Preparaciones de base lquida vs.

citologa convencional:
Adecuacin de las muestras y coincidencia de diagnstico en lesiones
orales
Liquid-based preparations versus conventional cytology:
specimen adequacy and diagnostic agreement in oral lesions

Fbia H Hayama
Dante A Migliari

(1)

, Ana CF Motta

(2)

, Antonio de Padua G Silva(3) ,

(4)

(1) Profesor Asistente, Departamento de Diagnstico Oral, Escuela de

Odontologa,
Universidad Federal de Paran, Curitiba, PR, Brasil
(2) Investigador Asociado, Departamento de Diagnstico Oral, Escuela de
Odontologa,
Universidad de So Paulo, SP, Brasil
(3) Profesor y Presidente, Departamento de Patologa Mdica. Escuela de
Medicina,
Universidad Catlica de Paran, Curitiba, PR, Brasil
(4) Profesor Agregado, Departamento de Diagnstico Oral, Escuela de
Odontologa,
Universidad de So Paulo, SP, Brasil
Correspondencia:
Dante A. Migliari
Universidade de So Paulo
Faculdade de Odontologa,
Departamento de Estomatologia, Disc. de Semiologia
Av Prof. Lineu Prestes, 2227, Cidade Universitria
So Paulo, SP Brasil 05508-900
Telfono y Fax: + (55-11) 3864 1372
E-mail: damiglia@usp.br
Recibido: 5-09-2003 Aceptado: 22-02-2004
Hayama FH, Motta ACF, Silva APG,
Migliari DA. Liquid-based
preparations versus conventional
cytology: specimen adequacy and
diagnostic agreement in oral lesions.
Med Oral Patol Oral Cir Bucal
2005;10:115-22.
Medicina Oral S. L. C.I.F. B

96689336 - ISSN 1698-4447

RESUMEN

ABSTRACT

Objetivo: Comparar la efectividad de

la muestra y la coincidencia de
diagnstico entre preparaciones de
base lquida y frotis convencionales
en lesiones orales, y probar la
viabilidad de la prueba inmunocitoqumica en preparaciones de base
lquida de lesiones de carcinoma
oral.
Material y Mtodos: Se obtuvieron
muestras de 44 pacientes.
Primeramente se prepararon frotis
convencionales, usando un
dispositivo cytobrush. A continuacin
se sumergi el cepillo que contena el
material residual en un lquido
conservante. La muestra en el mismo
fue procesada de acuerdo con las
indicaciones del fabricante
(AutoCyte, Inc. Elon College, North
Carolina, USA). Se tieron
preparaciones de ambas tcnicas de
acuerdo con el mtodo de
Papanicolaou. Para la prueba inmunocitoqumica se usaron conjuntamente
AE1/AE3 (Dako, CA, USA) para las
lesiones de carcinoma oral, de
acuerdo con el mtodo de la
Estreptovidina-biotina-peroxidasa. Se
us la prueba exacta de Fisher;
fijndose la probabilidad significativa
en p0.05.
Resultados: Ambas tcnicas
coincidieron en el diagnstico
citolgico en todos los casos donde
se us una muestra adecuada; en 3
casos el frotis convencional mostr
hipocelularidad y, por lo tanto,

Objective: To compare specimen

adequacy and diagnostic agreement
between liquid-based preparations
and conventional smears in oral
lesions, and to test the viability of
immunocytochemical assay in liquidbased preparations from oral
carcinoma lesions.
Material and Methods: Samples were
collected from 44 patients.
Conventional smears were prepared
first, using a cytobrush device. Then
the brush, containing the residual
material, was immersed in a
preservative fluid. The sample in the
preservative fluid was processed
according to the manufacturer
directions (AutoCyte, Inc. Elon
College, North Carolina, USA). Slides
of both techniques were stained by
Papanicolaou method. For
immunocytochemical assay, a
cytokeratin pool AE1/AE3 (Dako, CA,
USA) was applied in liquid-based
preparations from oral carcinoma
lesions following the Streptavidinbiotin-peroxidase method. Fishers
exact test was used; significance was
set forp 0.05.
Results: Both techniques agreed on
cytologic diagnosis in every case they
yielded an adequate specimen; in 3
cases conventional smear resulted in
hypocellularity and therefore
inadequate for analysis. On specimen
analysis, the liquid-based cytology
demonstrated a statistically
significant, 41% overall improvement

result inadecuado para el anlisis.

