INTRODUCCIN

El diagnstico de las enfermedades infecciosas se

realiza mediante la deteccin directa e indirecta de los
agentes infecciosos. Mediante los mtodos directos se
detectan las partculas de los agentes infecciosos y/o
sus componentes, tales como los cidos nucleicos, las
protenas estructurales y no estructurales, los enzimas,
etc. Los mtodos indirectos ponen de manifiesto los
anticuerpos inducidos por las infecciones.
Los mtodos ms comunes de deteccin directa son:
el aislamiento o el cultivo in vitro, la microscopa
electrnica,
la
inmunofluorescencia,
la
inmunohistoqumica, el enzimoinmunoensayo (ELISA
para antgenos), la hibridacin de cidos nucleicos
(NAH), las micromatrices y macromatrices y las
diversas tcnicas de amplificacin de cidos nucleicos,
tales como la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR) o los mtodos de amplificacin isotrmica, como
por ejemplo la amplificacin basada en la secuencia
del cido nucleico (NSABA), la amplificacin isotrmica
mediada por bucles (LAMP). Tambin se denominan
mtodos de diagnstico molecular, puesto que los
ensayos de NAH, de macro y micromatrices y los

diversos ensayos de amplificacin tienen como objetivo

las molculas de cidos nucleicos.
Los mtodos indirectos ms comunes de deteccin del
agente infeccioso son las pruebas serolgicas tales
como: la neutralizacin vrica, la deteccin de
anticuerpos mediante el ELISA y las pruebas de
inhibicin de la hemoaglutinacin,a las que se han
incorporado otras ms novedosas, tales como el
mtodo de los biosensores, la bioluminometra, el
mtodo de la fluorescencia polarizada, los ensayos de
quimioluminiscencia, etc. En general, los laboratorios
de diagnstico aplican simultneamente los dos
mtodos para garantizar un diagnstico seguro.
Las experiencias de las dos ltimas dcadas indican
que las tcnicas de la PCR finalmente sustituirn a
muchos de los mtodos directos clsicos de deteccin
de agentes infecciosos. Est claro que la PCR est
reemplazando el aislamiento de virus o el cultivo de
bacterias para la deteccin de agentes que son difciles
o imposibles de cultivar. Hay varias razones para esta
tendencia, teniendo en cuenta que el aislamiento de
los virus requiere: i) la presencia de los
microorganismos que se replican (virus o bacterias); ii)
cultivos celulares caros y el mantenimiento de las

instalaciones; iii) hasta varias semanas para completar

el diagnstico en algunas ocasiones; y iv) una pericia
especial, que se est perdiendo o disminuyendo hoy
en muchos laboratorios. Aunque los ensayos de la
PCR inicialmente eran caros y engorrosos, hoy en da
son herramientas relativamente baratas, seguras y
fciles de utilizar en los laboratorios de diagnstico (2,
4, 6, 7, 11, 13). Generalmente, la sensibilidad y la
especificidad de la PCR son mayores que los
procedimientos ELISA de captura del antgeno.
La introduccin de varios mtodos de la PCR en tiempo
real, de robots para la extraccin del cido nucleico y
de estaciones de trabajo automatizadas ha dado como
resultado hoy en da a un gran volumen de trabajo y a
ensayos muy fiables, rpidos y slidos para el
diagnstico molecular
.

1.

Principios de la tcnica de PCR

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) implica

que en el ensayo hay una reaccin de amplificacin
basada en enzimas. El trmino "reaccin en cadena"
se refiere a varios ciclos de copiado de un tramo

especfico de ADN, en este caso a partir del genoma

del agente infeccioso. La regin que hay que amplificar
est definida por dos (o ms) secuencias de
nucletidos cortos denominados sitios de los
cebadores, que flanquean a la secuencia diana. Los
cebadores,
oligonucletidos
cortos
que
son
complementarios a los sitios de los cebadores, se unen
a las hebras de ADN para ser copiadas. Utilizando una
polimerasa que no se desnaturalice durante el ciclo de
calentamiento, es posible copiar la secuencia diana
uniendo los nucletidos libres a los cebadores.
Repitiendo el rgimen de ciclos de calentamiento de 20
a 40 veces, la cantidad de ADN diana copiado que se
obtiene aumenta de forma exponencial, produciendo
suficiente para operaciones posteriores, tales como la
deteccin, la clonacin y la secuenciacin. La
sensibilidad de diagnstico de la PCR es muy alta,
porque se producen varios millones de copias de la
diana seleccionada. La especificidad de la reaccin
puede ser tambin muy alta, ya que est determinada
por las secuencias especficas de nucletidos de la
diana seleccionada, as como por el diseo del
cebador. Los cebadores pueden disearse para
detectar secuencias especficas de nucletidos en los
genomas de los agentes infecciosos diana

seleccionados o pueden disearse para ser

complementarios de regiones ms conservadas,
permitiendo de este modo la deteccin de miembros
dentro de una familia o gnero del agente infeccioso.
Se ha publicado una sinopsis ms detallada de las
tcnicas moleculares (17).
a)

Amplificacin del ADN

Si el genoma del agente infeccioso es de ADN, la
amplificacin se realiza directamente, con o sin
purificacin previa del ADN diana. En muchos casos
el empleo de ADN extrado y purificado del material
que se va a utilizar en la prueba, dar como
resultado un aumento en la sensibilidad analtica y
diagnstica.

