En todos los ensayos enzimticos, es fundamental que el material de vidrio este

limpio.
Donde se dice agua, debe usarse destilada y/o desionizada.
Todas las mediciones de volmenes deben ser exactas.
Bibliografa
Bessey O, Lowry O, Brock MJ. A method for the rapid determination of alkaline
phosphatase with five cubic millimeters of serum. J. Biol. Chem. 1946; 164: 321329.
PRCTICA # 6 FOSFATASA ALCALINA II

5-324
Objetivo
Calcular los parmetros cinticos de la fosfatasa alcalina mediante el uso de un
sustrato sinttico y el seguimiento espectrofotomtrico de la aparicin del
producto de la reaccin.
Determinar el tipo de inhibicin del fosfato sobre la actividad enzimtica de la
fosfatasa alcalina.
Seccin experimental
Influencia de la concentracin de sustrato sobre la velocidad de una reaccin
enzimtica: Determinacin de parmetros cinticos Km y Vm.
Prepare una serie de tubos con las diluciones indicadas de PNPP.
Utilicen como solucin diluyente el buffer de Glicina.
Luego de haber realizado las diluciones adicione 0.5 ml de la solucin de ZnCl 2
6 10-4 M a cada uno de los tubos.
Tubo
PNPP Volumen
final 2 ml
Sln. ZnCl2 6 10-4M
(ml)
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Blanco
2 ml
Glicina
0.5
Absorbancia
Prepare un blanco para este experimento.

Deje en reposo durante 5 minutos.
Incubar los tubos a 37C por 5 minutos, el suero fetal 1/2 tambin de de
calentarse bajo las mismas condiciones.
Adicionar 0.5 mL de la solucin enzimtica (Suero Fetal Bovino) a cada tubo de
ensayo.
Garantizar que cada tubo reaccione con la solucin enzimtica exactamente 15
minutos a 37 C.
Luego de los 15 minutos detener la reaccin con 1 mL Na 2HPO4 0.5 M.
Registrar las absorbancias a 410 nm.

Determine la cantidad de PNP producido interpolando las absorbancias en la
curva de calibracin obtenida en la prctica anterior.
Construya y complete la siguiente tabla
[PNPP]
Absorbancia [PNP]
V0 = [PNP]/min
1/[PNPP]
1/V0
Grafique los inversos 1/[PNPP] y 1/V0 determine Km y Vm
Determinacin del tipo de inhibicin.

Preparar en 5 tubos numerados del 1 al 5 y un blanco, las siguientes mezclas:
Tubo
PNPP Volumen
final 2 ml
Inhib.0.5 10-2M
Sln. ZnCl2
1/1
1/2
1/4
1/8
1/16
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Blanco
2 ml
glicina
0.5
0.5
Dejar en reposo durante 15 minutos.

Incubar los tubos a 37C por 5 minutos, el suero fetal tambin de de calentarse
bajo las mismas condiciones.
Luego adicionar 0.5 ml de la solucin enzimtica.
Garantizar que cada tubo reaccione exactamente 15 minutos a 37 C.
Luego de los 15 minutos detener la reaccin adicionando 1 ml de a cada tubo
Na2HPO4 0.5 M.
Seleccione una longitud de onda de 410 nm en el espectrofotmetro y realice
las lecturas.
Determine la cantidad de PNP producido interpolando las absorbancias en la
curva de calibracin obtenida en la prctica anterior.
Construir la misma tabla que utiliz para determinar los parmetros
enzimticos, Km y Vm, y ahora calclelos en presencia del inhibidor.
Determinar el tipo de inhibicin.
Preguntas
Cul es la importancia clnica de la fosfatasa alcalina?
En este caso, se puede considerar el fosfato como un inhibidor por producto?
Sera posible revertir la inhibicin provocada por el fosfato aumentando la
concentracin de PNPP?
Nota:
En todos los ensayos enzimticos, es fundamental que el material de vidrio este
limpio.
Donde se dice agua, debe usarse destilada y/o desionizada.
Todas las mediciones de volmenes deben ser exactas.
Bibliografa
Trentham DR, Gutfreund H. The kinetics of the reaction of nitrophenyl phosphates
with alkaline phosphatase from Escherichia coli. Biochem J. 1968; 106: 455-460.
PRCTICA # 7 ACTIVIDAD ENZIMTICA: FOSFOLIPASA A2

