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VITRODE

DESARROLLO DE UN PROTOCOLO PARA LA INTRODUCCIN

Vitis vinifera VAR. CABERNET SAUVIGNON

''V

MARIA EMILIA ROA BASTIDAS


ANDRES DAVID TORRES HERNANDEZ

Y AMBIENTALES U'D'C'A
UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS

FACULTAD DE INGENIER REROT'UICA


20'12

UDCA

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FECHA: ,'1 N0\ Tttt

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DESARROLLO DE UN PROTOCOLO PARA LA INTRODUCCIN

Vitis viniferaYAR. CABERNET SAUVIGNON

VITRODE
''V

MARIA EMILIA ROA BASTIDAS


ANDRES DAVID TORRES HERNNDEZ

para optar con el titulo


Trabajo de grado presentado como requisito parcial
de lngeniero Agrnomo

Director
RODOLFO ALBERTO MEJA CRUZ

lngeniero Agrnomo; M. Sc

Y AMBIENTALES
UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS

FACULTAD DE INGENIERi CNOHIIICI


BOGOT
2012

El autor concede a la Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales


permiso para reproducir este trabaio para fines educativos.

Emilia Roa

./l

7/^Jrcf

12"

14
.l''^u"/ '/D"u'
Andres Torres

U'D'C'A
Univercidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales
Ingenieria Agronmica
2012

DESARROLLO DE UN PROTOCOLO PARA LA INTRODUCCIN

Vitis vinifera YAR. CABERNET SAUVIGNON

Por
Emilia Roa
Andres Torres

NOTA DE ACEPTACION:

ilr,rJ-.S* J-.Jurado

VITRO DE

'A'

DEDICATORIA

Este trabajo de grado est enteramente dedicado a Dios, a ti que me diste la


gloria... Estar
oportunidad y, sin soltarme de la mano me guiaste y me llevaste a la
hoy escribiendo mi paso final de mi carrera como pregrado'

Amispadresporseresehombro,esamano,esafe|icidaddaada'porestaren
demasado
las buenas como en las malas, mi carrera profesional va dedicada con
para
Francisco J. Roa y Amanda del Rocio Bastidas A mis

amor

ustedes,

siempre, y estar de
hermanas; camila, Valentina e lsabela, les dedico el apoyarme
s' primo(a) s' a
acuerdo en la toma de mis decisiones. A mi familia, abuelas' to(a)

todos les dedico mis logros.

Amismejoresamigosquienesnodejarondecreerenm|esdedicomitrabajode
grado;RicardoGi|,Ne|sonGa|eano,A|ejandraCeba||os'Natha|iaRamrez,Nata|ia
Soto.

en memoria de mi
Y con todo mi amor y cario mi trabajo de grado va dedicada
quien siempre confi' crey' y
hermano, amigo, primo Fabio Santiago Roa Rocha'
a la fecha estoy'
me nimo, me fortaleci de llegar a estar donde'
Emilia Roa

que en los momentos de crisis me cargo en


Dedico este trabajo cle grado a Dios

susbrazosyforta|ecien|osmomentosdedudaeincertidumbreymebendice
de pregrado y el primero en mi vida
hoy para dar el ltimo paso en mi carrera
orofesional.

A mis padres y hermanos que compartieron mis logros, reveces y soportaron ms


ideas cada vez que mi habitacin y casa se transformaba en un laboratorio, a
ustedes, Hugo Torres, Mara lns Hernndez, Hugo Leonardo y Diego, a mi
sobrina Mara Camila y su madre sandra M. Cabezas, a todos ustedes les dedico
con amor toda mi carrera profesional y cada uno de los logros que faltan por venir.
Recuerden que el vino mejora con los aos y solo hasta hoy estamos en vendimia,
falta mucho para mejorar pero poco para estar entre los ganadores'

Andrs D. Torres

AGRADECIMIENTOS

El presente trabajo de grado es un esfuerzo en el cual, directa o indirectamente,


participaron varias personas, opinando, estando en los momentos de alegra como

en los momentos de tristeza, apoyndonos incondicionalmente y dndonos nimo


cuando se pensaba negativamente.

Debo agradecer de manera especial y sincera al profesor Rodolfo Meja Ingeniero


agrnomo de la universidad De Ciencias Aplicadas y Ambientales, por habernos
por
permitido finalizar nuestra tesis de grado, y en general a todos los profesores
la colaboracin durante todo el proceso formativo y acadmico en el crecimiento
dentro de la carrera.
cinco
A todos ms amgos y compaeros que me apoyaron y permitieron en estos

aos una convivencia dentro

fuera del aula, tengo palabras solo

de

Luis
agradecimiento; Catalina Medina, Geovanna Guerrero, Jenny Guerrero'
Gracias'
Miguel Gutienez, Natalia Gom2, Julian Barn, Gustavo Melgarejo"'

Paraaquel|osquehancompartidoconmigo|os.,iresyvenires''ene|p|ano
personal, de quienes siempre he recibido palabras de aliento

Finalmente, debo agradecer

"

Gracias

a mi Universidad De Ciencias Aplicadas y

AmbientalesU.D.c.Aporhaberparticipadoyhabermepermitidoesca|arenlavida
profesional, Gracias'
Emilia Roa

Agradezco a nuestros directores de tesis quienes siempre nos apoyaron en este


mar de ideas y fortalecieron nuestro trabajo cada vez que se presentaba alguna
dificultad.

A todos mis compaeros y amigos que participaron, apoyaron y daban una voz de
aliento cuando ms se necesit, a ustedes, catalina Medina, Geovanna Guerrero,

Jenny Guerrero, Luis Miguel Gutierrez, carolina sanchez, oscar Delgado...


Gracias por compartir estos cinco aos de carrera por encontrar en ustedes una
voz de aliento y por ser partcipes de los bueno y malos momentos dentro de
nuestras aulas de clase y fuera de ellas.

definitivamente agradezco

a mi universidad De Ciencias Aplicadas y

Ambienta|esu.D.c.A.porserparticipedemis|ogros,porpermitirmeVo|arenm|s
sueos plasmndolos en este documento y haberme visto crecer
profesionalmente, Gracias,

Andrs D. Tones

LJn tnvento no es nunca

un proceso puramente mental. Al contraio, resulta de la

ya hecho,
lucha entre la idea y el mundo mateial. Entre Ia idea y el invento
"nacimiento" de la
siempre se encuentra el trabaio y el sufimiento de! inventor. El

ldeaeseltiempoplacenterodeltrabajomenta!creativo,duranteelcualtodo
pareceposible,porquenotienenadaquevercontarealidad'La"ejecucin,'esel
tiempodereunrtodos/osmedlosnecesariosparalarealizacindelaidea,es
obstculos naturales y
todavia un perodo creativo, durante el cual se vencen los
invento, es
e! inventor adquiere talla, aun si puede sucumbir. La "introduccin" del
la pereza y la mala fe' Ia
el tiempo de Ia tucha contra la ignorancia y Ia envidia,

resistenctayagresinabieadeinteresesdeotrasc/ases'unverdaderomartiria'
incluso cuando se tiene xito

(Rudolf Diesel, 191 3)

RESUMEN

En Colombia, la vitivinicultura ha tenido un crecimiento significativo en los ltimos


aos, centrado especialmente en el departamento de Boyac, dando una
alternatva diferente de crecimiento

a los agricultores de la zona. sin

embargo,

sta planta para produccin de vino al tener una adecuacin diferente al tropical'

tiene muchos condicionantes que dificultan

la

produccin, entre ellos la

importacin de materiales para su propagacin. Por esta razn la herramienta


podra
biotecnolgica del cultivo in vitro, se convierte en una alternativa que
solventar el anterior problema. El presente trabajo se bas en el desarrollo de un
protocolo para la introduccin in vitro de vitis vinifera var. cabernet sauvignon,

mediantelaidentificacindelmejorpropguloenestecasoe|tipodeyema
(en dos
(algodn/invierno) y el agente desinfectante, hipoclorito de sodio NaCIO

concentraciones:1,5%y5o/o;ydostiemposdeinmersin:10miny20min)'Parala
versin 'l'11
sistematizacin de la informacin se utilizaron los programas winstats
que el tipo de
y statgraphics centurion XV versin 15.2.14. Los resultados indican
propgulo que mejor respuesta dio fueron las yemas tipo algodn' cuando

interactanconhipoc|ortodesodioal5%entiemposdeinmersindel0minutos.

INDICE

NTRODUCCTN....................

"'.."."21

2. JUSTIFICACIN..............

.....'....23

3. oBJETIVOS...

"......."..'.'.."""""24

L|rERATURA..........'...'..
4.1. lmportancia agronmica en el mundo ..
4.2. lmportancia agronmica en Colombia
4.3. Sistemticadel gneroVitis........."" "'
4.4. Biologa de la vid
4.4.1 . Ciclo Vital
4.4.2. Ciclo bianual...
4.5. Fisiologia de la vid

4.

"""""25

REVISIN DE

"" ' """"""""

"25

' " " "" ""


" """"""" "

"26

'""

"28

"""""""25

" """"""" 29
" "" ""30
" "' " '30

"" "' """"""'32


"" ' """" '32
4.6.1. Fase de paralatencia .
""' ' """"'33
4.6.2. Fasedeendolatencia"'
'' ' ' "' ' 33
4.6.3. Fase de ecolatenca
4.6.4. Clasificacin de lasyemasdevid: evolucin " " " " " " " ' ' " ' " "34
4.6.5. Ciclo evolutivo de las yemas de Vid: Dinmica " " "" " "" " "" "'34
'"' ""37
4.7. Tiposdeyemasdevid """"""

4.6.

4.7

lmportancia, formacin y diferenciacin de las yemas"

.1.

"

37

Yema Pronta...

" """"""

4.7.2. Yema hibernar, latente o mixta """'


4.7.g. Yema latente..
4.8. Variedades ....
4.8.1.

Gabernet Sauvignon Vitis

'

vinifera

'

"38

"" ""

38
.39

'

"""" ' """' " " "40

........40

4.9.

4.10.

Phytium
4.10.2. Rhizoctonia
4.10.3. A1ternaria.................

-...'............. 42

4.10.1.

4.11. Cultivo in vitro, propagacin de la vid . ...."'...

....-.....

...'.

..

'42

. ...'."" " " 43


"" "" " "43

4.12. Variedades, material vegetal y tipo de regeneracin.'.......... '.""

"""""

'44

vegeta1...........'

""""""""""45
... '""" "45
Auxinas
"""" "'46
Citoouininas
"" " '46
Giberelinas.....
' "" " "" " '46
AcidoAbscsico (ABA)
"" " 47
Eti1eno............
Mtodos Quimicos para el control de dormancia in vitro"""""""" "47
Metodologas en cultivo de tejidos vegetales '' " "" "" "" """" " "48

4.13. Reguladores del crecimiento

Organognesis directa...

........
Organognesisindirecta
Embriognesis somtica.........

" " "49


" " "" " "49
""""49

rganos de perennidad formados en cultivos aspticos

""""""""49

"""""' " " "'49


"""' " """'50
in vitro """" "" " ' " "50

embriones
Etapas de la propagacin in vitro.'.""""'
Cultivo de

Obtencin y establecimiento del explante

inculos
Seleccin del medio de cultivo """'
lncubacin en condiciones adecuadas
Enraizamiento.
Factores limitantes al cultivo in vitro""""""
Fenolizacin.'.
Desinfeccin de los

"

" ' " "50


" """""" " 51
"" " "" " "53

"""
""""""

'54
'54
A6

5.1.

..."''""

5.2. Materiales

5.2.1. Material Vegetal


5.3. Materiales para siembra
5.3.1.
5.4.

... " ""

preliminares
5.4.2. Tratamientos propuestos..'...
.

5.4.3.

""""'57
"" " " 57

.."""" " " """" " """57

Preparacin de explantes para la introduccin

Tratamientos evaluados para la introduccin yemas in vitro

5.4|l

"57

""""""" " "58

"'""""58

Evaluaciones

""" " " '59

Variables evaluadas en los protocolos de desinfeccin (Bioensayo l-ll)

''"

"""'""

5.4.4. Evaluacinestadistica......
5.4.5. Toma de datos... '..'......
5.5. Preparacin de medios de Cultivo"" "

""

61

62

""" """""""62
"" " " " "" " """'63

""""""""""""'64

6. RESULTADOSYDISCUSIN
6.1. Evaluacin de sobrevivencia fase 1

"" " "64

6.1.1. Efecto de la concentracin del hipoclorito de sodio"""' " " "" "" " 64
yema y
6.2. Evaluacin de la concentracin de NaCl' tiempo de NaCl' tipo de
de brotacin "' "" "" """"""'73
aplicacin de antioxidantes versus el porcentaje
6.3.

Eliminacin de explantes a travs del tiempo

""

'

"""" "'75

6.4.Eva|uacinde|porcentajedemorta|idaddeexp|antesporcontaminacin
y bacteriana versus tiempo y concentracin de NaCl " """' "" "" ""'76
fngica

de NaCl' tiempo de
Evaluacin con dos variables de la concentracin
versus el porcentaje de
NaCl, tipo de yema y aplicacin de antioxidantes

6.5.

sobrevivencia.

"""" ' """""" "'79

Evaluacin con dos variables de la concentracin de NaCl, tiempo de


NaCl, tipo de yema y aplicacin de antioxidantes versus el porcentaje de

6.6.

brotacin.........
6.7.

Evaluacin de sobrevivencia fase

6.8.

Protocolo para

'.'...'....'.'..." " 84

2..........

CONCLUSIONES

" "

'87

la introduccin in vitro de Vitis vinifera var. cabernet

Sauvignon.......
7.

.. . .. "

........,.........

8. RECOMENDACIONES.........
8I8L|OGRAF|A....................

...." """"

93

.'..'.'...'."""""""'e4

.....'."."""""""""95
e6

ANEXOS

Anexo 1. Composicin del medio de cultivo de Murashige & skoog 1962.......101

fase"..............
Anexo 2. Base de datos primera fase ....'....'....'
Anexo 2. Base de datos primera fase..'.... .....'..
Anexo 2. Base de datos primera fase. '.... .......
Anexo 2. Base de datos primera fase....'.'.'..'.."
Anexo3.Basededatossegundafase........" " '

Anexo 2. Base de datos primera

"""""""""""102
"" """"" ""

"103

"" " "" "" " '104


" ' " "" " 105
"' " " """"""106
"" " " "" "107

significativa 107
Anexo 4. Grfica prueba Z para dos proporciones con diferencia
significativa..l0S
Anexo 5. Grfica prueba Z para dos proporciones sin diferencia
Anexo 6. Comparacin de Proporciones

Porcentaje y Prueba Chi-Cuadrada"

'"" " ""


Anexo 7. Reporte

"108

"" "" " "" "

ANOM.....'...'..

"

109

AnexoS.Proporcionesobservadasparacadaunade|as4muestras...'..'..'..'109
y Prueba Chi-Cuadrada""'
9. Comparacin de Proporciones - Porcentaje
Anexo

Anexo 10. Comparacin de Proporciones

'"""""'110
-

Porcentaje y Prueba Chi-Cuadrada '


110

o""," ,,, .",;",;.;;;;;,;;". - ;",:";,;;;,"";"


Anexo 12. Comparacin de Proporciones

;;;;";;r"
" " ' """"111

Porcentaje y Prueba Chi-Cuadrada"'


1

o""-",,.,"o.;;,";;':...'

INDICE DE TABLAS

Tabla

1.

Estadios fenolgicos de las yemas de vid segn Eichhorn-

Lorenz Fuente: (Coombe, 1995)

Tabla

2.

para

la

Medios de cultivo y condiciones experimentales utilizadas

iniciacin

multiplicacin

"in vitro" de las

diferentes

variedades fuente: (Toms, 1995)

Tabla

3.

Protocolo de desinfeccin; se observa cada una de las

etapas llevadas a cabo para cada producto'

51

INDICE DE FGURAS

FIGURA 1. Fisiologa de los rganos de la vid, fuente: (Raynier' 2001):


31

(Raynier,2001)

FIGURA 2. Estadios fenolgicos de las yemas de vid segn BBCH'


35

Fuente: (Meier, 2001)

FIGURA 3. Ciclo evolutivo: dinnrica de las yenras' fuerrte (Raynter,


36

2001)

FIGURA 4. Tipos de yemas de vid, Fuente: (Lanzarini, et

al,2O09)

FIGURA 5. Material vegetal yema con segmento de tallo,

recin

37

Sg

sembrado in vlfro
un
FIGURA 6. a. Primera fase. b. Segunda fase para el desarrollo de

protocolo para

la

introduccin

in vitro de Vftis vinifera var '

C'

ol

Sauvtgnon

FIGURA

7.

Porcentaje

de sobrevivencia de los explantes vs

el

porcentaje de la concentracin del desinfectante para la introduccin


in vitro C. Sauvignon

64

la eliminacin
FIGURA 8, Porcentaje de los agentes que promovieron
del desinfectante
de los explantes vs el porcentaje de la concentracin

oara la introduccin ln vlfro C' Sauvignon

oo

FIGURA 9. Porcentaje de sobrevivencia de los explantes vs tiempo de

inmersin en

el desinfectante para la

introduccin

in vitro de C.