En el anlisis de muestras, la
citologa de base lquida mostr una
mejora general estadsticamente
significativa), de un 41% en espesura
de frotis y de un 66% en la
distribucin de clulas (p 0.05),
adems de una reduccin en la
superposicin de clulas y la
presencia de sangre (p 0.05). La
morfologa celular se observ mejor
en las preparaciones de base lquida.
Las reacciones de la prueba inmunocitoqumica fueron positivas en todos
los casos de malignidad, siendo
especialmente clara la observacin
de clulas inmuno-marcadas.
Conclusin: Tanto las preparaciones
de base lquida como los frotis
convencionales son dignos de
confianza desde el punto de vista del
diagnstico; el mtodo de base
lquida mostr una mejora general en
la preservacin de muestras,
adecuacin de ejemplares,
observacin de morfologa celular y
reproducibilidad.

in smear thickness and 66% in cell

distribution (p 0.05), and a
reduction in cell overlapping and
presence of blood (p 0.05). The cell
morphology was better visualized in
the liquid-based preparations. The
immunocytochemical assay reactions
were positive in all malignant cases,
the visualization of the
immunostained cells being especially
clear.
Conclusion: Both, the liquid-based
preparation and conventional smear,
are diagnostically reliable; the liquidbased method showed an overall
improvement on sample
preservation, specimen adequacy,
visualization of cell morphology and
reproducibility.
Key words: Oral lesions, cytologic
diagnosis, conventional cytology,
liquid-based cytology

Palabras clave: Lesiones orales,

diagnstico citolgico, citologa
convencional, citologa de base
lquida.

INTRODUCCIN
La citologa exfoliativa es un proceso simple y no invasivo, que permite
estudiar las clulas epiteliales de las superficies mucosas. Ese examen,
conocido como frotis citolgico convencional, fue originalmente ideado para la
deteccin precoz de clulas cervicales cancerosas. Su aplicacin en la prctica
de la medicina oral ha sido restringida, ya que los cambios iniciales de la
mucosa oral que indican malignidad se detectan preferentemente con la
inspeccin oral y la biopsia. Adems, la gran variacin en la calidad tcnica de
los frotis citolgicos aumenta la probabilidad de fallos de diagnstico en el

examen microscpico. No obstante, el frotis citolgico se ha usado en el

diagnstico de ciertos tipos de lesiones orales, la mayor parte de ellas
provenientes de enfermedades causadas por virus u hongos (1). Actualmente
con el progreso de la tcnica citolgica, que se ha traducido en el desarrollo de
preparaciones de base lquida, el uso de esta tcnica como herramienta
auxiliar en el diagnstico de lesiones de la mucosa oral ha despertado un
renovado inters (2-4).
En las preparaciones de base lquida, la muestra y el dispositivo de recoleccin
se transportan en un recipiente que contiene un lquido conservador. Eso
permite la inmediata fijacin de las clulas, con lo cual todo el material
removido puede usarse. Esa tcnica permite obtener preparaciones con
abundancia de clulas dispersas en una capa fina y homognea. Sangre,
inflamacin y mucus quedan reducidos y distribuidos por toda la preparacin.
El fondo claro que as se obtiene aumenta la sensibilidad y la calidad (5-7).
Comparado con los frotis convencionales, el uso de preparaciones de base
lquida ha permitido reducir considerablemente el nmero de preparaciones
insatisfactorias o satisfactorias pero limitadas, debido a las caractersticas del
ejemplar, lo que disminuye el nmero de resultados falsos negativos (8-10).
El propsito de este estudio es comparar el empleo de las preparaciones de
base lquida con el de los frotis convencionales en el diagnstico oral de rutina.
Por otra parte, tambin se estudi la viabilidad de la prueba inmunocitoqumica usando preparaciones de base lquida para lesiones cancerosas de
clulas escamosas.
MATERIAL Y MTODOS
Pacientes
El grupo de estudio estaba constituido por 44 pacientes examinados en la
Clnica de Diagnstico Oral de la Escuela de Odontologa de la Universidad de
So Paulo (La Tabla 1 resume las caractersticas de esos pacientes). El
protocolo del estudio fue aprobado por el Comit de tica de la Universidad de
So Paulo. Se inform a los pacientes sobre los objetivos de la investigacin,
mtodos, posibles beneficios y riesgos, y se obtuvo el consentimiento
informado de todos los participantes. Fue criterio de exclusin que los
pacientes usaran regularmente medicacin tpica.