5-324
Objetivos
Cuantificar la actividad de una enzima que actua en una interfase lpido:agua.
Utilizar la tcnica de extraccin lquido:lquido para separar uno de los
productos de la reaccin.
Aspectos Tericos
Las fosfolipasas A2 (Phospholipase A2, PLA2) forman una superfamilia que
actualmente cuenta con 15 grupos a su vez divididos en numerosos subgrupos. Estas
enzimas se caracterizan por su capacidad para hidrolizar el enlace ester de la posicin
sn-2 de un glicerofosfolpido (Figura 1). Su clasificacin est basada en su secuencia,
masa molecular, procedencia, posicin de sus puentes disulfuro, requerimiento de
calcio, entre otras caractersticas. Los productos de la hidrlisis del enlace ester de la
posicin sn-2 del fosfolpido son un cido graso y un lisofosfolpido. Ambos
representan el primer paso en la formacin de segundos mensajeros que juegan
papeles fisiolgicos de gran importancia. Cuando el cido araquidnico es liberado
puede ser convertido en eicosanoides, por medio de la accin de diferentes enzimas.
Estas molculas pueden ejercer una gran variedad de efectos fisiopatolgicos,
principalmente los relacionados con la respuesta inflamatoria. Por su parte, los
lisofosfolpidos pueden ser convertidos en cido lisofosfatdico o ser acetilado hacia el
factor activador de plaquetas, productos que tambin exhiben una variedad de efectos
fisiolgicos.
Figura 1. Reaccin catalizada por las PLA2. Liberacin de un cido graso desde la posicin sn-2 de un
glicerofosfolpido.
Las PLA2s de venenos de serpiente pertenecen a los grupos IA, IIA y IIB. Estas
protenas inducen diversos efectos, entre los cuales se incluyen neurotoxicidad pre y/o
posinptica, miotoxicidad local y/o sistmica, anticoagulacin, cardiotoxicidad,

modulacin de la agregacin plaquetaria, actividades hemoltica, edematizante e
hipotensora y dao directo en rganos como el rin, pulmn e hgado (2). Aunque es
claro que no todas las PLA 2s de venenos de serpiente tienen la capacidad de inducir
todos los efectos mencionados.
Estas enzimas tienen la particularidad de no actuar eficientemente sobre un
sustrato en solucin, lo hacen mejor un sustrato agregado (fosfolpidos de membrana),
por esta razn stas protenas se conocen como enzimas interfaciales (actan sobre su
sustrato en la interfase lipido:agua que se encuentra sobre la membrana celular).
Adicionalmente, estas enzimas son dependientes de Ca 2+ para su actividad enzimtica.
En esta prctica utilizaremos yema de huevo como fuente de fosfolpidos agregados
y como fuente de enzima usaremos veneno de serpiente. Para cuantificar la actividad
enzimtica se extraern los cidos grasos liberados despus de accin de la enzima y
se titularn con NaOH usando azul de timol como indicador.
Materiales
Bao Mara.
Micropipetas (10-100, 100-1000) l.
Pipetas volumtricas 2 ml, 5 ml.
Plancha de agitacin y calentamiento.
Reactivos
Buffer (Tris-HCl 0.1M, CaCl2 0.01M pH 8.5).
Yema de huevo.
Mezcla de extraccin (Isopropanol:Heptano 8:2).
Hidrxido de sodio (0.01 N).
Mezcla de titulacin (Azul de Timol 0.1% en agua y posterior dilucin 1:10 en
Etanol 96%).
Solucin acuosa de buffer fosfatos (PBS) pH: 7.2, 0.1M.
Triton 100 X.
Seccin Experimental
En un tubo de ensayo adicionar 1 ml del sustrato de yema de huevo.
Luego agregar 0.1 ml de la solucin de muestra problema.
Llevar al bao mara e incubar a 37C por 15 min
Retirar del bao mara y agregar 5 ml de mezcla de extraccin y agitar
fuertemente.
Agregar 2 ml de hexano a cada tubo.
Adicionar 3 ml de agua a cada tubo e invertir la mezcla unas 3 veces.
Tomar 2 ml de la fase superior y pasarlos a un tubo de ensayo limpio.