Sauvignon

68

FIGURA 10. Porcentaje de los agentes que promovieron la


eliminacin de los explantes vs tiempo de inmersin en el
desinfectante para la introduccin in vtro de C. Sauvignon

69

FIGURA 11. Porcentaje de sobrevivencia de los explantes vs el tipo


de yema para la introduccin in vitro de Vlfls vinifera var' C' Sauvignon

70

FIGURA 12. Vista inferior formacin de raz y callo, explante de yema


tipo algodn, concentracin al 5o/o, y tiempode 10 minutos

7'l

FIGURA 13. Porcentaje sobrevivencia de los explantes vs la


aplicacin del antioxidante para la introduccin in vitro de C'
72

Sauvignon

FIGURA 14. Porcentaje

de los agentes que promovieron

la

para la
eliminacin de los explantes vs la aplicacin de antioxidante
73

introduccin in vitro de C. Sauvignon

F|GURAl5.Porcentajedebrotacinvseltipodeyemapara|a
74

introduccin in vitro de Vits vinifera var' C' Sauvignon

FIGURA

16'

Porcentaje

de plantas vivas vs la

aplicacin del

in vitro de Vitis vinifera


antioxidante a los explantes para introduccin
var. C. Sauvignon

76

FIGURA 17. Nmero de explantes eliminados vs

el

nmero de

lecturas reafizadas cada tercer da para la introduccin in vitro de Vitis


76

vinifera var. C. Sauvignon

FIGURA

18.

explantes contaminados por los patgenos (Alternaria,


77

Pythium, Rhizoctonia)

FIGURA

19.

Porcentaje

de

mortalidad

de

explantes por

contaminacin bacteriana o fngica vs el tiempo de inmersin y la


concentracin del desinfectante para la introduccin in vitro de vitis
7B

vinifera var. C. Sauvignon

FIGURA 20. Porcentaje de sobrevivencia vs la concentracin del


desinfectante y el tiempo de inmersin de los explantes para la
7g

introduccin in vitro de C. Sauvignon

FIGURA

21.

Explante de yema tipo algodn, concentracin al

1'5o/o'

en Droceso de crecimiento y enraizamiento

B1

yema y la
FIGURA 22. Porcentaje de sobrevivencia vs el tpo de
in vitro de
concentracin del desinfectante para la introduccin
Sauvignon

del
FIGURA 23. Porcentae de sobrevivencia vs la aplicacin
para la introduccin
antioxidante y la concentracin del desinfectante

in vitro de C. Sauvignon

83

FfGURA

24.

Explante de yema tipo algodn, concentracin al

1,5o/o,

en Droceso de crecimiento

FIGURA 25. Porcentaie de Brotacin vs el tipo de yema y la


concentracin del desinfectante para la introduccin in vitro de Vitis
85

vinifera var. C. Sauvignon

FIGURA 26. Porcentaje de Brotacin vs la aplicacin del antioxidante


y la concentracin del desinfectante para la introduccin rn vitro de
86

Vitis vinifera var. C. Sauvignon

FIGURA

27.

Explantes

de yema tipo algodn var'

Cabernet
89

Sauvignon, broto, creci y enraiz la yema

FIGURA

28.

Porcentaje

de explantes que brotaron, crecieron

enraizaronvseltipodeyemay|aconcentracinde|desinfectante
on

para la introducci6n in vitro de C. Sauvignon


yema y la
FIGURA 29. Porcentaje de explantes oxidados vs el tipo de
de C'
concentracin del desinfectante para la introduccin in vitro

91

Sauvignon

FIGURA 30. Nmero de explantes que se contaminaron

vs

la

para la introduccin
concentracin del desinfectante y el tipo de yema
in vitro de Vitis vinifera var' C' Sauvignon

RESUMEN

En Colombia, la vitivinicultura ha tenido un crecimento significativo en los ltimos

aos, centrado especialmente en el departamento de Boyac, dando una


alternativa diferente de crecimiento a los agricultores de la zona. sn embargo,
sta planta para produccin de vno al tener una adecuacin dferente al tropical,
tiene muchos condicionantes que dfcultan la produccin, entre ellos la
importacin de materiales para su propagacin. Por esta 'azn la herramienta
biotecnolgica del cultivo in vitro, se convlerte en una alternativa que podra
solventar el anteror problema. El presente trabajo se bas en el desarrollo de un
protocolo pafa la introduccin ,n vitro de vitis vinifera var. cabernet sauvignon,

medante

la identificacin del mejor propgulo en este caso el tipo de yema

(algodn/invierno) y el agente desnfectante, hpoclorito de sodo NaCIO (en dos


concentraciones: 1,5% y soa; y dos tiempos de inmersin: 1omin y 20min). Para la
sistematizacin de la informacin se utilizaron los programas winstats versin 1.11
y Statgraphics centurion XV versin 15.2.14. Los resultados indican que el tipo de

propgulo que mejor respuesta dio fueron las yemas tipo algodn' cuando
interactan con hipoclorito de sodio al 5% en tiempos de inmersin de 10 minutos.

I.

]NTRODUCCION

La uva ( Vlfls vinifera L.) es un frutal de clima templado, que necesita un nmero de
horas con temperaturas por debajo de cierto nivel crtico pafa romper el perodo de
letargo o de reposo de sus yemas, un perodo en el que su actividad vegetativa y

metablica se detiene casi totalmente, como un mecanismo de adaptacin para


proteccin contra fros extremos que pueden daar los tejidos (Raynier, 2001)'

A lo largo de cada ciclo anual, la vid asegura un ciclo vegetativo, en el cual ocurre
el crecimiento y desarrollo de los rganos vegetativos (pmpanos, hojas, zarcillos

y races); su perennidad mediante el almacenamiento de resefvas (agostamiento)


y la adquisicin de endolatencia de las yemas. Y un ciclo reproductivo en el cual
se da el crecimiento y desarrollo de los rganos reproductores (inflorescencias,
flores y bayas) y su maduracin (Raynier, 2001)

Es conocido que las diferentes variedades de vid se enfrentan a numerosos


problemas cuando se cultivan en condiciones naturales. son problemas derivados

o menor resistencia a las temperaturas extremas, a enfermedades


por
provocadas por microorganismos (bacfenas, hongos o vrus), a la depredacin

cte su mayof

Darte de insectos, entre otros (Toms' 1995).

Lauvatradicionalmentesepropagademaneravegetativamedianteacodos'ya
del
sea areos o terrestres, e injertos. sin embargo, la herramienta biotecnolgica
donde cada
cultivo rn vtro, se basa en el concepto de la totipotencialidad celular,
(Margara' 1988)'
clula tiene el potencial de producir una planta completa

y agua'
El medio de cultivo, es la combinacin slida o liquida de nutrientes
Usua|menteinc|uyesalesinorgnicas,carbohidratos,vitaminasyaminocidos.A
menudosedenom|namediobasa|ypuedesersup|ementadocona|gnregu|ador
con actividad hormonal' La
de crecimiento, y ocasionalmente con otras sustancias
yemas axilares y apicales'
tcnica de multiplicacin vegetativa in vitro, a partir de

21

se refiere a la rpida estimulacn del desanollo de brotes apicales (meristemos)


(Toms, 1995).

La expresin cultivo ln

vitro de plantas, significa cultivar plantas dentro de

un

frasco de vidrio en un ambiente artificial. Esta forma de cultivar las plantas tiene
dos caractersticas fundamentales: la asepsia (ausencia de grmenes, entre
otros), y el control de los factores que afectan el crecimiento (Toms, 1995).

Aunque se han desarrollado varios trabajos de investigacin relacionados con el


cultivo de tejidos en Vitis vinifera Var. Cabernet Sauvignon en otras regiones del
mundo; se ha encontrado en ensayos preliminares que estos protocolos no son
aplicables en el trpico, ya que, la vid es un frutal de clima templado que requiere
horas frio, pasando precisamente por estaciones que en pases como colombia no
se presentan; por lo cual los propgulos no tienen el vigor y calidad que requieren

en el momento de llevar a cabo una introduccin del material vegetal


condiciones de cultivo in vitro.

bajo

Segn investigaciones realizadas.en Jurez (Mxico) se consider al observar el


yemas
comportamiento de tratamientos con yemas axilares y pices, que el de las
axilares era el explante para usarse en la etapa de la muliiplicacin de brotes, se
tuvieron los mejores resultados para propagaci'n in vitro de vid variedad Globo
mentras
Rojo, porque |as yemas axi|ares se encuentran en principio de formacin,
que
yemas apicales (yema con la primera hoja) ya se han formado y su

las

desarrolfo es ms lento in vitro (Osuna & Saucedo, 2010)'

El

presente trabajo tiene como finalidad establecer

un protocolo para

la

que servira de base


introduccin in vitro de Vitis vinifera var. Cabernet Sauvignon,
para poder iniciar una produccin a mayor escala'

22

2.

JUSTIFICACION

Gracias al crecimiento que ha tenido la vitivinicultura en Colombia, es necesaro

desarrollar estrategias que contribuyan al desarrollo del cultivo, entre ellas las
relacionadas con la propagacin. La vid es un cultivo que tradicionalmente se
propaga de manera vegetativa medante acodos areos o terrestres, e injertos,
sin embargo esto implica tener material base (plantas madre) que permitan el
desanollo de estas tcnicas; en Colombia no estn dadas las condicones para el
mantenimiento de estas plantas madre, por lo que la mayoria de los cultivadores

a la importacin del material, aunque el lcA realiza todo su pro@so


cuarentenario para el ingreso de plantas, mucho de este material vegetal se
recurren

siembra contaminado, por esta razn se incrementa considerablemente los costos


de produccin por la prdida del material vegetal importado. Es en este punto' en

donde la herramienta biotecnolgica del cultivo

in vitro, se

converte

en

una

alternativaquepodraSuperaresta|imitante,pesea|osproblemasdeoxidaciny

feno|izacinquegenerae|explanteene|medodecu|tivo.A|encontrar
importacin
metodo|ogas que se adapten a nuestras condciones, Se Superara |a
plagas y
del material vegetal, dando como valor agregado, la eliminacin de

enfermedades que en ocasiones estn ligados con el material importado


de
En colombia desde el inicio del proyecto vitivincola en el viedo Marqus

Punta|argaene|aolgS2yMarquesdeVil|adeLeyvaene|ao1985'|as
son;
variedades que se nan estabilizado para el departamento de Boyac
Cabernetsauvignon,sauvignonblanc,Riesling,RieslingxSilvanneryPinnotnour'

Lauvaquemsseconsumeenvinoanive|mundiales|aCabernetsauvignon.

3.

OBJETIVOS

General

Desarrollar un protocolo para la introduccin

y mantenimienlo in vitro de

Vitis vinifera var. Cabernet Sauvignon.

Especficos

ldentificar el mejor tipo de yema, para la introduccin ln vitro de v. vinifera


var. Cabernet Sauvignon

Determinar las condiciones ptimas de limpieza para la introduccin in vitro

de Vlfis vinifera var. Cabernet Sauvignon

24

4.

REVISION DE LITERATURA

Como planta perenne, la vid tiene una vida de treinta a cuarenta aos y no entra

en produccin hasta el tercero o cuarto ao despus de la plantacin. Su vida es

una sucesin de ciclos anuales interdependientes, pues las condiciones de


vegetacin a lo largo de un ciclo debidas al medio y al hombre, tienen influencias
en los ciclos vegetativos siguientes (Fregoni,2005).

4.'1.

lmportancia agronmica en el mundo

En la antigua Mesopotamia 4.000 aos a.C., hoy en da Egipto y Siria, se encontr

una orueba del cultivo Vitis vinifera; a partir de esto se comienza a expandir el
rubro en toda Europa. Los griegos fueron los que introdujeron las vias y
produjeron vino en sus colonias, y ms tarde los romanos practicaron la viticultura
en todo su imperio, lo cual tuvo una gran importancia para estas civilizaciones. Los

que introdujeron el vino en Francia fueron los colonizadores griegos del Massalia
(Marsella). Durante el periodo del imperio romano, Galia (Francia) pas a ser una
fuente tan abundante de vino que se crearon leyes para proteger la produccin de
Italia. Debido a la cada del imperio romano la produccin de vino se redujo
considerablemente pasando a ser una actividad exclusivamente monstica dado
que el vno fue siempre importante en los sacramentos cristianos. Pero en los
principal
siglos Xll y XVI la produccin de vinos se generaliz nuevamente y fue la
que
fuente de explotacin en Francia. Durante el siglo XVll se desarroll la botella

contendria el vino y la utilizacin del corcho, esto hace posible el almacenamiento

de|mismo.Losquehoyson|osmejoresviedosdeBurdeoscomenzaronaser
y principios del
expandidos por sus aristocrticos propietarios a fines del siglo XVII

XV|||;mientrasque|osbritnicosdesarro||aron|osviedosde|va||ede|Duero
(Portuga|).Enestesiglotambincomenz|amodernacomerca|izacnde|vino
espaol (Lpez, 2009).

25

No solo la produccin de vino se daba en Europa sino tambin fuera de esta como

en Chile que comienza a partir del siglo XVl, en EE.UU. a partir del siglo XVlll'
como tambin en Australia a partir del siglo XlX. En 1863 la viticultura europea es
en casi toda su totalidad devastada por la filoxera acabando las vias por los
problemas de las races. El control de esta plaga se encontr en Amrica en el
ao de 1880, al realizar injertos sobre patrones nativos americanos los cuales eran

a la filoxera. En la primera mitad del siglo XX, la viticultura y la


produccin de vino se vio afectada debido a los conflictos blicos sufriendo
resistentes

adulteracin, sobreproduccin y fraude. Mientras que en la segunda mitad del


siglo XX fue notable por los avances tcnicos, as como en el rea de la
vitivinicultura como por la incesante globalizacin de la produccin del vino (Lpez'
2009).

4,2.

lmportancia agronmica en Colombia

En Colombia, como aconteci en todas las regiones colonizadas por Espaa'


existen vestigios de la introduccin de la vid desde principios del siglo XVI en
asentamientos y encomiendas, que no pasaron de ser intentos de la poca
colonial y del perodo siguiente; Henao (2004), menciona que existen testmonos

queen|apob|acindeTane||a(Urabantioqueo)secu|tiv|avid,yquefue
igualmente
oosiblemente la sede de santa Mara la Antigua del Darin. se cree
queene|va||einterandinodeSogamosocrecieron|asvides,tantoquedejaron
(
sp.)
sus hue||as en grabados |ticos de |a poca, mostrando una mirla Iurdus
mortero que cubra la
ocoteando un racmo de uvas. Al desplomarse una parte del
de Firavitoba, Boyac; que cuenta con 400 aos' dej al

cpula de

la lglesia

descubierto

el

entramado que

lo sostena, y que haba sido elaborado

con

sarmientosdevid.Loanterior,pareceindicarquequiensintrodujeron|aS
primerasvidesaestareginfueronlosjesuitas,puesenlahaciendadestos'uno
sobreviven
de los primeros centros de operacin de la Compaa de Jess'
que denomnaron
algunas vides de lo que parece ser la cepa silvestre americana
26

missin. Quijano (2006), menciona que las cepas de esta variedad se encuentran
an productivas.

