Actividad antioxidante y cuantificacin de

compuestos bioactivos en extractos

naturales.
Universidad Politcnica Metropolitana de Puebla, Ing.
biotecnologa Lpez Prez Jerson, correo:
jerson.lopez.bio@gmail.com
Resumen: En la actualidad existe una gran variedad de compuestos
bioactivos, entre los cuales, los compuestos fenlicos, flavonoides y
vitaminas presentan un amplio origen en la naturaleza.
Estas molculas poseen una estructura qumica adecuada para
ejercer actividad antioxidante, la cual est ntimamente relacionada
con tales propiedades. Para su extraccin se utilizan solventes polares
cuyo extracto posteriormente se concentra. En este trabajo solo se
pretende
Determinar el contenido de fenoles, flavonoides totales y actividad
antioxidante, en equivalentes de cido glico (GA), catequina y Trolox
respectivamente, utilizando tcnicas espectrofotomtricas. Los
resultados se validaran estadsticamente utilizando como herramienta
el software Minitab16.
Planeamiento del problema.
Si bien existen estudios sobre distintas formas de extraccin de
antioxidantes as como cuantificar su actividad y los compuestos que
causan este efecto. No obstante al realizar un estudio nuevo con
alguna especie vegetal estos parmetros son los bsicos a realizar
para descartar o realizar nuevas aplicaciones en el campo.
Justificacin y uso de resultados.

Fundamentos tericos.
Los compuestos fenlicos en las plantas.
Las plantas vasculares sintetizan una gran cantidad de molculas
orgnicas, comoconsecuencia de su metabolismo secundario. Entres
estos se encuentran los fenoles ampliamente distribuidos en el reino
vegetal.
Se localizan en todas las partes de las plantas y su concentracin es
variable alo largo del ciclo vegetativo. Estos compuestos participan de
diversas funciones, tales como la asimilacin de nutrientes, la sntesis
proteica, la actividad enzimtica, la fotosntesis, la formacin de

componentes estructurales, la alelopata y la defensa ante los

factores adversos del ambiente. Los fenoles estn asociados al color,
las caractersticas sensoriales (sabor, astringencia,dureza), las
caractersticas nutritivas y las propiedades antioxidantes de
losalimentos de origen vegetal. La caracterstica antioxidante de los
fenoles se debe a la reactividad del grupo fenol (Robbins, 2003;
Khknen et al, 2001).

Estructuras de los compuestos fenlicos

El trmino fenoles comprende aproximadamente 8000 compuestos
que aparecen en la naturaleza. Todos ellos poseen una estructura
comn: un anillo fenol -un anillo Aromtico que lleva al menos un
sustituyente hidroxilo como se muestra acontinuacion.

Ilustracin 1estructura bsica de

los Fenoles..

Sin embargo los flavonoides son derivados fenlicos sintetizados en

cantidades substanciales por las plantas. Comprenden alrededor de
4000 compuestos identificados, son derivados hidroxilados,
metoxilados y glicosilados de la 2 fenil benzo pirano, que consiste
en dos anillos benceno combinados por mediacin del oxgeno
contenido en el anillo pirano. Estos compuestos poseen actividad
antioxidante y capacidad para capturar radicales libres (Vinson et al,
1995).

Ilustracin 2 Estructura bsica de los flavonoides.

La actividad antioxidante de los distintos grupos de compuestos

depende de la estructura individual y del nmero de oxidrilos
sustituyentes, as como del peso molecular.

Clasificacin de los flavonoides

Segn Romo de Vivar, los flavonoides se pueden clasificar
dependiendo de la estructura de su esqueleto base, tenindose, as:

Ilustracin 3 Estructura qumicas de las subclases de flavonoides ms

usuales
-Flavanona: cuando la estructura base posee un grupo carbonilo en la
posicin cuatro. Son precursores de otros flavonoides ms complejos,
pero se encuentran como tales en altas concentraciones en los
ctricos.
-Flavona: cuando se introduce un doble enlace entre las posiciones
dos y tres de la flavanona. Son amarillas y pueden estar en algunas
flores o frutos. Son frecuentes en los tejidos jvenes, se encuentran
tanto en estado libre como en forma de hetersidos. La intensidad de
su color amarillo aumenta con el nmero de grupos hidroxilos y el
incremento del pH.
-Antocianinas: poseen un sistema conjugado de dobles ligaduras, que
le confiere caractersticas coloridas tpicas.
-Flavn-3iol: cuando en el dihidroflavonol se reduce el grupo carbonilo
de la posicin cuatro.