Agregar 1 ml de la mezcla de titulacin.
Titular con el NaOH 0.01 N adicionando con micropipeta de a 10 l, hasta viraje
a un color amarillo verdoso.
Calcular los Eq-g de cidos grasos generados con base en los l de NaOH gastados,
por unidad de tiempo y de masa de enzima. Expresar los resultados en actividad
enzimtica Eq/min/mg Enzima.
Resultados
NaOH x Normalidad de NaOH = Eq NaOH = Eq cidos grasos
Eq /15 min /Miligramos toxina
Preguntas
Adems de buscar inhibidores de PLA 2 que se unan al sitio activo de la enzima
(competitivos), podemos investigar inhibidores que bloqueen la enzima en
otros aspectos, cuales?
Estas enzimas tienen en su superficie aminocidos bsicos, si usamos
fosfatidilcolina (Zwiterion) o fosfatidilserina (anin) para cuantificar su
actividad enzimtica, sobre cual sustrato obtendremos el resultado mayor?
Podemos medir la actividad enzimtica de la enzima sobre fosfolpidos no
agregados?
Bibliografa
Dole VP. A relation between non-esterified fatty acids in plasma and the
metabolism of glucose. J. Clin. Invest 2000; 35, 150-154.
Kini RM. Excitement ahead: structure, function and mechanism of snake venom
phospholipase A2 enzymes. Toxicon. 2003.42: 827-840.
Schaloske RH, Dennis EA. The phospholipase A2 superfamily and its group
numbering system. Biochim Biophys Acta. 2006; 1761: 1246-1259.
PRCTICA # 8 GLUCLISIS ANAEROBIA: FERMENTACIN