Inmediatamente despus de la recoleccin de material para anlisis citolgico,

se hizo una biopsia de todas las lesiones, excepto de las que eran clnicamente
sugestivas de infeccin por el virus de herpes simplex recurrente VHS, (con
presencia de lesiones ulceradas recurrentes en mucosa queratinizada) o
infeccin por Cndida (lesin eritematosa del paladar duro asociada a
estomatitis por dentadura o sobreinfeccin de lesiones preexistentes, tales
como liquen plano oral y leucoplasia). Las biopsias fueron sometidas a un
examen histolgico de rutina y, en casos con sospecha de enfermedades
autoinmunes, tambin analizadas por inmunofluorescencia directa.
Preparacin de muestras

Las muestras recogidas provenan de lesiones de: candidiasis (8 casos), liquen

plano oral (8 casos), pnfigo vulgar (2 casos), penfigoide membrana mucosa (6
casos), carcinoma de clulas escamosas (11 casos), nevus esponjoso blanco (3
casos), leucoplasia (2 casos), lesiones de VHS recurrente (3 casos) y
paracoccidioidomicosis (1 caso).
Las muestras fueron obtenidas mediante el uso de un dispositivo cytobrush
(Adlin, Jaragu do Sul, Brasil). Primeramente se prepar un frotis convencional
pasando el cepillo a lo largo del portaobjetos de vidrio, que fue posteriormente
fijado en etanol de 95%. Entonces el cepillo, conteniendo el resto de la
muestra, fue sumergido en el medio de transporte, consistente en un
conservante de base alcohlica (AutoCyte Inc., Elon College, North Carolina,
USA) Tanto el frotis convencional como el frasco con clulas en suspensin
fueron enviados al laboratorio Citopar (Curitiba, Brasil).
En el laboratorio, el frotis convencional fue procesado de acuerdo con la
tcnica de Papanicolaou. El material celular de base lquida contenido en el
frasco fue procesado de acuerdo con las indicaciones del fabricante (AutoCyte,
Inc.) El proceso inclua vrtex, centrifugacin con reactivo de densidad,
decantacin y resuspensin de los grnulos de clulas seguida de
sedimentacin por gravedad sobre lminas revestidas de poli-l-lisina, y
seguidamente por tincin con el colorante de Papanicolaou (8-11). En el caso
de lesiones sugestivas de candidiasis, las preparaciones de base lquida fueron
hechas por duplicado y una de ellas teida con PAS (cido peridico-Schiff). Los
frotis convencionales fueron tambin teidos con PAS despus de ser
decolorados con xileno.
Evaluacin
Todas las preparaciones fueron examinadas por un citopatlogo que ignoraba
el tipo de lesin de donde ellas haban sido extradas. Para el anlisis
comparativo de ambas tcnicas se usaron cinco parmetros: a) espesura b)
distribucin celular c) microbiota d) inflamacin/leucocitos e) caractersticas.
Cada uno de ellos fue clasificado en las categoras de satisfactorio, satisfactorio
pero limitado e insatisfactorio. Para el anlisis estadstico se us la prueba
exacta de Fisher. La significancia fue fijada en p 0.05.
Inmuno-citoqumica
Parte del material de base lquida proveniente de carcinoma de clulas
escamosas tambin fue probado con respecto a su utilidad en pruebas inmunocitoqumicas. Siguiendo una tcnica estandardizada para preparaciones de
base liquida, las muestras de lmina fina as obtenidas fueron dejadas sin teir
y despus procesadas por el mtodo del complejo Estreptovidina-biotinaperoxidasa, sin recuperacin del epitopo, usando anticuerpos primarios contra
citoqueratinas humanas (conjunto de citoqueratinas AE1 / AE3) (12-14). La