El cultivo comercialmente se inici a comienzos del siglo XX, en los valles de la


margen occidental del ro cauca, en

el norte del Departamento del Valle del

Cauca, con la plantacin de efensiones pequeas que, ms tarde, se ampliaron a

otras zonas. De esta manera, en el ao 1932 haba viedos en Antioquia,


Santander, Tolima y Santa Marta. Pero solo hasta 1945, se impuls

la viticultura, cuando Alberto Grajales plant 180 vides en el


municipio de la unin. Las primeras plantas fueron obsequiadas gracias a un
proyecto vitcola del gobierno espaol que dirigi seferino Gonzlez en el

verdaderamente

Municipio de Bolvar, Valle del Cauca

El cultivo de la vid, para elaboracin de vino, en el altiplano colombiano, en


altitudes entre 2.200 y 2.650 msnm, se inici en 1982, en la Loma de Puntalarga,
en el Valle del sol, departamento de Boyac. Los cultivos de uva en la localidad
las que se
de Villa de Leyva se iniciaron con algunas variedades alemanas, entre
los
encontraban Riesling, Sylvaner, Pinot Negro y Kerner (Henao, 2004)' Entre
municipios de sutamarchn y Villa de Leyva, a2.215 msnm, se encuentra ubicado
viedo "Marqus de Villa de Leyva" que tiene plantadas las variedades

el

Sauvignon Blanc importadas de Francia y Chardonnay


2010)'
tradas de Napa Valley, California, USA (Marqus de Villa de Leyva'
Cabernet Sauvignon

Actualmente,

en Colombia se cultivan uvas para consumo en fresco en

16

productor), distribuido a
municipios del departamento del Valle del cauca (mayor

|olargodelrocauca(4olatitudnorte).otrosproductoresdeuvademesa,son|oS
que en 16 municipios de
departamentos de Tolima, Huila y Santanderes' Mientras
alto en el
y
las provincias de Sugamuxi, Valderrama, Tundama' Norte Rcaurte
oeste)' se cultivan vides
departamento de Boyac (5o latitud norte,72" longitud
1)'
con destino a la elaboracin de vinos (Almanza, 201

27

En Colombia las prdidas ocasionadas por las enfermedades causadas

por

hongos y virus son muy limitantes en el cultivo de la vid, porque disminuyen hasta
un 80% de cada cosecha. Reducen la calidad, el vigor y longevidad de los viedos
incrementan los costos de produccin. En el pas hay enfermedades causadas por
hongos son prevalentes debido a las condiciones climticas favorables para el
desarrollo de las mismas. Las principales son: el mildiu, el oidium, la botrytis y la
roya. Tambin se presentan las enfermedades ocasionadas por virus, que causan
deformaciones y redueen apreciablemente el vigor y la longevidad de los viedos.
Las variedades que son ampliamente cultivadas en Colombia son muy

susceptibles

a las enfermedades causadas por hongos y virus. (Ministerio de

agricultura y desarrollo rural, 2008t

En Bolivia para reducir enfermedades y plagas decidieron injertar variedades


productorasenpatronesresistentes,propaganpormediode|cu|tivodetejidos'ya

queseuti|izanpequeosrganosdetejidosdeplantasencrecimientoactivoque
que se les da
se los cultiva bajo condiciones aspticas y controladas a las
el medo de
variadas aplicacones, una de ellas el microinjerto in vitro. utilizan
de sodio al 2%
cultivo Murashige & Skoog, desinfectan con alcoho| e hipoc|orito
(Rodrguez, 2006).

4.3.

Sistemtica del gnero Vitis

LaVitispertenecealordendelasRhamna/es,familiaAmpetidaceaequesedivide
en dos subfamllias: Lecoideae y Ampelideae'

Ampelopsls' Clssus'
La subfamilia de la Ampelidee los principales gneros son

Pathenocissus,Arnpelocissusydentrode|oscua|esestelgneroobjetode
estudio|aVifis.Losprmeroscuatrognerosseuti|izanparafinesornamenta|es.
gnero Vifls se tendrn en
Dada la magnitud y la mportancia econmica del
(Fregoni' 2005)'
cuenta slo las espectes que pertenecen a ella

28

El gnero Vlfls comprende alrededor de 40 especies asiticas, y cerca de 30


especies americanas, pertenecientes a dos subgneos Muscadinia (cuenta con

un

patrimonio cromosmico

de 2n=40) y

comprende

las especies

Vftis

rotundifolia, Vitis vinifera, Vis munsoniana, Vitis popenoei); y Vt|is (cuenta con un
patrimonio cromosmico de 2n=38) (Fregoni, 2005).

4.3.1. Clasificacin taxonmica de Vitis vinifera


Segn Fregoni (2005), la calsificacin taxonmica de Vitis vinifera es:
Reino: Plantae
Divisin: MagnolioPhYta
Clase: MagnolioPsida
Orden: Rhamnales
Familia: AmPelidacea
Genero: Vitis

Esoecie: Vitis vinifera

4.4.

Biologa de la vid

Enlasp|antasdeVidcu|tivadasyobtenidaspormultip|icacnVegetatva'se
consideraquesedesarro|lantrescic|osenfuncinde|periododevida:uncc|o
2003)'
vital, un ciclo bianual y un ciclo anual (produccin) (Pinto' et al'

4.4.1. Ciclo Vital

Coincidentecon|aduracinde|avidade|ap|anta,ycomprendecuatrofasesde
duracinvariab|edependiendode|ascondicioneSambientalesyculturaIeS.

ZY

fase improductiva: desde el ao de plantacin al segundo o tercer


ao

.
.
.

fase de oroduccin creciente: desde el tercer o cuarto ao al sexto


fase de produccin constante: del sexto al vigsimo ao
fase de produccin decreciente: en adelante, hasta el arranque de la
plantacin (Pinto, ef a/, 2003).

4.4.2. Ciclo bianual


Durante el primer ao la vid asegura su perennidad constituyendo y diferenciando
las yemas. Durante el segundo ao, las yemas formadas el ao anterior
evolucionan desarrollando los rganos vegetativos y fructferos. Ambos procesos
son coincidentes en el tiempo en una misma planta (Pinto, et a|,2003)'

4.5.

Fisiologia de la vid

Los nutrientes son absorbidos por las raices; luego se genera una migracin de
savia bruta; para el desarrollo de procesos vitales, tales como la fotosntesis,
por
respiracin y transpiracin por las hojas; la migracin de la savia es elaborada
las hojas primero hacia los rganos en crecimiento y despus hacia los rganos

de acumulacin (Fig. 1) (Raynier, 2001).

30

.{gt:!ltt

Fij rql:

arl 5tr- f!

tc

ci.

i-;:;'l

r't -_'+ t
'-"4 r:" ,.r.r,: t

(Raynier' 2001)
Figura 1. Fisiologia de los rganos de la vd, fuente:

y nutricin'
La intensidad fotosnttca est relaconada con el clima la

La

el da est en un rango de 27
temperatura ptirna para la fotosntesis de la vid en

a3o.c,sisupera35"C|aactividadfotosintticadisminuyeysedetenedebidoa
el suelo son de gran
que los estomas de las hoias se cierran Las sustancias en
importancia,especialmenteN,Mg,Fe,yKsonloselementosindispensablespara
la humedad atmosfrica' la
el proceso fotosinttico. Incluso la temperatura sobre
JI

disponibilidad de agua en el suelo y la intensidad de luz afectan el fenmeno de la


fotosntesis (Fregoni, 2005)
La vid es una planta C3 (solo con el ciclo de Calvin), sin embargo si en los climas

clidos el cultivo est bien fertilizado (N) y tiene buen regado puede proporcionar

una produccin de 1O0kg/ha/ao de materia seca. Sembrar la vid en climas


templado-fro, por el contrario, hay una disminucin de das con temperaturas
ptimas para la fotosntesis y se incrementa la fotorespiracin, por lo que muchos
de los productos primarios de la fotosntesis son consumidos por la planta, lo que
conlleva a que disminuya el llenado de los racimos (Fregoni' 2005).

4.6.

lmportancia, formacin y diferenciacin de las yemas

Las yemas de la vid se encuentran en posicin lateral con respecto al eje del
brote, insertadas en los nudos de las axilas de las hojas. Las yemas estn
cubiertas de escamas y de pelos, dentro de ellas tienen uno o ms ejes, rodeado
por las hojas en la se puede discernir los contornos de los zarcillos (Fregoni, 2005)
4.6.1

Fase de Paralatencia

la
Durante esta etapa gran parte de las yemas (en especial las basales) an tenen
principalmente
capacidad potencial de brotar pero permanecen en reposo, debido

a|adominanciaejercidapor|ayemaapica|y|asanticipadasde|ossarmientos
an en crecimiento. Esta capacidad potencial de brotar se va perdiendo
paulatinamente conforme se avanza en la estacin y el sarmiento va madurando.
la clorofila
Este va perdiendo desde la base su color verde por desintegracin de
claro a oscuro
en las clulas epidermales y tornndose paulatinamente desde caf

debidoa|aacumu|acinde|igninayotroscompuestosfenlicosenlasparedes
celulares (Pnto, ef al,2OO3).

4.6.2. Fase de endolatencia


Durante la endolatencia, a pesar de que no se observan cambios visibles, este es
un estado fisiolgico y bioqumicamente activo, durante el cual se producen
cambios en el contenido de agua de las yemas y en los niveles de reguladores de
crecimento y otras substancias quimicas (Pinto, ef a/' 2003).

En este estado las yemas salen solo si han cumplido un mnimo de horas de.fro
que le permitan pasar a las etapas siguientes (Pinto, ef al' 2OO3)

Las yemas endolatentes de vid poseen un requermiento mnimo de fro para


brotar el cual se satsface mediante exposiciones a bajas temperaturas (Kliewer &
Soleimani, 1972).

4.6.3. Fase de ecolatencia

En la que las yemas a pesar de poseer plenamente su capacidad de brotar,


permanecen en reposo hasta que las mayores temperaturas de la primavera les
permitan su salida de este estado y aseguren el normal desarrollo del nuevo brote
(Pinto, ef a/, 2003).
las
Las investigaciones realizadas a los cambios bioqumicos que ocurfen en

yemasduranteel|etargonohansidocapacesdedefinirta|fenmeno,
la entrada y
especialmente en lo que se refiere a los factores determinantes en

presenta un
salida del letargo. Se sabe que durante la quietud inicial se
la enzima
incremento de la concentracin de cido absccico (ABA) y de
que junto a la giberelina (GA) la actividad enzimtca y la
ribonucleasa, en tanto

respiracinsereducen.A|entrara|aetapadereposomientrasseacumulafro'se
tanto la actividad
reduce el nivel de ABA y RNA soluble, mantenindose estables
enzimticacomolosalmidonesensusnivelesbajosyaltos,respectivamenteAl
fina|deestaetapasegenerancitoquininasygibere|inasqueprovocan|aactividad

delaplantahastalatercerafasedequietudfinal,mientrasquealmismotiempo
aumentae|RNAso|uble,|arespiraciny|aactividadenzimticay|osa|midones

se reducen al convertrse en azcares que son oxdados, lo que favorece el inicio


de actividad de la planta, el que deriva en la apertura de las yemas florales y
vegetativas (Pinto, ef a/, 2003).

4.6.4. Clasificacin de las yemas de vid: evolucin


Existe una escala extendida BBCH es un sistema para una codificacin uniforme
de identificacin fenolgica de estadios de crecimiento para todas las especies de

plantas mono

dicotiledneas. (Fg.

2) describe un nuevo sistema para la

identificacin de las etapas de crecimiento de vid llamado sistema BBCH Se trata


de una adaptacin, para la vid, de una escala bsica que abarca todos los cultivos
de plantas monocotiledneas y dicotiledneas. Existen otros dos sistemas que ha
una preferencia por Coombe ('1995), pero con algunas
dado lugar

modificaciones (Tabla 1 ).

Estas modificaciones se han discutido, y un nuevo sistema de medicin y


descripcin de las etapas de la vid que ofrece una simple enumeracin de las
principales etapas y, al mismo tiempo, ofrece etapas intermedias detalladas
(Coombe, 1995).

4.6.5. Giclo evolutivo de las yemas de Vid: Dinmica


primeros actos del
La formacin y diferenciacin de yemas (pronta y mixta) son los
que se llevan a cabo durante el ao: lo que se lleva a cabo a

subciclo reproductivo
partir de mayo.

yemas
La yema latente (YL) compuesta de la yema principal (YP) y de las

primavera, la
secundarias (YS) est en estado de dormicin en el sarmiento. En
yema principal se desarrolla dando un ramo foliado' las yemas secundaras

permanecendormidas.Anive|deunnudoyen|aaxilade|ashojasseencuentra

unayemapronta(YP)yunayemalatente(YL).LaYPsedesarrollay|aYLentra
endormicindurantee|verano.Ene|otoo'|adormicinde|asyemas|atentesVa

34

desapareciendo progresivamente hasta la primavera siguiente (Fig. 3) (Raynier'


2001).

->->3r*rhds
oo ol 05 09 1t

15

f3

55

ffi#fltl+#
65

63

61

57

6a

f,f-*#rfhfl*
71

75

79

77

wtr{tfl
BBGH' Fuente:
Figura 2. Estadios fenolgicos de las yemas de vid segn
(Meier, 2001)
que en la vid se suele denominar
Apenas brota la yema latente se origina un brote
que se lignifica' es
pmpano. El pmpano se convierte en sarmiento despus
proceso se denomina
decir, ouando adquiere las caractersticas de madera; este
pmpanos se ensanchan en la
maduracin del sarmiento o "agostamiento"' Los
casos' tambin
zona donde se insertan yemas, hojas, zarcillos y' en algunos
racimos.

35

Tabla 1. Estadios fenolgicos de las yemas de vid segn Eichhorn- Lorenz


Fuente: (Coombe, 1995)
Estados

Mayores

Todos los estados modificados de E-L por


Coombe (1995)
1. Yema de invierno

2. Yema hinchada
3. Yema de algodn

Brotacin

4. Punta verde. Tejido de la primera hoja visible


5, Roseta de puntas de hojas visbles

7. Prmera

ho.la separada del pce caulinar

9. 2-3 hojas separadas. Pmpanos 2-4cm long.


11. 4 hoias seoaradas

"QPin
wTU",L#
s;* i .*."\ry,

o\

ilq'
(Raynier' 2001)
Figura 3, Giclo evolutivo: dinmica de las yemas, fuente:

Ese eneanchamiento sa llama nudo y la porcin de bro@ o sermiento comprendida

entre dos nudos, se llama entrenudo (F9.4). Los enhEnudoe son ms cortos en la
base del brote, cerca de su nacimiento en el sarmiento, desps tienen su longitud

normal hasta

el

extremo

en que vuelven a

acofafse.

Con lae

msmas

carac{erlsticas anatmicas del brote, 8 pueden encontrar las feminelas o netos y


los chupones, gue nacn respec{ivamente de las yemas prontas y de madera vieia
o adventicia (Lanzarini, & Mangione,2009).

4,7.

TlpoedeyemaedcVid

1.7.1. Yem

prcnt

se forma en la primavera-verano, diez dfes antes de las yemas m)es, y enen un


(ramo
dEsanollo de poco ms de un meS. Dan origen a un bfob recin formado
anticipado) gue puede ser estril, inrtil o il (Fg' 4) (Ftegoni' 2005)'

Flgura 4. Tlpoo de ysmar de vid, Fuenb: (Lrnzerini &

trnglone' 2l9l

y ee nducida por el
La latencia de las yemae est controlada gencamente
en la primavera despus
fotoperlodo y las baias tamporeturas' Su trmino ocurre
hora frlo'
que las yemas han acumulado una cierta cantidad de
37

Diversas reacciones que ocurren en

el metabolismo de las clulas vegetales


pueden conducir a la produccin de especies reactivas de oxgeno como el
radical hidroxilo (OH), el radical superxido (Oi), el perxido de hidrgeno y el

oxgeno singlete. En general, estas especies se forman por transferencia de un


electrn desde una molcula donora al oxgeno, generando el radical superxido,
que posteriormente es convertido HzOz.
La catalasa es una enzima que se encuentra presente en las clulas aerbicas y
que descompone el perxido de hidrgeno (HzOz) en oxgeno molecular y H2O'
Su rol fisiolgico es eliminar el exceso de HzOz producido durante el metabolismo
celular evitando de este modo su acumulacin y consiguiente dao celular (Pinto'
et a|,2003)

4.7

.2. Yema hibernar, latente o mixta

se forma en la base de la yema pronta, sucesivamente se insertan en la base es


primavera, su ciclo
decir se inicia la agrupacin de los racimos, se completa en la
de
dura aproximadamente 1 ao, durante la actividad vegetativa. Las yemas
invierno no brotan porque estn inhibidos por la actividad del pice vegetativo
(dominancia apical) (Fregoni, 2005).
4.7.3. Yema latente

Son|abasede|asramasquepermanecensubdesano||adasycubiertasporlos
en las ramas' a veces
tejidos formados sucesivamente que crecen en el tronco o

s|odespusdeVar|osaosdesuformacincomoresu|tadodeeventos
particulares (poda drstica, heladas, entre otros) (Fregoni' 2005)'
internos en la planta y se
Luego de la cosecha, comienzan procesos hormonales
perder su clorofila y a tomar los
modifican sus estructuras. Las hojas comienzan a

coloresdelotoo:amarillos,marrones'ocresCuandolashojascaen'laplanta

38

extrae del suelo los nutrentes indispensables que transporta a travs de la savia y

entra en reposo vegetativo hasta la prxima primavera (Lanzarini, & Mangione,


2009).

4.8.

Variedades

Los vinos se derivan del jugo fermentado de la uva. Existen alrededor de 5.000
variedades o (cepas) en todo el mundo (entre naturales, hibridas y diseadas en el
laboratorio), pero solo unas treintena se explota comercialmente. se dividen en
blancas y en tintas y, en general, producen vinos en esas dos categoras. como la

pulpa, en ambos casos es verdosa, la coloracin de los tintos se explica por el


contacto del zumo con la cscara u hollejo (Sabogal' 2007)'
de
No todas las variedades tienen la misma vocacin vitcola. como consecuencia
por ejemplo
las caractersticas morfolgicas de los racimos y de las bayas' como

e|grosorylaformade|asbayas,e|espesorde|ho||ejo,|aconsistenciade|a
pulpa,e|nmerodesemi||as,yenfuncindeldestinodelasuvas,sedistinguen
varias categoras de variedades:

prensaoo'
Las variedades de vino, de bayas jugosas que se prestan al
Gamay'
Garnacha, Merlot, Syrah, Cariena, Cabernet Sauvignon' Melon'
Chardonnay, entre otras (Raynier' 2001)'

bastantes gruesas'
Las variedades de mesa, de racimos sueltos, con bayas

conpulpacrujenteydepielresistente,DattierdeBeyrouth,|ta|ia,Cardina|,
entre otros (RaYnier, 200'l)'

Las variedades destinadas

semilla) y pulpa bastante

(sin
secado, de bayas generalmente apirenas
consistente' Sultanina (B)' Corinto (N)' Perlette'

al

Moscatel de Alejandra y el
aunque a veces de bayas con semillas como el
Rosaki (RaYnier' 2001 )'

20

Sin embargo, ciertas variedades tienen varios usos. Es el caso del Moscatel de
Alejandra que es utilizado alavez como uva de mesa, uva pasa, uva de vino para
la produccin de vino moscatel y de vino para destilar y producir alcohol (Raynier,
2OO1).