ALCOHLICA
5-324
Objetivos
Determinar las diferentes velocidades en la fermentacin de mono, di y
polisacridos.
Determinar el efecto de la concentracin del azucar en el proceso de
fermentacin.
Comprobar la inhibicin de la ruta metablica ocasionada por el NaF.
Aspectos Tericos
El metabolismo es el conjunto de reacciones y procesos fsicoqumicos que ocurren
en una clula. Estos procesos complejos interrelacionados son la base de la vida a nivel
molecular, y permiten las diversas actividades de las clulas: crecer, reproducirse,
mantener sus estructuras, responder a estmulos, entre otras.
El metabolismo se divide en dos procesos acoplados: catabolismo y anabolismo. En
el primero se llevan a cabo reacciones de degradacin de compuestos
macromoleculares que conduce a la liberacin de energa. Mientras que las reacciones
anablicas usan la energa liberada en el catabolismo para sintetizar nuevos
compuestos qumicos que resultan ser vitales para la clula.
Una de los procesos catablicos ms importantes es la glucolisis. Esta ruta
metablica es una de las principales fuentes de energa en la gran mayora de
organismos, ya que los carbohidratos son usados como un alimento fundamental. La
glucolisis consta de 10 reacciones y esta dividida en dos fases, la primera se conoce
como la fase de preparacin y la segunda como la fase de ganancia. La gluclisis
conduce a piruvato, no obstante, el destino final de este varia dependiendo del
organismo y la presencia y/o ausencia de oxigeno en el medio. En el ser humano,
cuando se realiza gluclisis en condiciones anaerbicas (ausencia de O 2), el piruvato es
convertido a lactato (fermentacin lctica), sin embargo si la clula humana realiza
este proceso en condiciones aerbicas (Presencia de O2), el piruvato es oxidado a acetil
coenzima A, la cual posteriormente entra al ciclo de Krebs para producir equivalentes
reductores que finalmente sern usados en la cadena transportadora de electrones
para generar energa qumica en forma de ATP. Por otro lado, en algunas bacterias y
levaduras, cuando la glucolisis es llevada a cabo en ausencia de oxigeno, el piruvato es
oxidado a etanol, proceso que se conoce como fermentacin alcohlica (Figura 1).
Glucosa
2Piruvato
Sin O2
2 Etanol
O2
Sin O2
2 CO2
2 CO2
2Lactato
2Acetil CoA
El etanol resultante se emplea en la elaboracin de algunas bebidas alcohlicas tales
como vino, la cerveza, la sidra, etc. Aunque en la actualidad se empieza a sintetizar
etanol mediante la fermentacin a nivel industrial a gran escala para ser empleado
como biocombustible.
En la prctica de laboratorio se pretende observar y cuantificar la velocidad a la cual
cierto tipo de levadura es capaz de fermentar diferentes sustratos (mono, di y
polisacridos), midiendo la cantidad de CO 2 que se va generando en el tiempo.
Materiales
Tubos de ensayos.
Beakers.
Bao Mara.
Manguera.
Agujas de jeringa.
Probeta 25ml.
Tapones para tubos de ensayo.
Soporte universal.
Reactivos
Levadura fresca al 10%.
Glucosa al 10% y 30%.
Fructosa al 30%.
Sacarosa al 30%.
Almidn al 1%.
NaF 0.1M.
Agua destilada.
Seccin Experimental
1. Adicione a un tubo de ensayo 2ml de solucin de glucosa al 10% colquelo en
un bao de agua a 35-37 C durante 2 minutos y luego aada 5ml de la
suspensin de levadura.
2. Tape el tubo de ensayo con un tapn de caucho, agite y atraviese el tapn con
la aguja de jeringa desechable.
3. Monte el sistema mostrado en la siguiente figura:
Nota: La probeta se llena con agua, se tapa con el dedo pulgar, se invierte y se
sumerge en el beaker con agua. La probeta debe contener agua, hasta donde termine
la marcacin.
4. Apenas comience a burbujear cronometre 15 minutos y lea en la probeta el
volumen desplazado. Tenga en cuenta el volumen inicial y rsteselo al volumen
final.
5. Repita los pasos anteriores con: glucosa, fructosa, sacarosa y almidn y en
diferentes porcentajes P/V.
6. Adicione a un tubo de ensayo 5ml de suspensin de levadura, 2 ml de solucin
glucosa al 10% y 1ml de agua destilada y repita los pasos desde el segundo
hasta el cuarto.
7. Por ultimo, coloque en un tubo de ensayo 5ml de suspensin de levadura, 2ml
de solucin de glucosa al 10% y 1ml de la solucin de NaF y repita los pasos
desde el segundo hasta el cuarto.
8. Anote los datos en la siguiente tabla.
Carbohidrato
Glucosa
1%
Tubo 1
Glucosa
10%
Tubo 2
Fructosa
10%
Tubo 3
Sacarosa
10%
Tubo 4
Almidn
1%
Tubo 5
Glucosa
10% con
agua
Tubo 6
Glucosa
10%con
NaF
Tubo 7
Volumen
Residuos
Los residuos obtenidos no son considerados peligrosos, dispngalos por el desage.
Resultados
Compare los volmenes obtenidos en los tubos 1 y 2 A que se debe el
resultado?
Escriba la reaccin neta balanceada de la fermentacin de cada uno de los
carbohidratos.
Segn las ecuaciones del numeral anterior, Dnde ocurrir la mayor
produccin de CO2? Esta ello de acuerdo con los datos obtenidos
experimentalmente? Explique (Compare los volmenes de los tubos 2, 3, 4 y 5)
y ordene los carbohidratos segn la rapidez en la fermentacin.
Cmo interpretara el efecto del fluoruro de sodio (NaF) sobre la
fermentacin? (compare los tubos 6 y 7).
Preguntas
En que consiste la fermentacin lctica y glicrica? En que diferencian de la
fermentacin etanlica?
El arsenato (AsO4-3) es qumicamente similar al fosfato inorgnico (PO4-3) y
algunas enzimas que utilizan fosfato inorgnico pueden utilizar tambin
arsenato. La produccin de ATP en la glucolisis es inhibida por el arsenato
identifique las enzimas que pueden ser afectadas.
Adems de ATP, se forman otros dos productos importantes en la glicolisis
Cules son?
Enumere algunos inhibidores de la glicolisis.
Bibliografa
Movak M, Strehaiano, P, Moreno M, Goma G. Alcoholic fermentation: On the
inhibitory effect of ethanol. Biotechnol. Bioeng. 1981; 23: 201-211.
David Nelson, Michael Cox. Lehninger Principios de Bioqumica. Quinta Edicin.
Ediciones Omega S.A. Barcelona, Espaa. 2009. Traduccin de: David Nelson,
Michael Cox. Lehninger Principles of Biochemistry. Fifth edition. W.H. Freeman
Company. New York, United States. 2009.
PRCTICA # 9 ELECTROFORESIS DE PROTENAS EN GELES DE