Amplificacin del ARN (PCR de trascripcin

inversa)
b)

Los genomas de muchos agentes infecciosos

contienen cido ribonucleico (ARN) que no se puede
amplificar directamente mediante la PCR. Para la
amplificacin por PCR se necesita un ADN diana
monocatenario, y ste no est disponible en los
virus de ARN. El problema puede resolverse por la

adicin de una etapa antes de comenzar la PCR.

Utilizando la transcriptasa inversa, el ARN se puede
transcribir a ADN complementario (ADNc), que es
ADN de doble cadena y, por tanto, se puede usar en
el ensayo de la PCR (el procedimiento se denomina
PCR
de
trascripcin
inversa:
RT-PCR).
Tradicionalmente, la reaccin de trascripcin inversa
se realiza en un tubo aparte y el ADNc producido se
transfiere despus a un tubo nuevo para la reaccin
de la PCR. Sin embargo, ya se dispone de
polimerasas de ADN termoestables con actividad
transcriptasa inversa y tampones especficos en los
cuales las polimerasas RT y ADN estn activas.
Ambas permiten una reaccin RT-PCR que tiene
lugar en el mismo tubo en secuencia directa sin
manipulacin adicional y con menos probabilidad de
seguir contaminando. En la mayora de los casos
ser necesario extraer y purificar el ARN antes de la
trascripcin inversa.
c)

Deteccin del amplmero por la PCR

El producto PCR o amplmero puede detectarse
utilizando varios procedimientos. El ms comn
incluye la deteccin no especfica del producto de la
PCR, basada en una medida amplmera utilizando

electroforesis en gel de agarosa y tiendo el ADN

con un tinte intercalado no especfico, como el
bromuro de etidio (ahora es posible reemplazar este
ltimo con tintes no cancergenos, por ejemplo
GelRed, o el reconocimiento especfico de la
secuencia diana amplificada utilizando una
transferencia de ADN por Southern blot seguido de
hibridacin con sondas de oligonucletidos
complementarias de la secuencia diana. Las sondas
de hibridacin pueden ser, enzima, marcado como
quimioluminiscente o radionucletido para permitir la
deteccin de la secuencia diana especfica.
Ms adelante se dan algunos ejemplos de mtodos
de la PCR utilizados actualmente.
2.

PCR convencional

En la "PCR convencional" (o simplemente PCR) se

utiliza un par de cebadores oligonucletidos para
amplificar una parte pequea del genoma del agente
infeccioso. La sensibilidad analtica es relativamente
alta con un nmero mnimo de 100 a 1000 copias de
ADN diana detectable. La especificidad analtica puede
ser alta, dependiendo de la seleccin de la diana, del
cebador designado, y de la optimizacin de la prueba.

La sensibilidad y especificidad analticas se pueden

mejorar mediante la aplicacin de la PCR anidada
(vase ms adelante el punto 3). La especificidad y la
sensibilidad se pueden mejorar posteriormente
utilizando el mtodo
Southern blot seguido de las sondas de hibridacin,
pero esto lleva mucho tiempo y requiere el manejo en
el laboratorio de ADN amplificado, y la interpretacin de
los resultados puede ser tcnicamente subjetiva. Esta
deteccin de los mtodos, basada en la complejidad y
los gastos, no es una prctica comn hoy en da en los
laboratorios de diagnstico.
3.

PCR anidada

En los ensayos de la PCR anidada se utilizan dos

ciclos de amplificacin con cuatro cebadores,
denominados cebadores externos e internos. En
general, los ensayos de la PCR anidada proporcionan
una sensibilidad y especificidad analticas superiores si
se comparan con las pruebas de la PCR
convencionales. Sin embargo existe un alto riesgo de
contaminacin cruzada dado que los productos de la
primera tanda de amplificacin se utilizan a menudo
como molde inicial para la segunda tanda, dando como

resultado la transferencia de material entre los

diferentes tubos de PCR. La PCR anidada ha sido
ampliamente reemplazada por los protocolos de la
PCR en tiempo real, los cuales son igualmente
sensibles, pero tienen un riesgo de contaminacin
mucho menor. La sensibilidad analtica es tpicamente
<10 copias de genoma del agente infeccioso, y la
especificidad analtica tambin aumenta porque, en la
PCR anidada, cuatro oligonucletidos tienen que unirse
especficamente a las dianas seleccionadas para
producir una reaccin positiva (4).
4.

