So Paulo
2010
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2010
AGRADECIMENTOS
Giovanna, minha fortaleza, meu porto seguro. O seu sorriso foi essencial
para a finalizao desta tese.
minha irm Ana Cristina por todo apoio durante este perodo. Voc sabe
que no foi fcil, mas estou vencendo todos os obstculos.
Aos meus pais e irmos que sempre acreditaram na minha capacidade e que
me deram a maior herana: a formao acadmica.
Aos Profs. Drs. Marcelo Macedo Rogero, Jaime Amaya Farfan, Maria
Beatriz de Abreu Glria e Joo Enersto de Carvalho, por suas competentes sugestes
que melhoram o contedo deste trabalho.
Aos queridos amigos Liania Luzia, Marina Souza, Erica Lemos, Carolina
Martins, Malu, Vanessa Capriles, Mariana Canela e Ana Paula Santos pelo incentivo
e colaborao.
RESUMO
Queiroz YS. Efeito do processamento do alho (Allium sativum L.) sobre os seus
compostos bioativos e potencial antioxidante in vitro e in vivo. So Paulo: 2010.
[Tese de Doutorado em Cincias - Faculdade de Sade Pblica da USP].
Introduo: O aumento do consumo de frutas e hortalias est associado reduo
do risco de ocorrncia de doenas crnicas no transmissveis. Este efeito protetor
tem sido atribudo particularmente presena de vrios compostos bioativos como
compostos fenlicos e organosulfurados, alm de fitosteris presentes no alho que
podem contribuir com os efeitos antioxidante e hipolipemiante. Porm, o
processamento do alho pode acarretar mudanas na quantidade e na efetividade dos
compostos bioativos. Este trabalho teve como objetivo avaliar se a coco e a fritura
do alho reduziram as concentraes de compostos bioativos, o potencial antioxidante
in vitro e in vivo em hamsters hipercolesterolemizados. Mtodos: In vitro - foram
determinados nos alhos cru, frito e cozido: a) composio centesimal (protenas,
lipdios, cinzas, carboidratos, fibra alimentar solvel e insolvel); b) perfil de cidos
graxos; c) teor de fenlicos totais; d) teor de quercetina, miricetina e apigenina; e)
fitosteris; f) alicina; g) teor de cobre, zinco e selnio; h) produtos intermedirios da
reao de Maillard; i) potencial antioxidante utilizando os testes ORAC (Oxygen
radical absorbance capacity), Rancimat e o sistema -caroteno/cido linolico. In
vivo - hamsters machos foram distribuidos em 5 grupos com 10 animais em cada
grupo. 1 - controle; 2 - hipercolesterolmico; 3- hipercolesterolmico e alho cru;
grupo 4 - hipercolesterolmico e alho cozido; grupo 5 - hipercolesterolmico e alho
frito. Os animais foram eutanasiados aps 4 semanas de estudo para anlises do
plasma e do tecido heptico. No plasma foi determinado o potencial antioxidante
pelo teste ORAC, o perfil lipdico (colesterol total e fraes e triacilgliceris) e
verificado a atividade das enzimas aspartato aminotransferase (AST) e alanina
aminotransferase (ALT). No tecido heptico foram avaliadas a atividade das enzimas
hepticas (glutationa peroxidase, catalase e superxido dismutase) e o potencial
antioxidante utilizando dois mtodos, ORAC e ensaio cometa. Resultados: In vitro O teor de fibras totais para o alho cru foi de 10,0% (71,6% solvel e 28,4%
insolvel). O alto contedo de cidos graxos trans no alho frito (14,9%) devido ao
processo de fritura com 50% de gordura vegetal hidrogenada. A coco no alterou o
teor dos minerais analisados. O teor de compostos fenlicos nas amostras de alho
variou de 4,2 a 187,7 mg EAG/100g (base seca), dependendo do solvente (gua,
gua/metanol, etanol ou acetona) e do mtodo de extrao utilizados. A fritura
diminuiu os teores de quercetina e alicina em torno de 24% e 87%, respectivamente.
Os fitosteris -sitosterol e campesterol esto presentes em todas as amostras, sendo
que o alho frito apresentou os maiores teores destes compostos em relao aos alhos
cru e cozido, alm de apresentar stigmasterol. A fritura foi o processamento trmico
ABSTRACT
Queiroz YS. Effect of processing of garlic (Allium sativum L.) on their bioactive
compounds and antioxidant potential in vitro and in vivo. So Paulo: 2010. [Tese
de Doutorado em Cincias - Faculdade de Sade Pblica da USP].
