Universidade Federal do ABC

Disciplina:
Eletroanaltica e Tcnicas de separao (NH 3101)

Eletroforese Capilar

Bruno Lemos Batista

Santo Andr - SP
2015

Site da disciplina

Professor Bruno Lemos:

Site no GOOGLE para disponibilizar informaes da disciplina
Aulas dadas, notas, frequncia, apostila, listas, cronograma, avisos, etc.

https://sites.google.com/site/tqlemos/repositorio

Eletroforese
Fundamento: migrao de ons em soluo sob a influncia
de um campo eltrico (desenvolvida por A. Tiselius em 1930

que foi prmio Nobel em 1948)

Tipos de eletroforese:

Eletroforese de Zona
Eletroforese capilar em soluo livre;
Eletrocromatografia micelar;
Eletroforese capilar em gel;
Focalizao isoeltrica capilar;

Isotacoforese capilar.

HPLC X Eletroforese Capilar Vantagens e desvantagens

HPLC: $ Colunas e Solventes.

CE:
Alta eficincia nas separaes;
Custo;

Consumo ou nulo de solventes;

Versatilidade;
Simplicidade instrumental;
tempos de anlises.
limites de deteco de zeptomol (10-21)

Desvantagem: Preparativas

Eletroforese Capilar em zona (CZE ou CE)

Em HPLC: alargamento dos picos: caminhos mltiplos, difuso

longitudinal e transferncia de massa;

Em CE:
O uso de capilar eliminou:
os caminhos mltiplos

transferncia de massa (ausncia de FE)

Assim reduziu-se o H (altura do prato) e melhorou a
resoluo;
nica fonte de alargamento: difuso longitudinal

Eletroforese Capilar em zona (CZE ou CE)

Aplicaes:

Determinao de DNA,
Peptdeos,
Protenas
Sdio,
Benzeno.

Eletroforese Capilar em zona (CZE ou CE)

Eletroferograma similar ao cromatograma

Resposta do detector

Tempo de reteno

4100
pratos

92000 pratos

Pico

Linha de base

Retorno a Linha de base

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Eletroforese Capilar uma tcnica de separao de molculas
carregadas sob influncia de um campo eltrico.
Ambiente
Termostatizado

Instrumento
Detector (lmpada UV/Vis)

Capilar / Eletrlitos
Fluxo

Fonte de alta tenso

Computador
Eletrodos

nodo

_
ctodo

Eletroforese Capilar em zona (CZE ou CE)

Constituio bsica:

-Fonte de alta tenso (~30kV) com dois

eletrodos de Pt formando o catodo e anodo
-Capilar de slica fundida
-Detector (pode ser eletroqumico, UV/Vis)
-Computador (gerao dos dados)

Poli-imida (15 m,
confere flexibilidade)

Luz
(25-75 m dim.)

Dimenses dos capilares:

-DI de 15 a 100 micrmetros (ordem de

grandeza do dimetro das partculas em

HPLC)
-L de 30 a 100 centmetros
FM o tampo (soluo tampo)

Slica fundida
(330 m de dim.)

Eletroforese Capilar em zona (CZE ou CE)

CAPILARES:

CASSETE

JANELA PARA O
DETECTOR

CAPILAR

Eletroforese Capilar em zona (CZE ou CE)

CAPILARES:

Caractersticas:

-Dimenses precisas e maleabilidade;

-Alta condutividade trmica;

-Baixa condutividade eltrica;

-Resistncia mecnica e ao ataque qumico (inerte);

-Alta transmitncia ptica para 190 < > 900nm.

Eletroforese Capilar em zona (CZE ou CE)

CAPILARES:

-Primeiro uso: lavagem com NaOH concentrado;

-Entre as corridas: lavagem com NaOH (0,1 N ou
outras concentraes);
-Garante a reprodutibilidade dos tempos de
migrao.

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Anlises por CE- Princpio da separao
Mobilidade eletrofortica

SiO

SiO
SiOH

SiO

SiO
SiO

SiO
SiOH
Tampo

Tampo

nodo

1- Introduo da soluo de eletrlitos

2- Injeo da amostra (volume de nanolitros)

Polo positivo

ctodo
Polo negativo

3- Eletrodos e Capilar Soluo Tampo

4- Aplicao de uma diferena de potencial 2 mecanismos de separao.
+
+
+

+
2

1) Fora de atrito
2) Analito (carga positiva)
3) Fora do campo

Quanto maiores a carga, a fora

do campo e menor o raio da
partcula maior a mobilidade
eletrofortica

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Anlises por CE- Princpio da separao
Mobilidade eletrofortica versus Fluxo eletrosmtico influncia do pH