4.8.1. Cabernet Sauvignon Vitis vinifera


La Cabernet sauvignon es la variedad tinta que ha tenido ms xito en todo el
mundo. Esta cepa se desarroll en Burdeos y su nombre comenz a ser conocido
hacia finales del siglo XVlll y comienzos XIX (Rankyne, 1995).

Las bayas pequeas como las de cabernet sauvignon tienen relativamente poca
pulpa; los raspones tienen un pH comprendido entre 4 y 5 debido al bajo contenldo

de cido libre y el alto contenido de potasio. su contenido en azcar es menor de


un 1o/o y contiene entre 0,5 y 3,5o/o de polifenoles en peso; estos son
leucoantocianos

y catequinas que tienen un sabor marcadamente astringente y

pueden ser responsables de hasta un 20o/o de contenido de taninos de las uvas


recolectadas. Las semillas contienen hasta un 507o de los mismos taninos y
pueden ser la mayor fuente de estos en el vino. Contiene tambin aceites amargos
de semilla de uva. Las pieles contienen una considerable cantidad de azcar,
normalmente alrededor de un 80% respecto al contenido en la pulpa (Rankyne,
1995).

4.9. Requerimiento de fro


Las exigencias de frio de los diferentes frutales de hoja caduca de las zonas
y
templadas para pocrer salir del estado de receso, varan segn la especie
tambin segn la variedad. El requerimiento de fro de una determinada especie

se mide en unidades de tiempo en que ocurren las bajas temperaturas


a 3oC'
y
estimuladoras, las cuales se han definido como menores aToC superiores
para promover la
las temperaturas cercanas a ooc o inferiores resultan ineficaces

40

salida del receso, esto es en parte, porque estaran inhibiendo la accin de las
hormonas positivas. La unidad de tiempo es la "hora-fro", definindose sta como

hora en que deben ocurrir ininterrumpidamente las temperaturas adecuadas

(3oC-7oC) (Aristizabal,

995).

Los frutales caducifolios requieren de una acumulacin de estas horas para salir
del reposo, emplendose esta acumulacin como un mecanismo de defensa; esto

es oara evitar la brotacin cuando las condiciones ambientales sean favorables


por un perodo en el invierno, con lo cual los brotes jvenes quedaran muy
indefensos a la accin de las posteriores heladas de invierno. Por otro lado, las
altas temperaturas durante el invierno (>= 20oC) pueden reducir o anular los
efectos de la acumulacin previa de fro. El efecto de estas temperaturas depende
de una interaccin entre ellas y la duracin de su exposicin, ya que mientras ms
alta es la temperatura, menor es el perodo necesario para obtener reduccin en
las horas-fro acumuladas (Aristizabal' 1995).

Los frutales de la zona templada, sin embargo, no son capaces de brotar


"horasinmediatamente despus del cumplimiento de horas-fro; se requieren de
de
grado" para provocar la brotacin, definindose este concepto como "el nmero
grados por
horas a una temperatura determinada multiplicada por el nmero de
horas-graclo
encima de una temperatura basal", luego se deben sumar todas las
't995)
ocurridas a distintas temperaturas (Aristizabal,

(* nmero de horas
Por ejemplo, horas a 20oC son 8-(20*-10*-)=80 h/grados
** temperatura sumatoria de |as horas medidas, *** temperatura basa|),
medidas,
las horas-grado
tomando como temperatura basal 10oC' Este mecanismo de

hay riesgo
permite a la planta encontrarse an en estado latente cuando todava

dehe|adasprimavera|esdespusdehabersecump|ido|ashoras-frionecesarias
oara la brotacin (Aristizabal, 1995)'

de bajas temperaturas cle


En ciertas zonas agroclimticas, donde las necesidades
presentan sntomas de
los rboles no son plenamente satisfechas, las plantas

41

receso prolongado, el cual se caracteriza por una brotacin y floracin deficiente e

inegular, y fnalmente en una dsminucin en la produccin y calidad de la fruta.


Para superar estos problemas, se han adoptado distintas medidas, como la
seleccin de variedades de menores requerimientos de fro y la aplicacin de
varios productos qumicos capaces de producir el quiebre del receso, pero no
solamente el requerimiento de fro es importante, sino tambin la edad de las
yemas. La vid es una de las especies con mayor variabilidad gentica, con una
gran cantidad de cultivares exstentes en la actualidad y repartidas en los ms
diversos climas. Esto explica en parte el amplio rango de requerimiento asignado a
esta especie, que flucta entre las 150 y 1200 horas fro (Westwood' 1982)

4.10. Enfermedades de la vid

4.10.1.

Phyum

ocasiona la podredumbre comn de las races de las plantas. Esta es una


enfermedad muy comn en el campo y los invernaderos, donde el organismo mata
a las plantas en los semilleros recin plantados (Jarvis, 1992). Esta enfermedad

por lo general implica relaciones complejas con otros hongos como


Phytophthora y Rhizoctona (Werner, 1 997).

4.10.2.

Rhizoctonia

E|gneroRhizoctoniasecaracterizaporlaproduccindeesc|erociosenuna
plantas'
textura uniforme con redes hifales que unen el micelio con
Rhizoctonia solana se caracteriza por:
Pigmentos marrones oscuros de las hifas

joven
Ramificacin cerca del septo central en la hifa vegetativa

C|ulasmu|tinuc|eadasen|ahifaVegetativajoven(Werner'1997)'

42

4.10.3.

Alternaria

Es un hongo ascomiceto esto es, del filo de las Ascomycotas. Las diferentes
especies de este gnero son uno de los mayores patgenos de plantas.
Enfermedad de la vid causada por un hongo que provoca manchas rojas en las
hojas.

La descripcin de un hongo denominado Altemaria vlfis, patgeno de la

uva,

reportados en numerosos pases han indicado que el organismo invade solamente


tejido foliar dbil o daado y que su incidencia en frutos es mayor cuando stos
son primero daados por insectos (Daz & Bastida, 1971)'

4.11. Gultivo in vitro, propagacin de la vid


ahora
La creacin de nuevos viedos o la renovacin de instalaciones de viedos
cada
imoroductivas, o incluso la sustitucin de las variedades de vid cultivadas

de
ao se requiere la disponibilidad de un gran nmero de plantas dentro

la

variedadelegda,quegaranticeuncomportamientocontendenciahomognea
(Fregoni, 2005).

ais|ar una porcin


E| cultivo de tejidos, como tcnica, consiste esencialmente en

delaplanta(explante)yproporcionar|eartificialmente|ascondicionesfsicasy
o
quimicas apropadas, para que las clulas expresen su potencial intrnseco
planta usada (Fregoni'
inducido y producr un mayor nmero de copias de la
2005).

Elcu|tivoinvitrodep|antaspodemosdefinir|ocomoe|cu|tivodetodotipode
de esterilidad Con este
clulas, tejidos u rganos vegetales bajo condiciones
que influyen en la
sistema de cultivo se pueden regular todos los factores
los requerimientos
produccin y cultivo de especies vegetales' desde

43

nutricionales, pasando por la luz, fotoperiodo, temperatura, humedad, entre otros


(Toms, 1995).

4.'12. Vaiedades, material vegetal y tipo de regeneracin


Para la micropropagacin de vid, las variedades ms evaluadas han sido Globo
Rojo, Criolla Chica, Criolla Grande, Cabernet Sauvignon, Pinot Noir, Chardonay'
Riesling, Moscatel, entre otras (Osuna & Saucedo,2010).

La propagacin comercial de la vid, es mediante enrazamiento de

estacas

dormantes, sin embargo, este mtodo no nos permite un rpido abastecimiento de


material vegetativo. con el xito de los programas de seleccin clonal, los

virlogos, quienes obtuvieron plantas libres de virus, o los fitomejoradores, que


desarrollan nuevas variedades, tienen una gran necesidad de un rpido
abastecimiento de especmenes nicos' Un mtodo que se propone para cubrir
estas demandas de produccin comercial, es la llamada multiplicacin vegetativa

in vitro. segn investigaciones realizadas en Jurez (Mxico) se consider

al

que el
observar el comportamiento de tratamientos con yemas axilares y pices,
de las yemas axilares era el explante para usarse en la etapa de la multiplicacin

de brotes, se tuvieron los mejores resultados para propagacin rn vifro de vid


principio de
variedad Globo Rojo. Por qu las yemas axilares se encuentran en
ya se han
formacin, mientras que las yemas apicales (yema con la primera hoja)
formado y su desarrollo es ms lento n vlfro (Osuna & Saucedo' 2010)'

EnBo|iviaparareducirenfermedadesyp|agasdecidieroninjertarvariedades
productorasenpatronesresistentes,propaganpormediodelcultivodetejidos'ya

queseuti|izanpequeosrganosdetejidosdep|antasencrecimientoactivoque
da
los cultiva bajo condiciones aspticas y controladas a las que se les

se

el medio de
variadas aplicaciones, una de ellas el microinjerto in vitro. utilizan
cu|tivoMurashige&Skoog,desinfectancona|coholehipoc|oritodesodioa|2%
(Rodriguez et

al,

20O6)

44

Segn Galzy mencionado en (Guiazu et

al,

2005) propone para el cultivo ln vlfro

de yemas de vid un medio compuesto por los macronutrientes de Knop diluidos a


la mitad, los micronutrientes de Berthelot y seis vitaminas del grupo B. en trabajos
locales se micropropagaron las variedades realizando la brotacin de las estacas
uninodales en medio de Murashige y Skoog diluido a la mitad adicionado 0.5mg L-

I de ciido giberlico (AGs) y 1mg.L-r de bencilaminopurina (BAP). Para la


desinfeccin del material vegetal lo ms utilizado es cloro comercial (hipoclorito de
sodio 5,25%i.a) con tiempos de 5 minutos a 15 minutos aproximadamente, con
concentraciones de 1% a 50% (Osuna & Saucedo,2010).

4.13. Reguladores del crecimiento vegetal


Las hormonas vegetales o fitohormonas son sustancias qumicas orgnicas que
se sintetizan naturalmente, y se activan en pequeas concentraciones. son
y
molculas especficas involucradas en la induccin y regulacin del crecimiento
desanollo de las plantas. Estas sustancias son sntetizadas en un lugar especifico
y traslocadas al lugar de accin (Hartmann et al' 2OO2)'

Enlapropagacindeplantas,lashormonasvegeta|estienengranimportanciaya
que no slo son parte del mecanismo interno que regula la funcin vegetal, sino

queel|aspuedeninducirunarespuestaespecficaencu|tivo.Tambinexsten
que muestran
ciertas sustancias qumicas, algunas naturales y otras sintticas'
de|
efectos hormona|es en plantas, stos son c|asificados como regu|adores
crecimiento vegetal (Hartmann et al' 2002) '

4.13.'1.1. Auxinas

Las auxinas ms utilizadas en cultivo de tejidos son el cido 2'4


cido Indolactico
Diclorofenoxiactico (2,4-D), el cido Naftalenactico (ANA)' el
sinttcas' Las
(AlA), y el cido Indolbutrico (AlB), siendo el AIB y el ANA auxinas

auxinassonsntetzactasapartirdeL-triptfanoenprimordiosdehoja'hojas

45

semillas en desarrollo. sus funciones incluyen dominancia apical,


estimulacin del alargamiento celular, desdiferenciacin celular, accin sobre

jvenes

tropismos, formacin de capas de abscisin en frutos


crecimiento del carnbium (Hartmann et al,20021.

y hojas, y

activacin del

4.13.1.2. Citoquininas
Las sustancias naturales incluyen kinetina, zeatina, e lsopentiladenina (2ip). La
benciladenina (BA o BAP) es una sustancia sinttica. otras sustancas con
(N-(2actividad de citoquinina son thiourea, difenilurea, TDZ (thidiazuron) y CPPU
cloro-4-piridul)n-fenilurea). Estas sustancias son esenciales para la divisin celular
y su interaccin con las auxinas es una de las relaciones primordiales en la
plantas
propagacin in vitro de plantas. Las citoquininas tambin actan en
la
intactas para retrasar o reducir la senescencia, retardar el rompimiento de
clorofila y las protenas celulares (Hartmann et al, 2002)

4.13.1.3. Giberelinas

Promuevenlae|ongacinde|osbrotesatravsde|adivisiny|ae|ongacin
en altas
celular en tallos de plantas en roseta o de formas enanas. ocurren
el desarrollo del
concentraciones en semillas en desarrollo y tienen funcin en
embrin,|agerminacinycontro|deladormancia.E|compuestocomercia|ms
importante es el cido giberlico (Rojas & Ramirez, 1993)'

4.13.1.4. cido Abscsico (ABA)

Es sintetizado del cido mevalnico directamente

o del rompimento

de

El ABA est presete en


carotenoides, su biosntesis ocurre en los cloroplastos
funcin depende de su
todos los rganos de las plantas superiores pero su

concentracin.Tenesuprincipa|funcinenelcontro|de|asre|acioneshdricasde
tiene funcin en la
los estomas, juega un papel en las reservas alimenticias'
y respuesta de las plantas al
dormancia de yemas y semillas' la abscisin la
el cierre de los estomas y
estrs, particularmente de humedad ya que controla

46

controla la toma de agua y de iones por las races, tambin induce al letargo,
afecta la senescencia y abscisin de las hojas. En la propagacin de plantas est
involucrado en la germinacin y dormancia de las semillas, y juega un papel en la
embriognesis y la produccin de semillas (Rojas & Ramrez, 1993).

4.13.1.5. Etileno
Es un gas de estructura muy simple, sintetizada de la metionina. Los carbohidratos

externos, la luz, las citoquininas, las auxinas y el dixido de carbono estimulan la


produccin de etileno, as como el ACC (un cido involucrado en su sntesis). En

altas concentraciones tiene efecto en la epinasta, senescencia y abscisin de


hojas y frutos. Interaccona en otros procesos como en formacin de races

y las yemas laterales, la produccin de ltex,


diferenciacin del tallo, estimula la germinacin y sobrepone la planta a la
adventicias, estimula la floracin

dormancia (Rojas & Ramrez, 1993).

4.13.2.

Mtodos Quimicos para el control de dormancia in vitro

Diversos productos qumicos pueden sustituir parcialmente el efecto del fro, as


permitir la brotacin y floracin de variedades en lugares de insuficiente suma de

fro, como los subtrpicos o las zonas merdionales de clima templado. An en


zonas de suficiente fro, para una normal brotacin pueden contribuir a una
brotacin, ms uniforme si hay yemas de menor desarrollo o madurez (Gil, 2000).
Existen varios mtodos que se han utilizado para el control de la dormancia tales
como el aceite mineral, azida sdica, extracto de ajo, entre otros; pero el ms
efectivo y ms utilizado es la cianamida hidrogenizada el cual posee la capacidad
de suplir la falta de fro para diversas especies frutales, modficando el periodo de
receso invernal y estimulando precozmente la brotacin (skw-Trostberg, 1987). La
cianiamida se consigue comercialmente con el nombre de Dormex con un 49% de
n.

47

La Cianamida Hidrogenada presenta una composicin qumica simple, siendo sus

N, C

componentes

e H. Despus de la aplicacin el ingrediente

activo es

rpidamente metabolizado e incorporado en los aminocidos de la planta (Ortiz,


1987).

Hoy constituye una prctica comn

la

aplicacin directa

a las yemas en

concentraciones de 1 a 2% en lugares de poco fro para posibilitar la fruticultura;

ya que esta puede producir primores (cerezas, uva), uniformar la brotacin (kiwi,
manzano);

hacer coincidir la floracin de polinizantes (cerezo, peral) (Eres,

1987).
Por consiguiente, uno de los principales efectos por el cual se vincula la cianamida
con el trmino del receso, es debido a la inhibicin de la actividad de las catalasas

(Pinto ef at, 2003). Al disminuir la actividad de la catalasa, conduce a un estrs


oxidativo en varios sistemas, debido al incremento de perxidos de hidrgeno,
Ensayos sealan que la cianamida, reacciona con la enzima hierro de la catalasa,
lo cual provoca la inhibicin de la descomposicin de los perxidos junto a los

cambios oroducidos en los niveles de catalasa despus de la aplicacin de


cianamida hidrogenada. Tambin existen cambios en la expresin de algunos
genes, especialmente de aquel encargado de la regulacin del gen de la catalasa
(Pinto ef al,2003)

4.'13.3.