Introduction: The increased consumption of fruits and vegetables is associated with
reduced risks of chronic diseases. This protective effect has been attributed
particularly to the presence of several bioactive compounds such as phenolic and
organosulfur compounds, likewise phytosterols present in garlic that may contribute
to the antioxidant and lipid-lowering effects. However, the processing of garlic can
cause changes in the quantity and effectiveness of bioactive compounds. This study
aimed to evaluate whether the cooking and frying of garlic reduced the bioactive
compounds concentrations, the antioxidant potential in vitro and in vivo in
hypercholesterolemic hamsters. Methods: In vitro - were determined in raw garlic,
fried and boiling: a) composition (protein, fat, ash, carbohydrates, dietary fiber,
soluble and insoluble), b) fatty acid profile, c) total phenolic content, d ) content of
quercetin, myricetin and apigenin, e) phytosterols, f) allicin, g) content of copper,
zinc and selenium, h) Maillard reaction products, i) antioxidant potential using the
ORAC test (Oxygen radical absorbance capacity), Rancimat and system caroteno/cido linoleic. In vivo - male hamsters were divided into five groups with
10 animals each. 1 - control, 2 hypercholesterolemic, 3 - hypercholesterolemic and
raw garlic, 4 - hypercholesterolemic and boiling garlic, group 5 hypercholesterolemic and fried garlic. Samples of blood and liver were collected
after a 4-week experimental period. In plasma were determined the antioxidant
potential by the ORAC assay, the lipid profile (total cholesterol and fractions and
triacylglycerols) and verified the activity of enzymes aspartate aminotransferase
(AST) and alanine aminotransferase (ALT). In liver tissue were evaluated the
activity of liver enzymes (glutathione peroxidase, catalase and superoxide dismutase)
and the antioxidant potential using two methods, ORAC and comet assay. Results:
In vitro - The content of dietary fiber for raw garlic was 10.0% (71.6% is soluble and
28.4% is insoluble). The high content of trans fatty acids in fried garlic (14.9%) is
due to the frying process with 50% hydrogenated vegetable fat. The cooking did not
alter the content of the minerals analyzed. The content of phenolic compounds in
garlic samples ranged from 4.2 to 187.7 mg EAG/100g (dry matter), depending on
the solvent (water, water / methanol, ethanol or acetone) and the extraction method
used. Frying decreased the content of quercetin and allicin around 24% and 87%
respectively. The phytosterols -sitosterol and campesterol are present in all samples,
and the fried garlic showed the highest levels of these compounds in relation to raw
and boiling garlic, besides presenting stigmasterol. Frying was the heat processing
that contributed to the higher values of products of the Maillard reaction. The
antioxidant potential by the ORAC assay (ethanol extracts, methanol/water and
acetone) was reduced with the processing of garlic, and the reduction was greater for
frying. The inhibition of lipid oxidation was better in methanol/water extracts. In
vivo - The group of animals that received ration hyperlipidemic and raw garlic had
less weight gain compared with groups that received garlic fried or boiling. Raw and
boiling garlic were effective in reducing lipids in hamsters plasma. The antioxidant
potential (measured by the ORAC and comet assay tests) of the groups
hypercholesterolemic supplemented with raw or boiling garlic had higher values than
the not supplemented group hypercholesterolemic. There was increased activity of
antioxidant enzymes catalase, glutathione peroxidase and superoxide dismutase in all
groups supplemented with garlic. In all groups there was no structural or functional
damage in liver tissue. Conclusions: These results corroborate the expected and
suggest that the raw and boiling garlic may lead to health benefits, given that these
products have bioactive compounds, hypolipidemic effect and showed a high
antioxidant potential in plasma and liver tissue, in addition to increased activity of
antioxidant enzymes that are involved in mechanisms of health protection.
Keywords: Garlic, Processing, Bioactive compounds, Antioxidant potential, Fatty
acid profile, Antioxidant enzymes.