SiO

SiO

SiO

SiO

SiO

SiO

SiO

SiO

SiO

SiO

SiO

SiO

SiO

SiO

Fluxo
eletrosmtico
Mobilidade
eletrofortica

1) pH > 3 os grupos silanol (Si-OH comeam a ser desprotonados SiO-)

2) O excesso de ons + na soluo recobrem os Si-O-;
3) Como ainda h um excesso de ons + na soluo seu fluxo gera uma
velocidade eletrosmtica > a mobilidade eletrofortica para os os -,
arrastando-os para o catodo, assim como os analitos neutros.
4) Quanto > o pH > o n de Si-O-, > fluxo eletrosmtico (p/ catodo)
5) Veletrosmose = (dist. Inj.-detect.) / (tempo migrao analitos neutros)

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos Separao dos Analitos

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Anodo (+)

Alta presso

Catodo (-)

A velocidade diminui com a

proximidade a parede do capilar

Baixa presso

Migrao dos ons gera calor,

efeito joule, da a necessidade
de se controlar a temperatura
Fluxo hidrodinmico em
HPCL: pior separao no
caso apresentado, piora da
resoluo comparado ao
fluxo eletrosmtico (EC)

ELETROFEROGRAMA: 1) naftaleno, 2) acenafteno, 3) fluoreno, 4) antraceno e 5) fenantreno; fase mvel: NH4Ac 16,7
mmol L-1 (60%) e acetonitrila (40%); temp.: 20 C; injeo: -25 mbar por 5 s; deteco: 220 nm (linha cinza) e 250 nm
(linha preta). Capilar: 36 cm (8,5 cm efetivo e 8,0 cm de coluna)

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Fluxo eletrosmtico
(induzido por campo eltrico)

Fluxo laminar
(induzido por presso)

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Mobilidade aparente = mobilidade eletrofortica +

mobilidade eletrosmtica

Ctions versus nions:

Para ctions somam-se as mobilidades

Para nions a eletrosmtica deve ser maior. Se
queremos separar nions em pH baixo inverte-se
polaridade da corrente no instrumento (refletir!).

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Mobilidade aparente (Map)

Map = (Ld/t) / (V/Lt)

Onde:
Ld= comprimento do capilar do ponto de injeo at o detector
Lt= comprimento total do capilar de uma extremidade a outra
V= o potencial eltrico aplicado nas extremidades
t= o tempo para o analito migrar do ponto de injeo at o

detector
Fluxo eletrosmtico: medido pela mobilidade de um composto
neutro (da injeo at o detector UV/Vis)

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Anlise quantitativa

Picos normalizados!!!
Consiste em:

Medida da rea do pico dividida pelo t;

Em HPLC a vazo a mesma p/ todos analitos! Na EC no!!!
Em EC a mobilidade diferente e o tempo de permanncia
no detector tambm!
Precisamos ento normalizar!

Divide-se a rea do pico do analito pelo seu correspondente

tempo de migrao.

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Uma aplicao:

Molculas com tamanhos semelhantes:

Consiste em fazer um escalonamento de cargas:

Acetilao de uma protena qualquer:

NH3+

NH3+

NH3+

NHAc

NH3+

NHAc
Carga zero

Acetilao
NH3

+4

NH3+

NH3

NH3+

NHAc
+3

+2

NH3+

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Uma aplicao:
Molculas com tamanhos semelhantes (eletroferograma):
Protena modificada
(+1, mais lenta)
Protena no
modificada (+4)

Marcador
neutro

130 s

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Uma aplicao
Dados: comprimento total do capilar (Lt) = 84 cm; comprimento at

o detector (Ld) = 64cm; potencial (E) = 25000 V):

O fluxo eletrosmtico ou Veletrosmtica = Ld / t (analito NEUTRO!)
Ento: Veo= 0,64m / 130s = 0,0049 m/s
Mobilidadeeletrosmtica= Veo / (E / Lt)
Ento: Meo = 0,0049 / (25000/ 0,84) = 1,65 . 10-7 m2/V.s
Mobilidadeaparente= Veo / (E / Lt) (para um determinado analito)
Ento: Map = (0,64m/150s)/(25000V/0,84m)=1,43 . 10-7 m2/V.s
Map= Meo + Meletrofortica

Ento: Mef = (1,43 . 10-7) (1,65 . 10-7) = - 0,21 . 10-7 m2/V.s

Em pH 8,3 a Meo >> Mef,
arrastando o analito para o detector

A Mef negativa: protena com carga negativa que migra

eletroforeticamente no sentido oposto do detector.