Metodologias en cultivo de tejidos vegetales

Existen varias vas generales para rcalizat la propagacin vegetal in vitro o


micropropagacin, lo cual depende directamente del material vegetal que se

deseepropagaren|aboratorio,suestadofisio|gico,ysuproduccinde
ya
meristemos y yemas apcales o axilares. si no existe una metodologa
desarrollada,

se

debe experimentar para encontrar una va para

micropropagacin de una planta (Roca, 1991)'

48

la

4.13.3.1. Organognesis directa


sistema para formar brotes directamente de una parte de la planta sin formacin
de callo (Roca, 1991).

4.13.3.2. Organognesis indirecta


Mtodo de estimulacin del desanollo de brotes a partir de callos (Roca, 1991).
4.1

3.3.3. Embriognesis somtica

La mayora de sistemas que forman embriones somticos lo hacen mediante una


ruta indirecta donde las clulas dan origen a proembriones los cuales a Su vez dan
origen a las etapas sucesivas similares a la embriognesis cigtica (Roca, 1991).

4.13.3.4. rganos de perennidad formados en cultivos asptcos


papa,
Algunas plantas producen estos rganos in vitro como minitubrculos en
por medio
tallos bulbosos en lirios, cebollas, etc., y los protocormos en orqudeas,

de los cuales es posible realizar siembras directas o

almacenamiento de

germoplasma (Roca, 1 991 ).

4.13.3.5. Cultivo de embriones


nutricionales de
El cultivo de embriones es usado para estudiar los requerimientos

embrionesendesarro||o,pararescatarembrioneshbridosdecruzamientos
y para superar la latencia
interespecficos e intergenricos, producir monoploides'

delassemi|lascausadaporinhibidoresoporfactoresmecnicos'Asmismo,el
de embriones
cultivo de vulos ntactos se ha empleado para el rescate
y embriognesis
(polinizados y fertilizados in vitro), para inducir callognesis
dependen de fuentes
somtica, y se aplica en casos donde los embriones
embriones que se obtienen
externas de nutrimentos como en las orqudeas. Los

delassemil|as,sonais|adosindividualmenteygerminadosinvitroparaobtener
no es una tcnca cle
una planta por explante. Aunque el cultivo de embriones
micropropagacinoclonacininvitroenunsentidoestricto'esunatcnicadonde
49

se cultiva el germoplasma para su multplcacn, el cual de otra manera

se

perdera (Roca, 1991).

4.13.4.

Etapas de la propagacin in vitro

Para iniciar la propagacin in

vitro se requiere de la seleccin del inculo

apropiado, la eliminacin de los microorganismos que se encuentran en la


superfice de los inculos (que es a lo que se le denomina desinfestacin), la
seleccin del medio de cultivo apropiado para el inculo, as como las condiciones
adecuadas de incubacin para el desarrollo del mismo (Barba ef al' 2001).

4.'13.4.1. Obtencin y establecimiento del explante in vitro


La micropropagacin puede iniciarse prcticamente a partir de cualquier parte de
la planta: rganos, tejidos o clulas. La eleccin depende de los objetivos que se
persigan y de la especie que se vaya a propagar. se tiene que tener en cuenta la
calidad de la planta madre, la edad fisiolgica de la planta madre y del inculo,
poca del ao, tpo y tamao del inculo (Barba et al,20O1).
4.'13.4.2. Desinfeccin de los inculos

Las plantas invariablemente llevan adheridos en su superficie externa diversos


microorganismos (como bacterias, hongos y levaduras), que de no ser eliminados
previamente

a la siembra, contaminarn los medios de cultivo

afectando el

en el
desarrollo de los inculos. Entonces, para obtener resultados satisfactorios
del
cultivo rn vitro, es necesario establecer un mtodo que permita su eliminacin
material biolgico mediante una desinfestacin (Barba et a\,2001)'
la
La desinfestacin es la eliminacin de los microorganismos presentes en
qumicos (hipoclorito de
superficie externa de los inculos mediante agentes

calcio, hipoclorito de sodio) (Barba ef

al

2001)'

50

4.13.4.3, Seleccin del medio de cultivo


Como organismo multicelular, una planta es el resultado de las divisiones mitticas

sucesivas del cigoto. Cada

lula de la planta

completa posee

la

misma

informacin gentica. Para el crecimiento y desarrollo in vitro del material vegetal

la planta es necesario que el medio de cultivo contenga todos


aquellos nutrentes, vitaminas y fitoreguladores del crecimiento de las clulas'
separado de

Debido a que cada planta tiene necesidades nutricionales especficas, no exste

un medio de cultivo de uso general (Tabla 2). El medio de cultivo puede usarse
con una consstencia semislida o lquida. Cuando se emplea semislido el
material de soporte que generalmente se usa es el agar, el cual gelifica el medio,
mientras que cuando es lquido el material de soporte puede ser papel filtro, fibra
de vidrio. entre otros (Barba ef al,2001).

Tabla 2. Medios de cultivo y condiciones experimentales utilizadas para la


iniciacin y multiplicacin "in vitro" de las diferentes variedades fuente:
(Toms,1995)
Proocolo

N"l

mmvcmo

Exphnto
Mcdio Bse

3fu,/l-

Protocolo No3

Prolocolo No2
aprcal

lls-\ii

\LS

Srclrrr

2mg.''l

\ls+\'r
.

r tsxok)

ln(!,]|nudo, nflorcscen

r erin

B\

30g,rl.

$c.e

l mg

i$S

2-tD

1m8/L

Bi

ts+\'rr

\LS

30g,/l, Scro6,2mg

B\

6U,/L agaf

Suplemcotos

fotopcrirdrr

Iluninacin

Ostud

mcundad

fngmenrs de cdlo

B(nes

Erplmto

\g+\-n.

lils+\rr tS

IfS.\ u \l-\

iUS

Medio Bse

Slplemcntm

30g,rl Srcarose ?mg/1.

Bt

4l'L

\t

3i4r'L Sacaxr 2mg B.\ 2rng,/L

Ilumicin

4.13.4.3.1. ComPonentes

a. Carbono
b. Nutrimentos
c. Vitaminas

minerales

51

\.\

gn- fgat

Xg/ L Srclrosx lmS B.\ 6Srl. .\gr

d. Agente gelificante (en caso de medios semislidos)


e. Sustancias reguladoras de crecimiento

f. Otros compuestos (Roca, '1991).


Generalmente se hace referencia al conjunto de componentes a + b + c como
al medio basal (MB)

4.13.4.3.2. Preparacin del medio de cultivo


Es necesario preparar el medio utilizando agua destilada o agua desm
El procedimiento para la preparacin de los medios depender,

in

eralizada '

en

primera

instancia, del tipo del medio, de su consistencia y de la presencia de componentes


termolbiles. En general, se pueden distinguir:

a.

Medios semislidos sin sustancias termolbiles (lncorporacin del medio

basal(MB),delosreguladoresdecrecimiento,ajustedelpH;Adiciny

b.

disolucin del agar; Esterilizacin en el autoclave) (Roca' 1991)'


Medios lquidos con o sin sustanca termolbiles. Para su preparacin se
el mismo procedimiento de a', pero sin adicionar agar (Roca'

sigue

199r ).

c. Medios semislidos con una o ms sustancias


(lncorporacin

termolbiles

de los compuestos que pueden ser esterilizados

en

en
autoc|ave, ajuste de| pH; Adicin y diso|ucin de| agar; Esteri|izacin
sustancia(s) termolbil(es)'
autoclave; Incorporacin

de la

el

previamenteesteri|izado(s)porfiltracin;Distribucindelmedioen|os
recipientes de cultivo) (Roca, 1991)'

4.13.4.3.3. Desinfeccin
Para establecer cultivos aspticos es conveniente:

Trabajar en ambientes adecuados


Esterilizar los medios de cultivo

52

Desinfectar superficialmente los explantes, liberndolos

de bacterias y

hongos exgenos

Realizar los cultivos respetando ciertas normas de asepsia (Roca' 1991)

Hay una vasta gama de compuestos qumicos que se pueden utilizar como
desinfectantes para los explantes, pero en la actualidad es casi generalizado el
empleo de etanol (7\o/ovlv) y de hipoclorito de sodio (Naclo) del 1o/o al 5.25o/o
contenido en productos de uso domstico (agua de lavandina). En algunos casos
resulta til el agregar algn agente tensoactivo (por ejemplo, Tween-2o). Despus
de tratar el explante con las soluciones desinfectantes es necesario remover del l
los restos del producto, mediante varios lavados con agua destilada estril,

haciendo un mnimo de tres enjuagues sucesivos (Roca' 1991 )'


precso
Por asepsia en el establecimiento y ulterior manipulacin de los cultivos es
adoptar algunas Precauciones as:

a.Antesdecomenzar'desinfectar|amesay|asparedesde|acmaracon
los
etanol 70%. lgualmente es conveniente desinfectar la parte externa de
la
recipientes que contienen los medios de cultivo, antes de introducirlos en

cmara (Roca, 1991).

b.

cu|tivador
Es necesario que |as manos y, eventua|mente, |os antebrazos de|
'1991)'
sean desinfectados con etanol 70% (Roca'

c.Losinstrumentosmet|icosempleadossedebenf|amearpreviamentecon
etanol al 95% (Roca' '199't).

d.Rea|izar|asoperacionesdetransferenciaydiseccin|omscercaposib|ea
la llama de un mechero (Roca' 1991)'

4.13.4.4. Incubacin en condiciones adecuadas

Latemperatura(de20a30.Cgenera|mente)y|a|uz(l2hdiariasde|uminosidad,

hasta|uzcontinua,yde1000al0000lxdeintensidad)son|osfactoresfsicos
al' 2001)
ms importantes para et desarrollo in vitro (Barba et

4.13.4.5. Enraizamiento

El enraizamiento satisfactorio de una microestaca es fundamental para


sobrevivencia de las plantlas generadas

la

in vitro. La generacin de un sistema

radical puede inducirse antes o despus de extraer la microestaca del recipiente


de vidrio. Es ms eficiente enraizar en terreno por costos y beneficios que en el
mismo medio, ya que, las ventajas que trae en el ambiente externo es que regulan
sus mecanismos fisiolgicos al mismo tiempo de la induccin de races, lo que
representa una economa en tiempo y costos (Barba ef al' 2001)'

4.13.5.

Factores limitantes al culvo in vitro

4.13.5.1. Contaminacin
por
La contaminacin de los explantes se puede presentar en forma exgena

cuando se trata
deficiente esterilizacin del material vegetal o en forma endgena
1993) En el curso
de contaminantes sistmicos difciles de controlar (seemann,

de|crecimientode|asp|antas,haymuchosmicroorganismosde|aSuperficeode

larizsferaquepueoencolonizarlaplantaatravsdeaberturasnaturales'
que pueden
y
heridas, etc., adicionalmente hay patgenos facultativos obligados
plantas hospederas (seemann'
colonizarla, o penetrarla va vectores o mediante
1993).

4.13.5.2. Oxidacin

La|uzy|aespeciesonfactoresdeterminantesen|aoxidacindeespectesen

que son condconantes para que se


cultivo rn vitro. Adems existen otros factores
produzca oxidacin (Margara, 1 988)'

que se presenta con mayor


El pardeamiento de los explantes es un problema

frecuenciaenexplantesdeespecies|eosasysere|acionaconlaliberacina|
medioyoxidacindepolifenoles,quedancomoresultadoproductostxicospara
el exPlante (Seemann, 1993)'

54

Tanto los explantes como el medio de cultivo de algunas especies, sobre todo
leosas. una vez puestas en cultivo in vitro, tienen la tendencia a manifestar un
pardeamiento que, en forma extrema, lleva

a la muerte de los explantes Este

pardeamiento se produce por accin de enzimas oxidasas que contienen cobre,


como las polifenoloxidasas y las tirosinasas, que se liberan al herirse los tejidos.

La inhibicin del crecimiento de los explantes, por otro lado, ocurre por

la

oxidacin de los fenoles y la consecuente formacin de compuestos quinnicos,


altamente activos (Seemann, 1 993).

4.13.5.3. Fenolizacin
Durante el cultivo

in vitro el explante sufre siempre en mayor o menor

medida

situaciones de estrs, ocasionadas por daos mecnicos o por las condiciones del
cultivo in ylfro (como la composicin del medio). Estas situaciones estimulan el
producir una
metabolismo de los compuestos fenlcos. La sntesis de fenoles va a
reacciones de hipersensibilidad, tales como la exudacin al medio del

serie de

contenido de las

oue inicialmente

lulas deterioradas. De igual forma, las clulas vecinas de las


fueron lesionadas se ven afectadas, incluso aunque esas lulas

general, los
no parezcan estarlo, llevando finalmente a una muerte prematura. En
generados por la
fenoles son sustancias lbiles y fciles de oxidar. Los productos

alterar eventos
oxdacn tienen carcter fitotxico, por lo que son capaces de
ocasiones
morfogenticos y/o de crecimientos y desarrollo, potenciando en otras

otros procesos de oxidacin, puesto que se convierte en potentes oxidaciones


(Afanador, 2005).

fenoles no
Otros mtodos que han dado buen resultado cuando la sntesis de
puede evitarse son: |a dispersin, adsorcin o |avado, con sustancias como el
del potencial
carbn activado (cA) o la polivinilpirrolidona (PVP); la modificacin
oxigeno' |a
redox (disminuyendo los agentes redox), o las disponibi|idad de
y
sistemas como la
inactivacin de enzimas de tipo fenolasa (quelantes)' otros

incubacinencondicionesdeoscuridad,bajopH,incubacinatemperaturasms
proporcionar estas condiciones
bajas, entre otros. En general lo que se busca al
55

es reducr la actividad fenolasa y la disponibilidad de sustratos para esta enzima


(Afanador, 2005).

La adicin de sustancias antioxdantes, es otro de los mtodos que

suelen

aplicarse, aunque es necesario tener mucho cuidado, ya que se pueden convertir


en oxdantes muy potentes, invirtindose su efecto positivo en el control de los
fenoles (Afanador, 2005).

segn (Rivero, et at,20o1), presume que existe una relacin entre la oxidacin y
yfiis
la posicin que ocupa e| nudo en |a rama, ya que en cu|tivos como |a uva (
vinifera L.), se ha detectado un efecto significativo de la posicin de los pices'
que en
determinando menor contenido de compuestos fenlicos en los laterales
los terminales, con la consecuente reduccin de la oxidacin'

4.13.5.4. Vitrificacin
herbceas y
La vitrificacin es un problema que se pfesenta en ciertas especies

|eosas,ysere|acionaconprob|emasfisio|gicosquedancomoresu|tadoe|
transplante
desarrollo de tejidos vtreos, translcidos de difcil sobrevivencia al
(Seemann, 1993)

56

5.

MATERIALES Y METODOS

5.1.

Localizacin

La presente investigacin se llev a cabo en el "Laboratorio de Biotecnologa


Agrcola" de la Facultad de Ingeniera Agronmica de la Universidad de Ciencias
Aplicadas y Ambientales U.D.C.A. ubicada en Bogot D.C.

5.2.

Materiales

5.2.1. Material Vegetal


Los explantes utilizados para la presente investigacin, fueron estacas lignificadas
con mnimo dos yemas, obtenidos de plantas v. vinifera L. Var. Cabernet

sauvignon, los cuales fueron suministrados por el Viedo Ain Karin de Villa de
Leyva Boyac, que se encuentra a una altitud de 2145-3000 msnm' con una
de
temperatura promedio de l3-'16'c y noches frias, alcanzando temperaturas
3"C. Las estacas lignificadas que se manipularon para la siembra se encontraban

enestadosuno(1)ydos(2)segn|ac|asificacindeLorenz(Coombe,1995)
para yemas de vid. Se consider el uso de yemas axilares, ya que en los trabajos

realizadosporOsunaenel2010,ycorroboradosentrabajospreviosenel
stas
|aboratorio 2oog-2011, se encontr que para |a variedad Globo Rojo'
ms rpido a los procesos de diferenciacin en comparacin a las
respondan

vemas termnales.

5.3.

Materiales Para siembra

5.3.1. Preparacin de explantes para la introduccin


Sauvignon (yemas
El material colectado en campo plantas de vid var' Cabemet
en un litro de agua en
con segmento de tallo) era almacenado para su transporte

so|ucinconcidoascrbico(0.5g/L)ycidocitrico(0'5g/L)porunmXimode
que las yemas empezaran procesos
tiempo de dos das Este tratamiento evitaba

57

de oxidacin previo al prooeso de intoduccin in vitto. En el laboratorio las yemes

eran lavadas con jabn desinfectante (Protex @). Posteriormente el materal era
segmentado y separado en frascos de vklrio, donde, ee separaban las yemas tpo
1 en un frasco diferente a las yemas tipo 2. En el momento del corte se aseguraba

la yema con un segmento de tallo (Fig. 5), y de ahl

ptocedla

a realizar la

sembra.