Propiedades
molculas bioactivas.

de

fenoles

,flavonoides

otras

-Funciones protectoras en los vegetales

Antibacterianos
Dan coloracin y sabor caracterstico de las partes vegetales que
los poseen.
Proporcionan proteccin contra las radiaciones UV.

-Capacidad de formar quelatos

Ciertos grupos funcionales de los flavonoides son capaces de formar
complejos con metales como el hierro, aluminio, etc.

-Antioxidacin
Se oxidan con mayor rapidez que otros compuestos. Por lo que se los
utiliza en la conservacin de grasas y jugos de frutas
Actividad teraputica
Los
flavonoides
disponen
de
las
siguientes
propiedades
farmacolgicas: antihemorrgicos, antiarrtmicos, protectores de la
pared vascular, antiinflamatorios, antihepatotxicos, antimicrobianos,
diurticos y antiurmicos, antiespasmdicos, etc. (Kuklinski, 2000)
Mtodos para evaluar la actividad antioxidante
La actividad antioxidante de un compuesto puede evaluarse in vitro
por medio de experimentos sencillos que examinan directamente
dicha habilidad y que a la vez evalan el posible efecto sobre
diferentes molculas
Estos mtodos deben ser rpidos, reproducibles y requerir cantidades
pequeas de los compuestos qumicos por analizar, adems de no
estar influenciados por las propiedades fsicas de dichos compuestos
(Marco, 1968).
Debido a que muchos factores pueden afectar la oxidacin,
incluyendo la temperatura, la presin de oxgeno y catalizadores
metlicos, los resultados pueden variar dependiendo de las
condiciones de oxidacin empleadas. Los ensayos que miden
sustratos o productos, tambin pueden dar resultados variables
dependiendo de su especificidad (Fukumoto y Mazza, 2000).

Los siguientes son ejemplos

frecuentemente usados para
antioxidante total.

de los modelos in vitro ms

la evaluacin de la actividad

Los siguientes
frecuentemente

de

son

ejemplos

los

modelos

in

vitro

ms

usados para la evaluacin de la actividad antioxidante total.

a) Mtodo del radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) (BrandWilliams etal.; 1995). Limitado por su reproducibilidad
interensayos.
b) Ensayo FRAP, (Del ingls ferric-reducing antioxidant power),
(Benzie y Strain, 1996). Mide la capacidad de reduccin.
c) Mtodo ORAC, (Del ingls Oxygen Radical Absorbance
Capacity) (Cao et al., 1997). Cada antioxidante analizado
presenta comportamientos muy dispares.
d) Mtodo del 6-sulfonato-3-etilbenzotiazolina (ABTS) (Re et al.,
1999). La capacidad de captura de radicales libres en este
mtodo no es un reflejo de su verdadera actividad antioxidante.
e) Mtodo del N,N-dimetil-p-fenilendiamina (DMPD) (Fogliano et
al., 1999). Mtodo con reproducibilidad interensayo alta, til
para medios no lipdicos.

Cuantificacin de compuestos fenlicos

La cuantificacin e identificacin de los componentes fenlicos en la
dieta ha despertado un gran inters por su importancia nutricional, lo
que ha hecho que cada da sean ms los datos que se pueden
encontrar en la bibliografa cientfica sobre el perfil fenlico de los
alimentos. Adems, la gran diversidad de compuestos fenlicos
dispersos en los tejidos vegetales, as como sus diferentes estructuras
qumicas, han trado consigo la necesidad de desarrollar un gran
nmero de tcnicas analticas para su identificacin y cuantificacin
(Martnez-Valverde et al., 2000).
Dentro de las tcnicas analticas para la cuantificacin y/o
identificacin de compuestos fenlicos se encuentran las tcnicas
cromatogrficas como son la cromotogrfia de capa fina (TCL), la
cromatografa de gases (CG) y la de lquidos de alta resolucin (HPLC)
(Escarpa y Gonzalez, 2001), y tambin se encuentran las tcnicas
espectrofotomtricas (Martnez-Valverde et al., 2000).
Ensayo del DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazilo)