Eletroforese Capilar em zona (CZE ou CE)

Resoluo:

N = [(Map x E / 2 x D) x (Ld / Lt)]

Onde:
N = nmero de pratos tericos (quanto > melhor)
Map = mobilidade aparente (quanto > melhor)
D = coeficiente de difuso (quanto < melhor)
E = potencial aplicado (quanto > melhor)
Ld = comprimento do capilar at o detector
Lt = comprimento total do capilar
Na razo Ld/Lt constante o N no se altera, ao
contrrio da HPLC

Eletroforese Capilar em zona (CZE ou CE)

Resoluo:

Se o detector passa da posio A p/ B a razo Ld/Lt

diminui e N diminui. Se passa de A p/ C o contrrio.

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Introduo da amostra no interior do capilar:

-Pode ser feita de duas formas:
Injeo Hidrodinmica
Injeo Eletrocintica

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Injeo Hidrodinmica

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Injeo Hidrodinmica

P = diferencial de presso ao longo do capilar;

d = dimetro interno do capilar;
t = tempo de injeo (valor a ser encontrado);
= viscosidade do tampo;
Ltot = comprimento total do capilar.

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Injeo Eletrocintica

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Injeo Eletrocintica

Q = (e + EOF) E t C r2
Q = nmero de moles injetados;
e = mobilidade efetiva do analito;
EOF = mobilidade eletrosmtica;
E = campo eltrico aplicado;
r = raio do capilar;
C = concentrao da amostra;
t= tempo;
= 3,14...

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Consideraes Relevantes Quanto a Injeo em EC

-Sempre usar a padronizao interna (padro

interno);
-Viscosidade da amostra e dos padres devem
ser semelhantes (influncia da temperatura);
-A injeo hidrodinmica geralmente mais
reprodutvel;
-A injeo eletrocintica: a) torna o mtodo
mais sensvel para analitos com alta mobilidade
eletrofortica; b) utilizada para amostras viscosas.

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Modos Empregados em EC

-Normal
-Invertida
-Suprimida
-Micelar** (cromatografia eletrocintica micelar)

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Aqui a Vosm maior levando a partcula com carga negativa at o detector

Aqui a Vef maior levando a partcula com carga negativa at o detector

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

-A dupla camada de surfactante inverte a carga superficial no

capilar.;
-Inverte a direo do fluxo eletrosmtico;
-Aqui a Vosm maior, levando os ons de carga + para a esquerda,
at o detector.

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

-Uso de um composto que se liga a Si-O(diaminopropano) fazendo com que a parede interna do
capilar fique neutra;
-Pouco resistente a pH alto;
-Apenas fluxo eletrofortico.

Cromatografia Eletrocintica Micelar Fundamentos Bsicos

injeo

deteco

Velosm

Velef

-Separao de molculas neutras entre si;

-Velosm>Velef ento analitos neutros no miclio so detectados mais tarde;
-Quanto < tempo do analito no interior do miclio > tempo p ser detectado;
-Relao com HPLC: o miclio uma FE. O analito entra e sai do miclio,
como se adsorvesse na FE e solubilizasse na FM em HPLC!;
-O termo transferncia de massa (CUx) deixa de ser zero!

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Consideraes Importantes Quanto aos Detectores

Empregados em CE

-Seletividade
-Sensibilidade
-Faixa linear

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Deteco por Absoro no UV-Vis

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Deteco por Absoro no UV-Vis (aumento do passo ptico)

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Deteco por Absoro no UV-Vis (aumento do passo ptico)

Clula bolha

Clula de alta
sensibilidade

Clula em
formato Z

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Deteco Indireta por Absoro no UV-Vis

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Deteco por Fluorescncia

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Deteco por Espectrometria de Massas

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Deteco por Espectrometria de Massas

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

Detectores

Eletroforese Capilar Fundamentos Bsicos

O computador fornece o eletroferograma:

Bibliografia
HARRIS, D.C. Anlise Qumica Quantitativa, 6 ed., Rio de
Janeiro: LTC, 2005.
SKOOG, D.A., HOLLER, F.J., NIEMAN, T.A. Princpios de
Anlise Instrumental, 5 ed., Porto Alegre: Bookman, 2002.

Altria, K. D.; Capillary Electrophoresis Guidebook : principles, operation and

application. Humana Press Inc.; Totowa- New Jersey, 1996. 349p.
Da Silva, J. A. F.; Coltro, W. K. T.; Carrilho, E.; Tavares, M. F. M. Terminologia
para as tcnicas analticas de eletromigrao em capilares . Quimica Nova, v. 30,
p. 740-744,2007.
Tavares. M.F.M.; Mecanismos de Separao em Eletroforese Capilar. Qumica
Nova, v. 20, n. 5, p.493-511, 1997.
Tavares. M.F.M.; Eletroforese Capilar: Conceitos Bsicos. Qumica Nova, v. 19, n.
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