POLIACRILAMIDA
5-324
Objetivo
Comprender e identificar los conceptos bsicos, tericos y prcticos, relacionados
con la separacin de protenas a travs del mtodo de electroforesis
Aspectos Tericos
El principio bsico de la electroforesis consiste en la migracin de las molculas
cargadas elctricamente a travs de un gel u otro tipo de matriz en un campo
elctrico. A un pH determinado, muchas molculas biolgicas poseen carga elctrica,
cuya magnitud depende del pH y composicin del medio en que se encuentren. Con
tcnicas electroforticas, es posible separar de acuerdo a su tamao o masa molecular
los diferentes componentes de una mezcla de aminocidos, protenas, cidos
nucleicos y otras biomolculas cargadas.
Las protenas presentan una carga elctrica neta si se encuentran en un medio que
tenga un pH diferente al de su punto isoelctrico y por eso tienen la propiedad de
desplazarse cuando se someten a un campo elctrico. La velocidad de migracin es
proporcional a la relacin entre las cargas de la protena y su masa. Cuanto mayor
carga por unidad de masa ms rpida ser la migracin.
La electroforesis de protenas se realiza en geles, la ms comn es la poliacrilamida
(PAGE, del ingls Polyacrylamide gel electrophoresis). La PAGE se desarrolla en
condiciones en las que no se altera la conformacin nativa de las protenas separadas,
por lo que finalizada la electroforesis, pueden realizarse estudios de funcionalidad de
dichas protenas separadas (actividad enzimtica, capacidad de unin de anticuerpos,
unin a receptores, etc.). Otra modalidad de electroforesis, es la desnaturalizante,
ms comn, donde se somete a las protenas a migracin asegurando la completa
desnaturalizacin (prdida de la estructura tridimensional). En esta situacin la
migracin es proporcional a la carga y al tamao de la molcula pero no a su forma. El
agente desnaturalizante ms empleado es el dodecilsulfato de sodio o SDS, un
detergente, el cual otorga una carga neta negativa a la protena que les permite migrar
a travs del gel de poliacrilamida en relacin directa a su masa, ya que la cantidad de
cargas negativas que se unen a la protena depende del tamao de sta, existiendo
una relacin carga/masa similar. Una tercera forma de realizar la electroforesis de
protenas, es desnaturalizarlas y posteriormente ponerlas en contacto con un agente
reductor, que provoca la ruptura de los puentes disulfuro. Esta metodologa permite
evidenciar si la protena problema esta formada por de una cadena polipeptdica y se