Figun 5. tteril vegetrl yem con egmcnb de tllo, ncln aembrdo ln


viho

5.4.

Trtmientoc eveluldol pen le introduccin yemar n vfro

5,t.1. Eveluclonoa

Prellmlnru

Lostfatamientospropustosrespondenaunaseriedeobservacioneequesa
que los tiempos de lavado
obtuvieron cle nsayqs prelmineres, donde se encontr
de|
para deeinfeccin inferiores a l0 minutos, independiente de |a concentracin
y bacterial a partir del
agente desinfectante, permitlan el cecimiento filngico

explantasembrado,Raznporlacualnosetuvierongncuentiatiemposinfofiorg$

alcitado.Deigualforma,etoemismosensayospermitierondeterminarqueel

empleo de agentes antioxidantes en el medio no era un formula tan efectiva para

el control de oxidacin, como s lo era el enjuague del explante con cido


ascrbico por un tiempo no mayor a 5 minutos.

5.4.2. f atamientos propuestos


Bajo condiciones de cmara de flujo laminar, se evaluaron dos tipos de yema

a las cuales se les realizaron lavados para la desinfeccin


variando la concetracin del agente desinfectante hipoclorito (1.5 y 5%) y dos
(invierno, algodn)

tempos de lavado (10 y 20 minutos).

De igual forma se evalu la aplicacin de cido ascrbico en concentraciones de


0.5g/L para evitar problemas de oxidacin de los explantes.

Todos los explantes que se llevaron al proceso de introduccin in vitro fueron


tratados con un fungicida (Benomil) en concentraciones de 4gll.
De tal forma, la interaccin factorial de tratamientos fue:

2* x2** x2*"*

tratamientos

*2 tipos de yema (x y y
)

**2 concentracones de hipoclorito

*.-2 tiempos de desinfeccin


**** Presencia o ausencia de agente antioxidante

Se utilizaron 2 testigos; uno con yema tipo invierno y el otro con yema tipo
y
algodn, los 2 testigos se manejaron con interaccin del agente desinfectante
del agente antioxidante (tabla 3).

qo

Tabla 3. Protocolo de desinfeccin; se observa cada una de las etapas


llevadas a cabo para cada producto.
njuague

concertracin de

llaoo fempos lOO

5 mn en:

10

min

2U mtn

Jabn

10 mn

20 min

Antordarte

Yem de Tratamaento
lnvarno

T1

Tetigo

T2

Fungicida + Antioxidante

Algodn

Funqicida sn Antioxidante

Testgo

tungcida + Antoxdante

lnvierno

I4

FunEicida sin Antioxdante

Testigo

Fungicida+ Antioxidante

Alsodn

T7

Funricda sin Antioxdante

Testico

T8

Invterno

T9

Fungicida sn Antioidante

Testigo

f10

Fugcida + Antioxidante

Algodn

Tl.1

Funscida sin Antioxidante

Testi:o

112

Funrlcda+ Antioidante

lnverno

T13

Fungicda sn Antoxidante

Testgo

f14

Fungicida + Antoxidante

Algodon

T15

Funscida sin Antioxdante

Testito

Funqicda

0esinfectante

tuntkda

+ Antioridante

Funsicida sn Antoxidante

Funsicda

+ Antioidante

TA

Testgo Absoluto

Para el montaje de los tratamiento de la fase uno, se utilizaron tubos de ensayo


con capacidad de 20 ml, en los cuales se depositaron 10 ml de medio MS. Por
cada tubo de ensayo, se sembr un solo explante (segn el tipo de yema), el cual
corresoondia a la unidad experimental. La contaminacin fngica o bacterial'

sobre el explante, nos daba a conocer la presencia del agente patgeno (Fig.6a).
La ausencia de contaminacin permiti evaluar la oxidacin y/o el desarrollo
radicular o caulinar de los explantes.
se
Luego de obtener los resultados apropiados se realiz un trasplante, donde,
utilizaron frascos cte compota con capacidad de 50m1, a los que se les adicion

15ml de medio por frasco (Fig. 6b). Los medios se ubicaron el en Laboratoro
Biotecnologa del bloque

o de la sede de la universidad de ciencias

Ambientales.

60

cle

Aplicadas y

b)

Figun 6. a. Primera frre (regmento de tallo + y6ma po elgodn e Invlsmo


(yomar vlvag in
embrad in vtto medlo f,s % parbr). b. segunda fe3o
parba)
algrln egente contrmlnenb mmbrede ln vito medlo tS %
5.1,3.

(Bioenaeyo
Variableo evluad en loa plotocoloc de dlnfeccln

l{l)

considerando:
se evaluaron les rcspuestss de tos explanGs a los trataminto8
Para el primer ensaYo:

Ausencia

presencia

de

conaminacin'

En caso de

en@ntrar

se clasific segrin el po de patgeno en: filngico o


patgeno' ste se
bacteriano' Para la determinacin Especifica del po de

contraminacin

ais|parasusiembrayposteriorreconocimientoenmediodecultivoPDA.
para connuar con la
Los explantes contaminadoe fueron descarbdoo
evaluecin'

61

b. Ausencia o presencia de oxidacin: los explantes que no se contaminaron

se les evalu la oxidacin con una escala de puntaje de 1 a 3; donde 1 es


ausencia con un 10% de contaminacin,2 presencia moderada con un 50%

de contaminacin y 3 oxidacin total. Los materiales que se consideraron


con puntaje 3 fueron descartados en la evaluacin de brotacin (Azofeifa'
2009).
Desarrollo de brotes: en esta variable se consider la diferenciacin caulinar

de la yema.
Para el segundo ensayo:

a.

Desarrollo caulinar: respuesta de brotacin-crecimiento caulinar

b.

Desarrollo radicular.

5.4.4. Evaluacin estadstica


y
considerando la interaccin de variables, el alto nmero de tratamientos el bajo
prueba Z; la
nmero de repeticiones, se recurri a un anlisis estadstico con la
permite probar la diferencia de los efectos de los factores principales

cual

muestra
evaluando el efecto de la variable independiente sobre la media de la
principales
(Pagano, 2006). Para probar la diferencia de los efectos de los factores
y para las interacciones de dos factores se hizo una prueba de Chi2 el cual se

terica
utiliza para verificar el ajuste a la normalidad, o a cualquier otra distribucin
de probabilidad (Arvelo, 1998).

5.4.5. Toma de datos


que se asign a cada
Se realizaron tablas (Ver Anexo 13) segn la numeracin
fenolizacin se aislaban
caso de contaminacin bacteriana y/o fngica, oxidacin o

oseretirabanporcomp|eto;as,tdejarenobservacin,3exc|uirde|ensayo.Cada
tercerdiaen|aSemanasehaca|atomadedatosconcincolecturasrea|izadas,
esto se llev a cabo en un perodo de 2 aos aproxmadamente'

5.5.

Preparacin de medios de Cultivo

Procedimiento de desinfeccin de medos: La preparacin de los medios se realiz


con tres (3) das de anterioridad a la siembra y se esterilizaron en un autoclave a
15 P.S.l. en un transcurso de una hora. Para el desarrollo del protocolo se utiliz

un medio MS

modificad

o en /, partes (ver anexo 1), al que se le adiciona

Sacarosa 35gramos/Litro Myoinositol lOOmiligramos/Litro (Azofeifa' 2009)'

63

6.

RESULTADOS Y DISCUSION

6.1.

Evluecin de cobrevlvencia fare

6.1.1. Efacto de

h concentrecin dol hlpoclorito ds odlo

Las concentraciones de hipoclorito evaluadas no fueron influyentes en la limpieza

de fttopatgenos en las plantas utilizadas; ya que ms del 5070 de log materiales


sembrados bajo condicioneE in vitto se eliminaron por contaminacbn agentes
bacterianos, filngicoo y de oxidacin.

El porcentaje de sobrevivencia para

corrcentracin del 1.57o irdependiente de

las dems variabtes fue del 20.830/o, mientras que para la concentracin del 5%
fue figeramente superior en tan solo un 4.160,6, es decr un25oA en total (F9. 7).

Segrln

el

anlisis eetadfstico, no hubo diferencia significativa entre los doe

tratamentc (Ver Anexo 5).

S
t

25o/o

<

20%

oPo

1s%

E
o

le/o

e
o

Gs%
o%

.'%

So/o

Porccntrlc de Gonc'ntrtcln dc ilaClO

porcentaie de
Flgura 7. Porcentrle de cobevlvencia de loa explenbo w el
C' Sawignon
concenfecln del dealnfsctnb pre le Intoduccln In vto

64

El mayor porcentaje de sobrevivencia se present en las concentraciones


hipoclorito al 5%, al contrario de lo que menciona Fregoni (2005), 37o

de
de

hipoclorito de sodio por 15 minutos o'10% de hipoclorito de sodio por 5 minutos,


seguido por tres lavados sucesivos inmerso en agua destilada, cada 10 minutos.
(Fig. 7) esto lo confirma osuna et al (2010) en su trabajo de investigacin de
propagacin in vitro de vid variedad globo rojo donde dice que para mantener los
explantes libres de contamnantes se sometieron las yemas axilares y pices de

vid al 50% de cloro comercial y este tratamiento mantuvo libre de contaminacin


bacteriana y fngica a los explantes, aumentando as el porcentaje de
sobrevivencia de los explantes.

Individualmente se ve el porcentaje de los agentes que promovieron la eliminacin


de los explantes a causa de la contaminacin bacteriana, fngica, y por oxidacin
(Fig. 8). La contaminacin se midi por tubo de ensayo, en presencia o ausencia
del agente contaminante, ya que, se podia presentar contaminacin bacteriana o
fngica solas o ambas en un mismo tubo de ensayo.

con concentraciones del agente desinfectante al 1,5% se elimin un 12,5Vo de


explantes por contaminacin bacteriana, y al subir este agente al 5%, aumento
tambin la contaminacin bacterial eliminando un 16,70/o de explantes' Para el
caso de la contaminacin fngica el porcentaje de explantes elimnados se
y
incremento considerablemente, un 63% con la concentracin baja de hipoclorito
anterores
un 54% con la del 5% del agente desinfectante (Fig. 8)' Los resultados
por
permten deducir que los hongos son ms sensibles al hipoclorito de sodio; y
la contaminacin por causa de este patogeno en

esta razn, se dsmnuye


por la cual el
concentraciones altas. con las bacterias no pasa esto, razn
Lo
crecimiento de las bacterias es ms favorable en estas con@ntracones'
los explantes
anterior se observa en el trabajo de Prez & lvarez (2002) dnde
agitacin por 5
son nmersos en una solucin de hipoclorito de Sodio al 1% con

min obtenindose ausencia de agentes fngicos


bacterana.

65

pero no decontaminacin

70%
I

600

so%

co

Io

0"

! Baderiana

te ox

r Fngica
rOxidadn

to

20oa

Elow
o

e0%

1.5%

5%

Porcenlic de Concencln de NrGIO

F|gure8.Porcentrtede|oorgenteaqueprcnovieron|e||minac|nde|oo
pr. |a
exptanter vr e| porcentrje de |e concenfc|n de| deo|nfctanto
infoduccin In vto C. reuvlgnon
que para la
Para |a concentracin a| 1,5oh |a oxirJacin fue de| 29,17% miefitras
es decir, un
concentracin del 5% fue |igeramente superior en tan so|o un 8,3306 ,
que a concentracions atas
,loh enbtal de Explants eliminadoa. se establece
el porcentaje de oxidacin es mayor mientras que la contaminacin de
(2010) en su trabajo
frtopatgenoe dbminuye, esto lo conobora osuna & Saucedo
37

deinvesgacindepropagacininvittodevidvariedadg|oborojodondediceque
paramantener|osexp|antes|ibsdecontaminantessesometbronlasygmas
axilaresypicesdeda|50%dec|orocomercialyestetrdamefltomanvo|ibre
de contaminacin bacteriana y fringica a los exphntes'

que los tiempos de hipoclorito


Teniendo en cuenta lo anterior podemos inferir
wa|uadosnofueroninfluyentesen|adeeinbccinde|asp|antasuti|izadas;ya

quemsde|50%de|osmateria|essembradoseeeliminafonporagentes
bacterianoe, ftingicos y de oxHacin'

66

El porcentaje de sobrevivencia con relacin al tiempo que se trabaj (Fig.


donde, a tiempos de 10 minutos se logra un

20 minutos se logra un

20.84o/o

25o/o

9)

de plantas vivas, y a tiempos de

de plantas vivas, se evidencia que no hay una

diferencia marcada entre los tempos, esto en relacin al tiempo de inmersin en


hipoclorito de sodio.

Segn

el

anlisis estadstico, no hubo diferencia significativa entre los dos

tratamientos, (Ver Anexo 5).

Segn Villegas (2008), encontr que no existen diferencias entre los diferentes
tiempos de exposicin de las semillas de bolaina al hipoclorito de sodio , siendo
10,20
los resultados de esterilizacin de las semillas favorables en un 100% a los
que
y 40min., esto deja en evidencia que la procedencia de los explantes y el trato
juega un papel importante
reciben al momento de ser cosechados y transportados
los mismos (Hartaman et al, 2OO2), lo cual se refleja en la

en la asepsia de

complejidad y efectividad para esterilizar el material a propagar

67

go

25%

l,P

zoot

rsx

?6

'to%

g
o

ao

E
o

e
o

o5%
10

min

mln
zu min
20

TIarPo

Figura 9. Porcentele

d ohcvlvench de loE erphnbc vs empo de

fnnefn cn el deoinfectrnte para la inoduccln In vlto de C' Sauvlgnon


con
El mayor porcentae de sobrarivencia se present en tiempo de exposicin
que rnenciona Osuna &
hipoclorito a 10 minutos (F'S. 9), de acuerdo con lo
y
(2010), en evaluaciones de desinfeccin con tiempoo de 5'7 I minutos
Saucedo

a mayor tiempo
en hipoclorito de sodio, aqr.retlos exphnbs que son expuestos
pfEsntandafiospofquemadurasynecrosambntoconl|evandoa|ap|antaah
mueftg,cabemenconarqueelporcenajedehipoc|oritouti|izadoporosuna&
comercial'
Saucedo (2010) fue del 50% de hipoclorito de sodio

Loeporcentairsc|econtaminacinbac.terianaindicanque|aaccinde|aumento
ndepndiente d la
del tiempo de elposicin, con el agente deeinfectanta es

contaminacinobtanida,yaqueentiernpoedel0minutoselporcentaiede
contaminacinfuemenorenun12,5016,encomparacinconlos20minutosde
podrla suponer que el efec'to
exposicin al agente deinbc{ante (Fg' 10)' Se
ms tiempo de e)gosicin la
esperado fuera contrario a lo obtenido, entre
contaminacin bacterial disminuyera'

70%

60%

5oo

I|,
t
t

oo

r Bac*oriana
r Fngice
r Oxldacn

soe

to

!o

20%
roor

e0%

20 mn

TLmpo

Flgun t0. Potcentete de loa egcnbe que pomoviercn le elimlmcln de loa

exp|anbcwthmpode|nmer|nene|deinfctenbpea|e|ntroducc|nIn
vl0ode C. Sauvignon
Elporcnta?delagentefrlngicoquepromovilaeliminacindelosexplantesa
que a tiempos de 20
empos de 10 minutos fue del 66,670 de elqlantes mientras
que los hongos son ms
minutos se elimin el 50% de explantes. se deduce

sensibtesatiempos|aryosenhipoctoritodesodioyporesaraznsedisminuye|a
bacteriana'
contaminacin frlngica y se favorece ta contaminacin
explantes mintras
Para tiempoE de 10 minutc la oxidacin fue del 16'670/o de
un 50% de
que para tiempos de 20 minutos frn superior en un 33'337o ' es decir'

explantgsentota|.Seestablecaqueamposaltose|porcentajedeoxidacines
esto lo
mayor mientras que la contaminacn de fitopatgenos disminuye'
procesos de oxidack5n son
conabora Azo,feih (2009) quien afirma que los
causadosprincpa|mentepore|efecloabrasivode|agentedesirrfecfanteap|icado
tiempoe bajos la oxidacin es
durante la asepsia del explante; para el caeo de los
aumenta'
menor mientras que la contaminacin de fitopatgenos

69

En cuanto al porcentaie de soblevivencia que se obtuvo con relacin al tipo de


yema que se trabaio, se encontr que la yema tipo algodn obtuvo el mayor
porcentaje de plantas vives con un 37,50, mierirae que la yema tipo inviemo
obtuvo un menor porcenaje con un 8,33Y0 de ptantas vivas (Fig. l1). Teniendo en

cuenta lo anbrior s detemin que la yema de po algodn tuvo una mejor


respuesta en el porcentraie de sobrevivencia baio condiciones in vitro (Fig' 11).

osuna ef at (2010) conftrma que l mor tipo de explanb para usfifse en la etapa
de multiplicacin de broes eon las yemas axilares, por esta razn esta
investigacin trabaj en determinar cul de las yemas axihres era h ms indicada,
observndose que la rema tipo algodn fue h que meior respuesta obtuvo.

segn

el

anlisis estadlsco, hubo dibrench s{nificava entrc los do6

tretemientos, (Ver Anexo 4).