dilucin fue de 1/200 (M3515, Dako, CA, USA). Las muestras fueron
primeramente fijadas en alcohol de 95%, y despus incubadas con perxido de
hidrgeno 0,3%, con bloqueo de biotina endgena. Los anticuerpos primarios
fueron incubados durante 30 minutos, seguidos de Link de 20 minutos (Dako,
CA, USA). Las muestras fueron inmuno-marcadas con el reactivo de
Estreptovidina-Biotina durante 20 minutos, y el producto de la reaccin
revelado con diaminobencidina 0,5% (DAB, Dako, CA, USA). Las muestras
fueron teidas con hematoxilina, deshidratadas con alcoholes, lavadas y
montadas para evaluacin. Los controles negativos se hicieron usando solucin
salina con fosfato tamponado (PBS), en lugar de anticuerpos primarios. Se
defini como reaccin positiva la presencia de grnulos rojo-pardos por todo el
citoplasma de clulas epiteliales malignas (2,15-17).
RESULTADOS
En la tabla 2 aparecen los resultados del diagnstico obtenidos por ambas
tcnicas. Una y otra llevaron al mismo diagnstico y a la misma catalogacin
de clase de Papanicolaou, en todos los casos donde las muestras eran aptas
para anlisis. En 3 casos (1 de leucoplasia y 2 de nevus esponjoso blanco), el
frotis convencional present hipocelularidad, lo que hizo imposible el
diagnstico citolgico.

En la tabla 3 aparecen los datos de adecuacin de las muestras. Entre los

resultados satisfactorios, las preparaciones de base lquida mostraron
estadsticamente una mejora en cuanto a delgadez (41%) y distribucin de
clulas (66%), al compararlas con las provenientes de la citologa convencional
(p 0.05). En el caso de las muestras satisfactorias pero limitadas, las
preparaciones de base lquida mostraron reduccin en la cantidad de clulas
superpuestas (frotis grueso), distribucin irregular de clulas, y en la presencia
de sangre (p > 0.05). No se hall diferencia estadstica en lo referente a
inflamacin por leucocitos, microbiota, artefactos y en los resultados
insatisfactorios (p > 0.05).

En el anlisis microscpico las preparaciones de base lquida mostraron mayor

resolucin de las muestras. En pnfigo vulgar, carcinomas de clulas
escamosas, lesiones VHS e infecciones fngicas, las preparaciones de base
lquida presentaron una mejor morfologa citolgica (Figs. 1 y 2). En el caso de

las lesiones por VHS, en particular, la observacin de caractersticas

histopatolgicas indicadoras de infecciones por virus (binucleacin, clulas
polinucleadas) mejor mucho con el uso de la tcnica de base lquida (Fig. 3).

La prueba inmuno-citoqumica para clulas malignas, usando una preparacin

de base lquida, mostr una reaccin positiva con citoqueratina AE1/AE3 en los
11 casos experimentados, tindose las clulas con un patrn rojo pardo (Fig.
4).