Este mtodo fue propuesto por Blois (1958) en el cual se demostr

por primera vez la capacidad del radical libre DPPH para aceptar un
tomo de hidrgeno(H) proveniente de una molcula de cistena.La
molcula 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH) es conocida como un
radical libre estable debido a la deslocalizacin de un electrn
desapareado sobre la molcula completa, por lo cual la molcula no
se dimeriza, como es el caso de la mayora de los radicales libres. La
deslocalizacin del electrn tambin intensifica el color violeta
intenso tpico del radical, el cual absorbe en metanol a 517 nm.
Cuando la solucin de DPPH reacciona con el sustrato antioxidante
que puede donar un tomo de hidrgeno como se muestra en la
figura 8, el color violeta se desvanece. El cambio de color es
monitoreado espectrofotomtricamente y es utilizado para la
determinacin de los parmetros para las propiedades antioxidantes.
Despus de aproximadamente tres dcadas este ensayo comenz a
utilizarse rutinariamente para la caracterizacin de las propiedades
antioxidantes. El procedimiento original para el ensayo DPPH ha
sido adoptado por muchos laboratorios y a pesar de que existen
modificaciones a conveniencia, una revisin detallada de la literatura
ha revelado que la mayora de los estudios estn basados en un
tiempo de reaccin de 20-30 min en vez de un tiempo de reaccin
total de 120 minutos requerido para alcanzar el estado estacionario y
completar la reaccin redox (Ojha et al., 2012).

Contenido de fenoles totales por el reactivo de FolinCiocalteu (F-C)

El ensayo de Folin-Ciocalteu (F-C) es un mtodo comnmente
utilizado en el rea de agroqumica e industrias alimenticias, por su
simplicidad, por la disponibilidad comercial del reactivo y por ser un
procedimiento ya estandarizado (Singleton et al., 1999). Inicialmente,
fue aplicado al anlisis de protenas tomando como ventaja la
actividad del reactivo frente al residuo de protena, tirosina (que
contiene un grupo fenol). Muchos aos despus este ensayo se
extendi al anlisis de .fenoles totales en vino y desde entonces se le
ha encontrado muchas aplicaciones
El reactivo de F-C utiliza un mecanismo de reaccin de
oxidacin/reduccin,que no es especfico para fenoles. De hecho, el
ensayo de F-C mide la capacidad para reducir el reactivo de cido
fosfomolibdico/fosfotungstico a un complejo azul que es monitoreado
espectrofotomtricamente.
En el ensayo F-C original, se usa el buffer de carbonato para ajustar el
pH y el punto final de reaccin se alcanza a los 120 min
aproximadamente a temperatura ambiente. Aunque es un tiempo

demasiado extenso y dificulta la implementacin de un anlisis de

rutina, an es utilizado por algunos investigadores.

Objetivos:
Determinar la capacidad antioxidante de diferentes extractos
naturales as como la cuantificacin de fenoles y flavonoides , para
una aplicacin biotecnolgica .
Metodologa.
Actividad antioxidante (DPPH+)
Se realiza mediante la inhibicin del radical DPPH, basado en la
tcnica propuesta por Kuskosky et al. (2004)
1,- Preparar una solucin homognea del radical DPPH con una
concentracin de 0,0004mg/ml utilizando como solvente metanol
absoluto.
2.-Para la curva estndar se utilizan concentraciones desde 1
M hasta 32 M usando etanol absoluto como solvente.
2.2Para el blanco de la curva estndar se toma la
concentracin menor de todos los putos de la curva y se mezcla con
el solvente de origen.
3.-Para la medicin de los extractos se mezclan cantidades
iguales con el radical , procurando por lo menos realizar 3 ensayos
para el tratamiento estadstico de datos, una vez pasado por lo
menos 30 min de reaccin leer absorbancia a 517 nm.
3.3 Para el blanco de la muestra solo se utiliza la
concentracin a la que el extracto fue sometido a reaccin utilizando
el solvente de origen del mismo.
4.- Para determinar el % de inhibicin se realiza mediante la
siguiente formula.
.

5.- Para la determinacin de TEAC (mg equivalentes a Trolox se

utiliza la interpolacin de la lnea recta de la curva estndar)
Fenoles totales
Se sigue
la metodologa propuesta por Gao et al.2004) con
modificaciones. Agregando en un tubo mbar, cantidades iguales de
extracto o infusin, con reactivo de Folin-Ciocalteau (0.1N) y Na 2CO3
(0.5%) se deja reposar durante 30 minutos . La curva de

tesispaladino.pdf

calibracin de cido glico a las siguientes

concentraciones: 0, 2, 4, 8, 16 mg/L y se lee la absorbancia a 765 nm,
con ayuda de un espectrofotmetro UV-Visible. Se utiliz cido Glico
como estndar de los compuestos fenlicos.
Flavonoides totales.
Se sigue la metodologa propuesta por Santos-Snchez, 2012. En un
tubo se agregaron cantidades iguales de extracto o infusin, NaNO 2,
AlCl3 y NaOH. La absorbancia de los compuestos fenlicos se ley a
490 nm con ayuda de un espectrofotmetro UV-Visible, utilizando
catequina como referencia.