NDICE
RESUMO ................................................................................................................. 7
ABSTRACT ............................................................................................................. 9
ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS UTILIZADOS .................................. 15
LISTA DE TABELAS ........................................................................................... 19
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................ 21
LISTA DE QUADROS .......................................................................................... 23
APRESENTAO ................................................................................................ 24
CAPTULO 1 ......................................................................................................... 25
REVISO BILIOGRFICA .................................................................................. 25
1 ESTRESSE OXIDATIVO E SISTEMA DE DEFESA ANTIOXIDANTE ....... 26
2 ALHO .............................................................................................................. 28
2.1 Compostos bioativos .................................................................................. 32
2.1.1 Compostos fenlicos .......................................................................... 32
2.1.2 Compostos organosulfurados.............................................................. 35
2.1.2.1 Compostos organosulfurados em alho fresco intacto .................... 35
2.1.2.2 Compostos organosulfurados em alho fresco picado .................... 38
2.1.3 Fitosteris .......................................................................................... 39
2.2 Propriedades bioativas do alho.................................................................... 41
2.2.1 Potencial antioxidante .............................................................................. 41
2.2.2 Outras propriedades ................................................................................. 43
2.3 Influncia do processamento dos alimentos no teor de compostos bioativos,
no potencial antioxidante e na formao de novos produtos .............................. 46
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS................................................................. 49
CAPTULO 2 ......................................................................................................... 59
ALHO CRU, COZIDO E FRITO: CARACTERIZAO NUTRICIONAL,
COMPOSTOS BIOATIVOS E POTENCIAL ANTIOXIDANTE IN VITRO.......... 59
1 INTRODUO ............................................................................................... 60
2 ASPECTOS TICOS....................................................................................... 61
3 ASPECTO AMBIENTAL................................................................................ 61
4 OBJETIVOS .................................................................................................... 62
4.1 Geral .......................................................................................................... 62
4.2 Especficos ................................................................................................. 62
5 MATERIAIS E MTODOS ............................................................................ 62
AAPH
2,2-azobis(2-amidinopropano)36-diidroxi-espiro[isobenzofurano1[3H],9[9H]-xanten-3-ona
ABTS-+
Radical 2,2-azinobis
a.C
Antes de Cristo
AD
Doena de Alzheimer
AGE
AGEs
ALT
Alanina aminotransferase
AP
cido pirvico
AST
Aspartato aminotransferase
ATP
Adenosina trifosfato
BF3
Trifluoreto de boro-metanol
Grupo controle
Cat
Catalase
CEA
CEAGESP
cm
Centmetro
CO2
Gs carbnico
CT
Colesterol total
Cu
Cobre
Cu-SOD
Cobre-superxido dismutase
Graus Celsius
DAS
Dialil sulfito
DADS
Dialil dissulfito
DATS
Dialil trissulfito
DCNT
DMSO
Dimetilsufxido
DNA
cido desoxiribonuclico
Delta
Variao de temperatura
DNPH
2,4-dinitrofenilidrazina
DPPH
1,1-difenil-2-picrilidrazil
Eltron
EAG
EC-SOD
ERN
ERO
Alho frito
+2
Fe
on ferroso
Fe+3
on frrico
FAI
FAS
FRAP
FS
Fitosteris
Gama
Grama
GPx
Glutationa peroxidase
GR
Glutationa redutase
GSH
Glutationa reduzida
GSSG
Glutationa oxidada
Grupo hipercolesterolmico
H+
on hidrognio
HCl
cido clordrico
HDL-c
HNO3
cido ntrico
H2O2
Perxido de hidrognio
HPLC
H2SO4
cido sulfrico
IAA
IF
Intensidade de fluorescncia
INT
2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenol)-5-cloreto de feniltetrazol
IOL
kcal
Quilocalorias
kg
Quilo
kPa
kilo Pascal
Litro
L-
LDL-c
LO-
Radical alcoxila
LOO-
Radical peroxila
mol
Micromol
Micrmetro
Micrograma
Microlitro
Metro
mg
Miligrama
mm
Milmetro
mM
Milimolar
Mn-SOD
Mangans-superxido dismutase
Molar
Normalidade
N2
Nitrognio
NAC
N-acetil cistena
NaCl
Cloreto de sdio
NADH
nm
Nanmetro
.
NO
NaOH
Hidrxido de sdio
Percentagem
Nvel de significncia
O2
Oxignio moleular
O-2
Radical superxido
O2
Oxignio singlete
-
OH
Radical hidroxila
ONOO-
Peroxinitrito
ORAC
P.A.