PCR en tiempo real

La PCR en tiempo real difiere de la PCR estndar. Aqu

los productos de la PCR amplificados son detectados
directamente durante los ciclos de amplificacin
utilizando sondas de hibridacin que incrementan la
especificidad del ensayo. Diversos mtodos en tiempo
real, tales como los ensayos que se realizan con las
sondas fluorescentes TaqMan, los cebadores Scorpion,
la transferencia de energa fluorescente mediante
resonancia (FRET), la transferencia de energa con
cebadores-sondas (PriProET), la tcnica del fluorforo
SybrGreen, la tcnica Light- Upon-extension (LUX) y
los ensayos con baliza molecular (Molecular Beacon)

se han convertido en herramientas con mucha

aceptacin para la deteccin de agentes infecciosos.
La PCR en tiempo real se ha utilizado para la deteccin
de bacterias, virus o parsitos de una amplia variedad
de especies animales (2, 4, 14, 17). Estos ensayos
tienen varias ventajas comparados con los mtodos
"clsicos" de la PCR convencional o anidada. En
general, slo se utiliza un par de cebadores,
presentando, a menudo, una sensibilidad prxima o
igual a la PCR anidada tradicional, pero con un riesgo
mucho ms bajo de contaminacin. La fluorescencia,
que indica la presencia del producto amplificado, se
mide a travs de la tapa o del lado del tubo de
reaccin, de forma que no es necesario el manejo
posterior de los productos de la PCR. Estos
procedimientos llevan considerablemente menos
tiempo si se compara con la deteccin tradicional de
los productos de la PCR en geles de agarosa, seguidos
de la tincin con bromuro de etidio o el equivalente a la
tincin de deteccin del ADN con lo que, de nuevo, se
reduce el riesgo de contaminacin. El empleo de la
modalidad de placa de microtitulacin de 96 pocillos,
sin la necesidad de la PCR anidada, permite que el
procedimiento sea automtico y apropiado para
pruebas a gran escala (10, 17). El diagnstico se

puede automatizar posteriormente utilizando robots

para las extracciones de ADN/ARN y el pipeteo. En
comparacin con los mtodos clsicos, una ventaja
adicional de la tcnica de la PCR en tiempo real, es
que es posible realizar ensayos cuantitativos (6, 7).
Utilizando la PCR en tiempo real, el tiempo de
diagnstico puede acortarse de horas a minutos. La
PCR en tiempo real tambin puede utilizarse para la
PCR de trascripcin inversa, usando protocolos de una
etapa, que permiten que la etapa de la RT y la PCR
tengan lugar en el mismo tubo durante el mismo
protocolo de la PCR (17).
5.

PCR mltiple

Se denominan pruebas de PCR mltiple a las PCR que

utilizan cebadores mltiples dirigidos a diferentes
dianas en un nico ensayo. En la PCR mltiple se
pueden detectar y diferenciar de forma simultnea
varios agentes infecciosos en un nico tubo de
reaccin individual. Los diferentes PCR diana
amplificados en una prueba estndar de PCR se
identifican basndose en el tamao del producto de la
PCR. El empleo de los mtodos de la PCR anidada
"clsica" para la construccin de un ensayo mltiple
resulta complicado debido a la necesidad de dianas de

diferentes tamaos, as como de cebadores que

puedan "competir" entre s en la misma mezcla
reactiva, todo lo cual puede repercutir negativamente
en la eficacia de la PCR. Por el contrario, el concepto
de la PCR en tiempo real (pares de cebadores nicos)
proporciona
excelentes
posibilidades
para
la
construccin de sistemas mltiples muy sensibles (2, 4,
9) basados en un tamao ms uniforme de la diana, en
unas condiciones de amplificacin uniformes y en la
deteccin por separado de las dianas utilizando sondas
de hibridacin especficas marcadas con fluorforos
diferentes. Tambin debera advertirse que los
cebadores comunes pueden utilizarse para amplificar
regiones especficas del genoma de un grupo de
patgenos y despus pueden emplearse las sondas
fluorognicas (TaqMan) para discriminar entre los
miembros del grupo. Esta no es estrictamente una PCR
mltiple, aunque podra describirse errneamente
como tal.
6.

Mtodos adicionales de diagnstico molecular

Aunque este captulo se centra en el diagnstico

molecular basado en la PCR, debera mencionarse
brevemente que, adems de la PCR, se estn
introduciendo muchos otros mtodos nuevos para la

deteccin molecular de los patgenos, por ejemplo,

varios mtodos de amplificacin isotrmica (tales como
la amplificacin basada en la secuencia del cido
nucleico [NASBA], tecnologas para la amplificacin
isotrmica mediada por bucles, varias macromatrices y
micromatrices utilizando sondas-candado, amplificacin
de ciclos rodantes y otros enfoques moleculares. Se
estn evaluando otros enfoques para detectar y
analizar los productos de la PCR, tales como MALDI y
LUMINEX. La ventaja de estos enfoques, en
combinacin con la PCR mltiple, es que se hace
posible la tipificacin de diferentes cepas o tipos a
partir de un microorganismo. Es evidente que el
arsenal de diagnsticos moleculares se est reforzando
con estos mtodos.