4096

35%

6
I 30%
E
o
g

oo

25%

5 20%
o
!
o

E
tr
o
C'
o
o'

15%

f0%
5%

0%

Algodn

InYlsme
lnviomo
TPo

d.

YOtn

el po de yema

Flgun lt. Polcent le de obrevlvenci de loo crplantes


prra f lnboduccln in vttrc de Vttls vtnllen var' G' Sawlgnon

algodn que se lograron estabbcer bajo


Los explantes provenientes de yemas tipo
radlcu|ar incipierrte en cuanto el
condiciones in vitro, c|esano||aron un crecimiento

nrlmro de ralces por explante, pero oon buen vigor, ya que estas eran de un
grosor considerable. No se evidenci el secimiento de pelos absoentes sobre
estas rafces (Fig. 12).

Figun 12. Vlt inferior formcin dc niz y c'llo, xplenb de yema po


algodn, concentrecln l 5%, y empo de t0 mlnutoo
de
El porcentaje de sobrevivencia que se obtrvo con elacin a ta aplicacin

anoxirlante(cidoascrbico)fueun2g,17o/odeplantasvivasconlaap|icacinde
de anoxidante (Fig'
antioxklante y un 16,67% de plantas vivas sin ta aplicacin
por ende se determin gue la
13). Hay una diferencia porcentual de un 12,50%
aplicacin de antioxidanta reduce

mortalHad de exphntes bajo condbbnes in

tdro para el mabrial Vitis VinifenYar' Cebemt Sauvignon'

Segrlne|an|bigeEtad|stico,nohubodibrenciasignificativaentrelosdos
tratamentos, (Ver Anexo 5).

71

o
o

oEo

o
o
!
o

15%

o
o

10%

o.

Sin Anlioxklante

Con Anoxidante

Aplicecln ds Antloxldnb

F|gunt3.Porcantr|o3ob'lv|vencde|ooexphntov|ap||Gc|nde
noxfdens pera la Introduccln ln vltode C. Sauvlgnon
aunque
La aplicacin del antioxidante aumsnte la sobrevivencia de los explant'e8,
para el anlisis estadleco no existi diferencia significativa, en el laboratorio las

ptantasa|asquese|egadicione|antioxidarrtetuvieronunamejorreepuesta(Fig.
'13). Eetoe mismos reeuttados lo corfrma Rodrlguez ef al (2006)' en su
investiacin,dondehoxidacinfuecompletamentenulaenmicroinjertacnde

vid,graciasa|uEodeantioxidantesap|icadosdhec,tamentesobfeloscortesde|
injerto.

La apticacin del antioxirjanie tambin favorece

eliminacin

de

patgOnos

como
gracias al pH cido que produce el cido ascrbico, el pH ee considerado

unade|aspropiedadesqu|micasmsimportentBdebidoa|significativoebcno
queejercesobrcelrendimientodebscu|livos.ElefectodelpHeobrehongos
constuyen los doo
ectomiconcicos hongG y el grupo de bac,terias actinomicEtos

grandesgrupoodemiooorganismoode|suebyelpredominiodeunouotfogrupo
pH y del contenido de
de lae condiciones locals, epecialmente del
depende

humedad (Pereira et al,2g07l, est demostrado, ya que en alimentoo es aplicado


pera su consawacin y eliminacin de patgenos 6omo se encuentra enunciado
en infoagro (2012) que el hatamiento de alimentos en una atnefera modificada

con pH inbrior a 4,6 puede inhibir la multplicacin de agentes patgenos, como


se muestra en la fqura 14 donde la contaminacin baderiana fue del 16,87% de
explantes y la fringlca del 50% de explanbs para el tratamiento con antioxidante'
en el cual s observe un incremento de estos patgen6 para los tratamientos
donde no se eplic el antioxklante.
70%

**'l

9soxE
t,

*n'

r Bec'teriane

fro*,
g
o

Fngica

r Oxidacin

20%

.,

prox

ol
o
9

o%*

Sin Antioxi<lante

Con Antioxidante

Apllcacln dc rnoxidnte

expfanbo

qtr

Ptomoviercn lr ellmincin de loo


de C'
le aplicecin de anoxidnb p' la Inboduccln ln vi0o

Flgure 14. Porcentaie de

lol

agentea

Sauvignon

8.2.

Eveluecln

ycme
d l conconfrcln de ileGl, tiempo de NGl' po de

y apllcacln do anoddnbo venus el porcentaie do brotrcin

produjo el
El porcentaje de brotacin donde la yema po algodn
que
porcentaie con un 37,5% de expbntee, mientras

mayor

h yema po inviemo prcdujo

un menor poroentale con un'l2,5ch de exPhntes (Fig. 15)' Con base en lo anterior

se determin que la yema tle po algodn obtuvo una ncjor respuestra en la


brotacin bajo condiclonee in vitto, este resu&ado era de esperarse, ya que, el
mayor porcentaje de plantas virras en relacin al tipo de rema ftre la de tipo
algodn.

segrin el anliEis eetadfstico, hubo difeencia s(niftcativa entfe lo8 dos tipoe de
yema, ya que la probabilidad obtenida es de 0'(H5 que es menor de 0'05 (Ver
Anexo 4).
40%
35%

gt

30%

e
25%
o
E
o 20%

o
e
o

o.

't5%
10%
50

0%

Algodn

Tlpo de ycma

ln
Flgun f5. Porcentele brocln w el po de yeme pen la lnoduccin
vltlo de Wk vtntienvar. G. Sruvignon

E|porcenajrdebroacinconrelacinalaap|icacindeantioxirlante(citlo
y un 16'67% de brotacbn
ascrbico), con un 33,330 de broacin con antioxidanb
porcentual de un
sin la aplicacin de anoxklante (Fig' 16)' Hay una dibrEncia

'16,67o/o,porerdessd'eterminquelaaplicacindeantioxidanteaumentala
brotacindeexp|antesbajocondicionesinvihoparae|materia|VisVinienYar.

74

Cabernet Sauvignon. Esto tiene relacin al porcentraje de plantras vivas que


obtiene gracias a la reduccin de la oxidacin por el citlo ascrbico.

Segrin

el anlisis

estadleco,

no hubo dibrencia s[nificativa ente los

doe

tratamientos, (p=0,18) (Ver Anexo 5).

zu""
E
e

Io 20%
E
,u,,
o
e

10%

Con

Anoxidante

AnQxoa e
sln Antioxidante
Sin

Apllcrcln dc Anorld.nb

Figunf6.Porcente|edeplentalv|vcw|aep|icec|nde|ntioxidentg|os
expfrnbl perr inoduccln rn vlto de Vits vlnifenvtr' C' Sawignon

6.3.

Elhnlncilin de exphnoc a trav del tlempo

E|nmerodeeQ|arrtesetiminadosporebdode|aoxklacin,contaminacin
que la prirnera semana
fiingica y bacteriana, en las lec{uras realizadas se observa
innecesarias (Flg. 17)'
tue decisiva para los explantEe y, ms de cinco lec'turas son

75

,\
,r
,

0'

o
Eo

,t

,l
t.\
t\

E
.E
UI

itt
,r.

o 20
o
c6 15

- - - - Suna deEllmiltacin

t\

ii,'\',^.
:/.r

CL

; ..
/.."\.

to

z=

\*.

i- '

\,

8teriana
Fungica

oxidacion

'\

:.-:'-..\
Lccturas Rcdlzadas

Flgura 17. Nmeo de explanbs elimindos v el nmero de lecturag


c.
realfzdc cada brcer dle para la inoduccin ln vtbo de vls vlnlfcte vz.
Sawignon

O.[. Evalucln

del

porcenteie

de motlldd de explanbr por

contemincinftlngiceybacbr|eneYollu3empoyconcentraolnde
t{aGlO
sembrar el
Para la observacin de contaminacin en el bioensayo 1 fue neceeario

hongoenunap|acaconmediodecu|tivoPDA'seespere|cfecimientopor
espacodelSdlas.Yenunalminaportaot{etoe'seaadiunagobdeazulde
y se disperc en un
lactofenol se tom una pquea muesfa del tejido
el microocopio
portaobjetoa se coloca el cubreobieto y linalmente se observa en
paradeErminare|agentedelacontaminacinhongo/bacteriaelprocedimiontose

|bvacaboene||aboratoriodeftbpatologfadelafacuftad,donde,soencontr
que la
que era altemarla, pythium y riizoc{onia (F9' 18)' Se evidencia
no Eupra el 10,670 de explantes por tratambnto'
contaminacin bacteriana

76

donde, fos tratamientoe con concentraciones de desinfedante al s% y 20 minutos


de inmercin generaron una mayor @ntaminacn bacteriana.

Flgun 18, exphnba contaminedoo por loo patgenos {Albrnri, Pylum,


Rhizocbnle)
Es probable que ol aumento de hs bec{erias en stos tratamientos 8e deba al
tiempo que duraron inmersos los explantes, ya que, por esta razn se aumenta la
humedad del explante y, facilita el crecimiento de las bacterias. Los tratamiontos
con menor @ntaminacin fr1ngir:a y bac'teriana son los de concentracin 1,5o4 a20
minutos y concentracin 50 a 10 minuto, en el que no se encontr contaminacin

bac'teriana

para el

antsrior aterniento (FS.

77

19).

,s%l
**]

I zog :

60%l

$son1

f lox,

Badedana

i*n
-q

r Fungica

20%

E 10%.

I
e

o*i
I

Tiempo y Porcentrie de concentr'lcln de NrCIO

Flgun 10. Porcentrie de mortlldd de explenbs por conrmlncln


bctcrln o ftlnglca w el tl,cmpo do Inmerin y le concanlcln del
delnlbctnb

para le Inoduccin ln vl:o dc Yltis vlnlfenvar. c. sauvlgnon.

78

8.5.

Eveluacin con doo vaiablo de la concsnfcln de NaGlO, empo de


NeGl, po de yema y eplicacin de anofdante

veru el poltent e

de obevlvench

plantas vivas que se obtuvieron con telacin a las


concentraciones de hipclodto de sodio de 1,5o y 5% a tlempc de 10 y 20
minutos, el porcsneie de eoHevivencia de explantes que ptoduio mejor8

El

porcentaje

de

resuttados s encuentra en las cOncentraciones de 1,5o/o a 20 minutos

An

41,670

y 5o/o a'10 minutos con 50% (Fig. 20).

oo"

.to soe6
at,

Io

zoolo

ro"

g
e
o

o'

o%

[ ,'""-

5%l

Tiempo y porcentrie de concencln de ilaGlO

Figun20.Porcentrtedegobev|vencivr|aconcenc|nde|dosinfect.nb

yeempodeinmeo|ndc|ooexp|rnboFrh|ntroducctnInvlodeC.
Seuvlgnon

y concentraciones
Esto demuestra que a conceftfaciones bajas, tiempos largos
de oxplantes' ya sea' por
alas, tiempos cortos, funcionan bien en la desinfeccin
conentfacin baja o por
una laqa exposicn del explante al desinEctante en una
una concentracirSn atta; Eslo
una corta expqs'lcin del explante al d6infecfante en
y que tran eensible sea a
depende del po de explanb que se utilice

h oxllackln'

Por medio del anlisis estadstico se observ que la concentracin 5% de


hipoclorito de sodio y tiempo de 10 minutos, presenta una diferencia significativa
que no se evidencia en la figura 20.

Este procedimiento evala la hiptesis de las proporciones medias de las 4


muestras son todas idnticas. Tambin genera un reporte grfico de medias
(ANOM) (Ver anexo 7) paa determinar cules medias son significativamente
diferentes de la media global. La prueba de chi-cuadrada compara cada uno de
los valores en la muestra con su media global. Puesto que el valor-P es menor

que 0,05, existen diferencias significativas entre las muestras con un nivel de
confianza del 95% (Ver Anexo 6). Este reporte muestra las proporcones
observadas para cada una de las 4 muestras. En este caso, hay una muestra que
es significativamente diferente de la media global al nivel de confianza del 95%.
Esta muestra se indica con un asterisco y es la que sale de los lmites de decisin
(Ver Anexo 8)

El porcentaje de sobrevivencia que se obtuvo con relacin a las concentraciones


(algodn
de hipoclorito de sodio de 1,5% y 5% y tipos de yemas que se trabajaron
e invierno), donde, las yemas tipo algodn produjeron el mayor porcentaje de

p|antasvivas(Fig.21)conun41,670/odeexp|antesaunaconcentracinde|1,5%

deNaC|oyun33,33%deexp|antesaunaconcentracinde|5%deNaC|o'
16'67% de
mientras que las yemas tipo invierno produjeron un porcentaje del
sobrevivencia de
explantes a una concenrracin del 5% de NaCIO y un 0% de
explantes a una concentracin del

1,5o/o

de NaCIO'

80

Figun 21. Explenb do yema po elgodn, concenbdn al l'5%' 3n P?'ooeto


de

crcimlenb Y enralzemiento

Conbaseen|oanteriorsedebrminquelayemadEpoalgodntuvounamof
resptFgtaenelPorcgntajedesobfgt/ivenciabajocorrdicionesinvibo.Laprdkla
fisiolgico en el
de tantos explantes de yema de po invbmo se debe al desanolto
y
que 3 Enctrcntra la yema, ya qu6, la yema tipo algodn est ms desanollada
para brotar; Mientras la yema
ss muestfa hinchada, por b cual 8e encuenta ac'tiva
ha salirlo de su dormanca (FiS' 22) esto se puede conoborar

tipo inviemo no
yemas de d citada por
segrln la tabla de estadlos de Eichhom Lorenz de las
Coombe (1995).

81

45%
40o/o

.E 350

o
co

300
!

oco
o

25%
2004

o
? 15%
o

cE

o
c
o

10%
5o/o

0o.h

t-

Algodn

Algodn

lnviemo

1,5%
yeme y Porcent le dc conccnbacln de NaCIO
de
Tlpoo

Flgura 22. Porcentaie de cobrcvivence v3 ol po de yemr y la concentncin


del declnfectana parr la Introduccln ln vlto de C' Sauvignon

de las 4
Este procedimiento evalrla la hiprteeis de que las proporciones medias
cada uno de
mueatras son todas idnticas. La pnreba de c'triqadrada oompafa
qr.re el valor-P es mayor o
los valores en la muestra con su media global' Puesto
igualque0,05,nohaydiferenciassignificativasentrelasmuestrasconunnvelde
confianza del 950' (Ver Anexo 9)

a las concentraciones
El porcentaje de eobrcvirrencia que se obtwo con relacin
,|,5% y 5% y |a ap|icacin del antioxidarrte (cido
de hipoc|ofito de godio de
ascrbico),|oskatamientosqufueronnmersosene|antioxidante,plodujeronun
mayorporcentrajedep|antasvivag,en|asdosconoentracionesdehipoc|oritode
en un 25o de
sodio, se obeerva la conceniracin del 1,5% con antioxidante

explantesvivoe,yenla@ncentracindel5%conantioxidanteenun33'34%de
explantesvivos,sndoestG|oSmayofesva|oresconrespctoalostratamientoe
ejerce un conirol
sin antioxidante (Fig. 23). Eeto muestra que el antioxidente

82

poeitvo sobre la oxidacin de los elglantes que se encuentran baio condicionee,h


vto.
35%
30%

zson

20%
a

Ersw
oo

9.
5

10%

g5%
o
co%
Con Anoxidarte I Sin Anoxidente i Con Anoxident I Sin Anoxidento
1

,50/o

Apllc.cln do Ant,oxld.nt3 y Porcent|. de

conotntt'cln d' NICIO

Figura23.Porcentr|edeobrgv|vcnciawte.p|icc|nde|enox|denby|a
C'
concontracfn def dssinlectente par la Inboduccln In vlto de
Seuvlgnon
proporciones medias de lae 4
Eete procedimiento evala la hiptesis de que las
cads uno de
muestfas son todas klncas. La prueba de chi-cuadrada compara
que el valor-P es mayor o
los valores en la muestra con su modia global. Pueslo
las muesEs con un nivel de
igual que 0,05, no hay diferencias significativas ente
confianza del 95o' (Ver Anexo 10)

83

6.6.

Evluacln con do varlblec de la concencln de l{ClO' tiempo dc


aplicecln de noxldnbc vecu el
NaGlO, po de yerne

porcentrle de brctcin
El porcentaje de brotacin que se obtuvo con relaci$n a las concentracioneg de
hipoclorito de sodio de 1,5% y 5% y tipoe de yemas que se habaiaron (algodn e
inviemo) (Fg.24).