conoce como electroforesis en condiciones reducidas.
En esta prctica se pretende separar las protenas del suero fetal bovino tanto en
condiciones desnaturalizantes como reducidas.
Materiales
Cmara de electroforesis vertical y accesorios.
Micropipetas de 20, 200 y 1000 L.
Gradillas de plstico.
Reactivos
Solucin de poliacrilamida al 12% .
Buffer Tris-HCL 1,5 M pH= 8,8 .
Buffer Tris-HCL 0,5M pH= 6,8.
Dodecilsulfato de sodio (SDS) al 10% .
Persulfato de amonio (APS) al 10% recin preparado.
N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina (TEMED solucin stock).
Agua destilada.
Buffer de muestra.
Azul de coomasie R-250.
Agente Fijador.
Agente decolorante.
Nota: Precaucin, la acrilamida y bisacrilamida como monmeros son potentes

neurotoxicos acumulativos que se absorben rpidamente por la piel, no pipetear con la
boca ni manipular las soluciones sin usar guantes.
Seccin experimental
Armar la cmara de electroforesis ensamblando el molde para el gel utilizando
vidrios de 0.75 mm de espesor, segn las especificaciones del profesor.
Mezclar en dos tubos los reactivos para la preparacin del gel separador y
espaciador en las cantidades descritas con excepcin del persulfato de amonio,
que se agrega en el momento antes de adicionar los geles.
Primero preparar el gel INFERIOR o de separacin.
COMPONENTES
CANTIDADES
EN l
Agua
desionizada
Amortiguador
inferior
SDS
Acrilamida/
bisacrilamida
TEMED
Persulfato de
amonio
20%
CONCENTRACIN FINAL
15%
12%
10%
367
1167
1683
2000
1250
1250
1250
1250
50
3333
50
2500
50
2000
50
1667
6
30
6
30
6
30
6
30
El volumen que se adiciona a cada uno de los tubos es de 3600 l

sta mezcla gelifica aproximadamente en 30 a 45 minutos.
Preparar el Gel superior o de apilamiento.
COMPONENTE
CANTIDAD
Agua desionizada
1500 l
Buffer superior
SDS
Acrilamida/ bisacrilamida
TEMED
Persulfato de amonio
630 l
33 l
330 l
5 l
20 l
Se coloca inmediatamente el peine para formar los pozos donde

posteriormente ser sembrada la muestra. Esta mezcla gelifica
aproximadamente en 30-40 minutos. Una vez gelificado se procede a quitar el
peine deslizndolo suavemente y se lava delicadamente con agua destilada
para eliminar algunos residuos no gelificados.
o Ensamblar la cmara segn las instrucciones del profesor.
o Sembrar 20 l de la muestra a evaluar y 10 l de marcador de peso
molecular.
o Llenar la cmara con el amortiguador de corrida 1x: 180 ml en el tanque

interior y 120 ml en el exterior. Colocar el gel en la cmara y correr las
muestras a 120 V (voltaje constante) hasta que el azul de bromofenol llegue
casi al borde inferior del gel (aproximadamente 60 min).
o Separar los vidrios que contienen el gel con cuidado. Sacar el gel y eliminar
la parte del gel espaciador.
o Colocar los geles en una solucin fijadora por media hora.

o Teir el gel con colorante Coomassie, sumergindolo durante 1 hora con
agitacin constante. Luego se elimina el exceso del colorante con varios
cambios de decolorante.
o Registrar los resultados fotografiando el gel.

Preguntas
Cul es la influencia de:
o El pH del gel de apilamiento sobre la calidad de las bandas.
o La concentracin de monmero en el gel de separacin sobre la
capacidad para diferenciar dos protenas con pI muy parecidos.
Bibliografa
Lomonte B, Rojas L. Inmunologa manual de laboratorio. Universidad de Costa
rica. Facultad de Microbiologa, 1996.

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