DISCUSIN
Desde que la citologa en base lquida fue introducida, en la dcada de 1990,
diversos estudios comparativos mostraron que ella puede ofrecer ventajas
significativas sobre la citologa exfoliativa convencional. Los resultados
obtenidos en exmenes de cuello uterino, por ejemplo, han mostrado que las
preparaciones de base lquida reducen los problemas de errores de muestreo,

transferencia y fijacin deficientes de la muestra de clulas (8-11,18). En la

investigacin de cncer uterino, las preparaciones con base lquida han
mostrado tambin una reduccin significativa en la proporcin de resultados
falsos-negativos, al compararlos con los frotis originales (7-10). Debido
probablemente a la escasez de estudios sobre citologa de base lquida para el
examen de la mucosa oral, el mtodo convencional es todava el ms usado. El
propsito de este estudio fue comparar ambas tcnicas en trminos de
adecuacin de la muestra y coincidencia de diagnsticos en el caso de diversos
tipos de lesiones orales.
La coincidencia de diagnstico entre ambas tcnicas, en el examen de 44
lesiones, fue muy elevada porque ellas coincidieron en todos los casos donde
ambas permitieron obtener un preparado adecuado; en 3 casos el frotis
convencional acus hipocelularidad y, por lo tanto, inadecuacin para anlisis.
Con respecto a la adecuacin de la muestra, las lminas procesadas por
preparaciones de base lquida presentaron ventajas, tales como una
distribucin delgada y uniforme del material celular, aparte de un fondo claro,
debido tanto a la reduccin de la superposicin de clulas como a la de la
presencia de sangre.
Debido a esos perfeccionamientos, las preparaciones de base lquida
proporcionaron ejemplares donde se vea mejor la morfologa celular. Por
ejemplo, detalles de los efectos citopticos provenientes de infeccin por VHS
(hipercromatismo nuclear, binucleacin, clulas polinucleadas) mejoraron en
las preparaciones de base lquida (19). En el caso de enfermedades
autoinmunes, tales como pnfigo vulgar, aunque ambas tcnicas fueron
eficientes para hacer el diagnstico, la percepcin de lminas de clulas
mostrando prdida del cemento intercelular (acantlisis) fue mejor
caracterizada en las preparaciones de base lquida. En el examen de lesiones
producidas por carcinoma oral, ellas tambin presentaron ventajas sobre los
frotis convencionales porque permitieron una mejor observacin de las
anomalas citolgicas y de los cambios en la relacin nuclear-citoplasmtica.
Otro propsito de este estudio fue experimentar la prueba inmuno-citoqumica
en frotis de clulas escamosas de carcinoma oral procesados como
preparaciones de base lquida. La reaccin de los anticuerpos frente a un
conjunto de citoqueratina humana (AE1/AE3) fue positiva en todos los casos de
malignidad, y la visualizacin de las clulas inmuno-marcadas fue fcilmente
realizada debido al fondo claro de las lminas. La prueba inmuno-citoqumica
mostr tambin importantes ventajas, tales como la cantidad relativamente
pequea de anticuerpos requerida y su costo reducido. Adems, la prueba
inmuno-citoqumica puede ser til para resolver casos de diagnstico
problemtico, al mostrar expresiones fenotpicas peculiares en clulas
epiteliales.

Resulta claro que, aunque la citologa convencional es todava el principal

mtodo usado para los exmenes rutinarios de frotis, este estudio demostr
que, entre otras ventajas, la citologa de base lquida logra una mejor calidad
en la resolucin de la morfologa celular. Su desventaja reside en que exige
tanto un laboratorio con equipo ms sofisticado como personal mejor
entrenado para manejar debidamente el proceso y analizar las muestras.
Como todos los mtodos de citologa de base lquida permiten la obtencin de
ms de una preparacin por cada muestra recogida, siempre habr material
suficiente para aplicar otras tcnicas, tales como PAS y Plata Metamina,
adems de la tincin de Papanicolaou. Finalmente, el material preservado en la
solucin de fijacin lquida es de larga vida til y, por lo tanto, est disponible
para los exmenes adicionales que sean necesarios.