Figura 24. Explanto de yema po elgodn, concentacin

1,5%' en poceoo

de crcclmleno

Las yemas po algodn produjeron el mayor porcentae de brctacin con un


y
brotacin del
41,67ohde explanbs, a una @ncantrackin del 1,5% e NaClO, una

33,34%deexplantes,aunaconoentracindel5%deNaClO,mientrasquelae
de
yemas po inviemo produjeron un lnem,r poroentaje de brotacin con un 8'33%

explantes,auna@ncentracindel1,5o/deNaClO,yunabrotacindel16'67%de
en lo anterior
explant$, a una @ncentracin del 50,6 de NaCIO (F9' 25)' Con baee

en
se determin que la yema de tpo algodn tuvo una mejor respuesta
brotacin baio condiciones in vio'

la

45%
40%

35%

IJ

6 30%
E
o 25%
o
E 20%
o

15%

o
o 10%
G

50h

0%

Tlpo de ycma y Porcentalc de conccntrcln dc NGO

Figun 25. Porcentrie de Brctacin w el po de yeme y l conconfecln del


desfnfectante prra la Inoduccln ln vlto dc wis vlnlten var. c. sauvlgnon
las 4
Este procedimiento evalrla la hiPtesis de que las proporciones medias d6
de
muestras son todas idnticas. La prueba de chi-cuadrada @fnpafa cada uno
o
los valores en le muestra con su media global. Puesto que el valor-P es mayor

igualque0,0S,nohaydiferenciassignicativasen8elasmueshasconunnivelde
confianza del 95%. (Ver Anexo 'l 1)

Elporcerfajedebrotacinconrehcina|asconcentracionesdehipoc|oritode
|os
sodio de 1,5% y 5o y la ap|icacin de| anoxfolante (cdo asdrbico)'
tratamientos que fueron inmersos

en el antioxidante, Prcdueron un

rnayor

porcanajedep|anasvivagen|asdosconcentracionesdehipoc|oritodesodio'se
de explants' y la
observa la concentracin 1,5% con antioxklanle en un 33'33%
ho
con anoxirlante en un 33,33% de explanhs' siendo eEtos
conoentfacn 5%

mayofsva|oregconregpectoa|ostraamierrtossinanoxidante(Fig.20)

85

35%
30%

zsot

zo"r

!F rsr
tI

o
o'

rox
s%
o%

Apllccln do ntloxld.nte y Porcontrlo d. cofiGonttcln de

Figun 28. Porcentale de Brocln

il.Clo

w lr aplicecin del anoxldenie y le

concentacln dcl dssinfectnb par la infoduccin ln vlto de

Ws

vlntfcm

var. C. fhuvQnon
Este prooedimiento evala la hipteeis de que laa proporciones mediag de hs 4
mu6tres 8on todas idntcas. La prueba de chi-cuadada compafa cada uno ds
los valores en la muestra con Eu media glObal. Puesto que el valor-P es meyor o
igual que 0,05, no hay diferencias significativas entre las mueetras con un nivel de
confianza del 95%. (Var Anexo 12)
la
La baja brotacin de los explanbs puede deberse a fac'tores ambbntaleg como
falh de tempefahras ms elevadas o adecuadas para la brotecin o incluso
lo
deficiencia en la cantllad de horas de frio que requiere el exphnte esto confirma
que la8 yemas a
y
Pinto, et al, (2003) donde habla de la fase de ecolatencia dice
peear de poseer plenamente su capecidad de brotar, peflnanecen en reposo haste
que las mayores temPeraturas de |a primavera, en cuanto a |a candad de horas

frio,Kliewr&solaimani(1972)dicequelasyemasendo|atentesdevidpoeeenun

requerimientom|nimodefr|oparabrotarelcualsesasfacemediante

exposicones

a bajas temperaturas esto a su vez lo confirma Aristizabal

(1995)

diciendo que las exigencias de fro de los diferentes frutales de hoja caduca de las
zonas templadas para poder salir del estado de receso, varan segn la especie y
tambin segn la variedad.

6.7.

Evaluacin de sobrevivencia fase 2

Esta fase se desarroll de acuerdo

a lo observado sobre los explantes en el

laboratorio determinando visualmente cuales tratamientos fueron mejores, con


base en lo anterior se replicaron los tratamientos de concentracin 'l .5% de
NaCIO; tiempo de

20 minutos y concentracin 5% de NaCIO; tiempo de

10

minutos, para los dos se utilizaron yemas de tipo algodn e invierno.

El porcentaje de explantes que brotaron con relacin a las concentraciones de


hipoclorito de sodio de 1,5o/o y 5% y tipos de yemas que se trabajaron (algodn e
invierno), donde, las yemas tipo algodn obtuvieron el mayor porcentaje de
explantes brotados con un 80% de explantes, a una concentracin del 1,5% de
NaCIO

y con un 60% de explantes brotados, a una con@ntracin del 5% de

NaClO, mientras que las yemas tipo invierno obtuvieron un menor porcentaje de
explantes brotados, con un 20% de explantes a una concentracin del 1,5% de
NaCIO

con

40o/o

de explantes brotados a una concentracin del 5% de Naclo

(Fg. 28).

que
Las yemas tipo algodn obtuvieron tambin el mayor porcentaje de explantes
y
crecieron, con 60% de explantes a una concentracin del 1,5o/o de NaClo con
yemas
60% de explantes a una concentracin del 5% de Naclo, mientras que las
tioo invierno obtuveron un menor porcentaje de explantes que crecieron con un
2Oo/o

de explantes a una concentracin del

1,5o/o

de NaCIO y con 40%

exolantes a una concentracin del 5% de NaCIO (Fig' 28)'

87

de

Las yemas tipo algodn obtuvieron tambin el mayor porcentaje de explantes que

del total de explantes que se trabajaron a una


concentracin del 1,5% de NaCIO y con 20o/o explantes a una concentracin del
enraizaron, con

un

400/o

5% de NaClO, mientras que las yemas tipo invierno obtuvieron un porcentaje del
20o/o de explantes enraizados, a una concentracin del 5% de NaCIO y con un 0%

de explantes a una concentracin del 1,5o/o de NaCIO (Fig. 28).

cabe mencionar, que los medios de cultivo que se utilizaron para el desanollo de
este proyecto no se les adiciono ningn tipo de hormona; Lo que nos lleva a
pensar que las yemas que desarrollaron raiz se encontraban influenciadas por
algn tipo de contenido auxinico que se encontraba al interior de ellas, esto lo
Ramrez (1993) donde dicen que las auxinas se sintetizan
principalmente en el pice del tallo y ramas jvenes, en las yemas y hojas jvenes
y en general en los meristemos. con base en lo anterior se determin que la yema
confirma Rojas

&

de tipo algodn tuvo una mejor respuesta y un mejor desarrollo que la yema tipo
invierno bajo condiciones in vitro (FiS.27).

88

Flgura 27. Exphnteo de yeme po algodn var' Gbemet Sluvignon'


a.crccieron b. brotarcn c. enrlzaron
yema
Como se musska en la figura 27 el ephnte de la izquierda brota la
las yemas
anticipada mientras que en el explante del centro y la derecha brotran
qecimiento es ms
y
norma| o |atenb, |a yema arrticipada es de menor vigor su

|ento,|osexp|antegquebrotrarondelayemaprincipa|sonmsvigorosos,estolo
anticipada es la
confirma LanzErini & Mangione' (2009) <ticiendo que la Yema
pequea situada en ta axila de la hoia' Puede desanollarse el mismo
yema
ms

pmpanos de menor
ao de su formacin dando lugar a los nietos, que son
que el pmpano principal'
desanollo y fertilidad y ms incomplto agGtamnto
yema anticipada puede
por tener el ciclo ms rcducklo. Pero el desanollo de esta

deberseaque|ayemaprincipa|todav|anoestuviefe|istaparadearro||arsey|a
o la yana principal 36
dominancia apical de la yema ancipada fuera mayor
yema latente se hubieran
hubiera oxidado y las yemas secundarias de la
la yema labnte compuesta de ta
desanollado @mo explca Raynier (2001) donde
de dormicin en el
yema principal y d las yemas securdarias est en estado
sarmiento.

90%
8096

c.l

x
lu

7U% 60%
50%

to

4096

30%

20%

o
L 10%0%

LI
Algodffi

lrMem0

1,5%

II

Bmtacln

Crecl
EnraE

lfMemo

Algodftl

5%

TIpo dc ycna y Potcfaio de concertdn de lloCl0

F|gure23.Porcentapdeerp|anbequgbrotrcn'cr3cbonyenrazronYe
fn
po de yema y l concenacln del dslnfectnb pre h Inoduccln
vlo do C. Sauvlgnon

que se
Et porcentaie de etplant oxkladoe con relacin al tipos de yemas
porcentaje de yomag
trabajaron (algodn e inviemo) y a la concentracin' el mayor
bastsnte amPlia
oxftJadas fue del 40% de ePlantes, obsfvndos una rcduccin

conregpectoalaoxidacinen|aanteriorfase(Fig.29)Yuefat(1986)han
detectadounefectosignificativode|aposicindeloopicesdevid,determinando
qure en los Gminales'
contenido de compuestos fenlicos en los laterales
menor

con

la

@nsecuente rcduccin

90

de

la

oxidacin'

45%

40%

t
5
E

to

E'
c

!o

35%
30%
25%
zo,v'

lss6

ro*

ts%

0%

Algodrl

ll

Algodn ;

lnviemo

1.5%

Tipo d. yalt. y PorcenJ d.

Inviemo

5%

conc'ntncl d' il'Clo

Flgun 29. Porcentefe de explentec oxldadoo vr el po de yema y la


concentrecln dol dealnfectnb pare la Introduccin tn vip de G'
Sauvlgnon
con
se evidencb que la mayor contamnacn 8e encuefitra en yemas tipo invbmo
pero a
tiempo de 20 mnutos y con una concantracin de 1,5% de NaCIO'
y en
dibrencia de h contaminacin que existi en h fase antorior os msnor

atgunm casos no exieti (Fig. 30).

91

)l
4

ls

-e
x
lu

e2
z
I'

Goncsntrci'n tarclO, Tlenpo y Tpo d.

Ytr

Flgun 30. Nmero de exphnbt que t3 contamlnrcn w l concent.cin del


defnlectants y el tipo dc yema para le Introduccin tn vloo do vts vinlfen
var. C. Seuvgnon
explantes
Durante el desanotlo de egte trabaio se obgerv que algunoo de los

desanotlaronralces,talloyhoiae,esimportantedestacarqueenningunodelos
que la posicin o
medios cultivo utilizados se aplicaron homonas, se deduce
y pof esta
incluso la edad de la yemas ene una diferente irfluencia hormonal

razna|gunasdesarro|laronra|z'tal|oyhojasyotnssolodesano|larontal|oy
que las
hojas, esto confirma lo escrito por flartrnann et at QC21 donde dice
que no slo son parte del
hormonas vegetales tienen gran importancia ya
mecanismointemoqueregu|a|afuncinvegeta|,sinoqueel|aspuedeninducir
una respuesta especlftca en cultivo.

s2

6.g. Protocolo para la introduccin in vitro de Vitis vinifera var. cabernet


Sauvignon
Protocolode
dcsnfeccn

Fungcda

r'tioxrdnle

enjugues c/u de:


5 nlanutos

93

Benoml=4grlL +
Acido scrbco=0.5gr/L

7.

CONCLUS]ONES

La mayor concentracin de hipoclorito 5% en tiempos de 10

mnutos

disminuye notablemente la presencia de fitopatogenos en el medio' adems

reduce los problemas de oxidacin que son notables cuando se aumentan


los tiempos de contacto con el agente desinfectante.

del fungicida en conjunto con cido ascrbico a 0.5 gramos por


litro, sobre los explantes, contribuye en la reduccin de la oxidacin y

La accin

contaminacin.

El mejor tipo de explante es segmento nodal con yema de tipo algodn con
una sobrevivencia superior al 50% siendo esta la ms adecuada para ser
usada en un proceso de introduccin a condiciones ln vltro'

Los explantes usados fueron muy susceptibles a la accin del agente


desinfectante generando una alta incidencia de oxidacin en los tejidos.

Las yemas tipo algodn generan vitroplantas con buen vigor y un excelente

desarrollo caulinar aunque con baja incidencia de races secundaras.

No es necesario la aplicacin de hormonas en los medios de cultivo MS3/


para la diferenciacin de los explantes bajo condiciones in vitro de la vfiis
vinifera var. Cabernet Sauvignon.

94

8.

RECOMENDACIONES

Es recomendable la aplicacin de antioxidantes en el momento de

la

desinfeccin para retrasar el proceso de oxidacin de los explantes entre


los antioxidante que se utilizan estn el carbn activado, el cido ctrco y el
cido ascrbico que fue el que se utiliz en particular para este ensayo, por
esta razn recomendamos aplicarlos para este tipo de material vegetal.

Se recomienda utilizar siempre el medio de cultivo MS en tres cuartas


partes o incluso determinar si se puede utilizar en menor cantidad ya que se
pudo observar en otros ensayos realizados por los autores que un medio
comDleto de MS acelera el proceso oxidativo de los explantes y por esta
razn se utiliz para este trabajo un MS en tres cuartas partes'

Se recomienda para otros ensayos determinar si la posicin de la yema


sobre el sarmiento tiene alguna influencia sobre la oxidacin y la brotacin
del explante.

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'100

ANEXOS

Anexo 1. Composicin del medio de cultivo de Murashige & Skoog 1962


REACTIVO

REQUERIMIENTOS mg-L'

NHNOg

1650

KNOg

1900

CaClzx2HzO

440

KHzPO

170

MgSO x 7 HzO

370

KI

0.83

NazMoOz

x2HzO 0.25

CuSO x 5 HzO

0.025

CoOlz x 6 HzO

0.025

ZnSO x 7 HzO

8.6

H3Bog

o.

MnSO x HzO

r 5.1691

FeSO x 7 HzO

27.25

NaEDTA x2HzO

1.

Myoinositol

100

Acido nicotnico

0.5

Tiamina

0.'r

Piridoxina

0.5

Glicina

Sacarosa

3o/o

Fitagel

5g/L

pH

5.7

101

Anexo 2. Base de datos primera fase

102

Anexo 2. Base de datos primera fase

103

Anexo 2. Base de datos primera fase

104

Anexo 2. Base de datos primera fase

105

Anexo 2. Base de datos primera fase

106

Anexo 3. Bage de detoo regunda faee


arD

lcu

t5

20||f

15

20ddn

l.5

20n

tdlraa
lnvlao

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Ctr

t5
t5

Invlarro

Con

20mln

Alaod.|

Cdr

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Alrodi

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15

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TI

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20

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Con

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15

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15

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Gor

19
19

Co

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ru
ru
ru

I
0
L

0
0
1
1

'otnln

Anexo

1.

Grc pnreba Z pan doo proporcloner con difelncle rignifrcava

107

Anexo 5. Grfica prueba Z pen dos proporcioner ln dilpncla slgnificava

L
Anexo 6. Comparacin de Proporcionee

Porcentrie y Prueba Chiuadrada

DatosA/ariables: porcentaje

Nmero de mueEtras = 4

Tamao de muestra = 12,0

Chi+uadrada

GI

Valor-P

Proporcin media = 0,77075

14,51

0,0023

108

Anexo 7. Reporte ANOM


Lmites de Decisin del 95%

LDS = 1,03

Lnea Central = 0,77

LDI = 0,5't

Nmero de muestras fuera de lmites = I

Anexo 8. Proporciones observadas para cada una de las 4 muestras


Muestra

Tamao

Proporcin

Cont.

[1

,5%]; Tiempo l0min

12

1,0

Cont.

[1

,5%]; Tiempo 20min

12

0,583

Cont. [5%]; Tiempo 10min

12

nA*

Cont. [5%]; Tiempo 20min

12

1,0

= Fuera de Lmites

109

Anexo 9. Comparacin de Proporciones

Porcentaie y Prueba Chi-Cuadrada

DatosA/ariables: porcentaje

Nmero de muestras = 4

Tamao de muestra = 12,0

Chi-cuadrada

ol

Valor-P

Prooorcin media = 0,770833

6,96

0,0732

Anexo 10. Comparacin de Proporciones

Porcentaje y Prueba Ch'

Cuadrada
DatosA/ariables: porcentaje

Nmero de muestras = 4

Tamao de muestra = 12,0

Chi-cuadrada

GI

Valor-P

Prooorcin media = 0,77075

1,29

0,7305

110

Anexo 1 1. Comparacin de Proporciones * Porcentaje y Prueba ChiCuadrada


DatosA/ariables: porcentaje

Nmero de muestras = 4

Tamao de muestra = 12,0

Chi-cuadrada

tt,

Valor-P

Proporcin media = 0,249917

4,45

0,2166

Anexo 12. Comparacin de Proporciones

Porcentaje y Prueba Chi-

Cuadrada
DatosA/ariables: porcentaje

Nmero de muestras = 4

Tamao de muestra = 12,0

Chi-cuadrada

Prooorcin media = 0,250083

1,77

GI

Valor-P

0,6206

111

Anexo 13. Tabla toma de datos

112