Padro analtico
pH
Potencial hidrogeninico
PML
PRM
p/v
Peso/volume
Alho cru
RL
Radical livre
ROOH
Hidroperxido
rpm
R$
Reais
SAC
S-alilcistena
SEC
S-acetil cistena
SOD
Superxido dismutase
TBARS
TBHQ
Tert-butilidroquinona
TG
Triacilgliceris
TGO
Aspartato aminotransferase
TGP
Alanina aminotransferase
Trolox
6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxlico
U/L
Unidades/litro
UV
Ultra violeta
VLDL-c
v/v
Volume/volume
XOD
Xantina oxidase
Alho cozido
Zn
Zinco
LISTA DE TABELAS
Tabela 17 - Potencial antioxidante (mdia + desvio padro) dos extratos de alho frito
liofilizado, segundo o mtodo e solvente de extrao.................................................97
Tabela 18 - Composio da rao comercial Nuvilab CR1 fornecida no perodo de
aclimatao................................................................................................................117
Tabela 19 - Composio das raes utilizadas no ensaio biolgico aps o perodo de
aclimatao................................................................................................................118
Tabela 20 - Perfil de cidos graxos das raes controle e hiperlipemiante..............129
Tabela 21 - Peso inicial e final, ganho de peso, consumo de rao e gua e
coeficiente alimentar (mdia + desvio-padro) dos hamsters....................................130
Tabela 22 - Mdia + desvio-padro de colesterol total (CT), HDL-c, no HDL-c e
triacilgliceris (TG) nos grupos experimentais......................................................133
Tabela 23 - Atividade das enzimas antioxidantes. Valores em mdia + desvio
padro........................................................................................................................134
Tabela 24 - Potencial antioxidante total por ORAC no plasma e no fgado de
hamsters.....................................................................................................................135
Tabela 25 - Efeito da interveno com alho nos nveis de danos oxidativos ao DNA
avaliada pelo Ensaio cometa......................................................................................136
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Alho............................................................................................................26
Figura 2 - Produo de alho no Brasil........................................................................27
Figura 3 - Evoluo do consumo de alho per capita...................................................28
Figura 4 - Viso simplificada das principais vias de biossntese de compostos
secundrios e suas inter-relaes com o metabolismo primrio..................................30
Figura 5 - Estrutura qumica da quercetina, apigenina e miricetina...........................31
Figura 6 - Reaes qumicas dos principais compostos organosulfurados encontrados
no alho..........................................................................................................................34
Figura 7 - Formao do composto organosulfurado alicina.......................................36
Figura 8 - Esqueleto principal dos esteris.................................................................37
Figura 9 - Semelhanas estruturais entre o colesterol e os fitosteris........................37
Figura 10 - Esquema do processamento das amostras................................................63
Figura 11 - Esquema do protocolo experimental in vitro...........................................64
Figura 12 - Esquema da extrao das diferentes amostras de alho, segundo
NUUTILA et al. (2003), com modificaes................................................................70
Figura 13 - Esquema da extrao das diferentes amostras de alho, segundo
GORISNTEIN et al. (2006b), com modificaes.......................................................71
Figura 14 - Esquema da extrao de compostos lipoflicos das diferentes amostras de
alho, segundo GORISNTEIN et al. (2006b)...............................................................72
Figura 15 - Teor de fenlicos totais (mg EAG/100g), em base seca, dos diferentes
processamentos do alho...............................................................................................86
Figura 16 - Inibio da oxidao lipdica (IOL), pelo sistema -caroteno/cido
linolico, dos diferentes processamentos do alho........................................................98
Figura 17 - ndice de atividade antioxidante (IAA), utilizando o aparelho Rancimat,
dos diferentes processamentos do alho........................................................................99
Figura 18 Potencial antioxidante, pelo mtodo ORAC (mol Trolox/mL), dos
diferentes processamentos do alho...............................................................................99
Figura 19 - Esquema do protocolo experimental in vivo..........................................114
Figura 20 - Alojamento dos hamsters no biotrio, em gaiolas individuais...............115
Figura 21 - Rao......................................................................................................119
Figura 22 - Anestesia................................................................................................120
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Classificao do alho por tamanho e cor..................................................28
Quadro 2 - Propriedades bioativas do alho.................................................................41
24
APRESENTAO
O presente trabalho foi dividido em 3 captulos:
25
CAPTULO 1
REVISO BILIOGRFICA
26
27
28
2 ALHO
29
60000
40000
20000
Ano
2008
2006
2004
2002
2000
1998
1996
1994
1992
1990
1988
1986
1984
1982
1980
30
1000
800
600
400
200
2008
2004
2000
1996
1992
1988
1984
1980
1976
1972
1968
1964
1960
Ano
31
Classe
Nobre
Comum
1
2
3
3
4
5
6
7
32
Unidade
Kcal
g
g
g
g
g
g
mg
mg
mg
mg
mg
mg
mg
mg
mg
mg
mg
mg
Fonte: Tabela Brasileira de Composio de Alimentos (TACO), segunda edio, 2006 - Campinas.
comumente chamados de
fitoqumicos (BRAVO
1998;
KRIS-
33
34
Quercetina
Apigenina
Miricetina
35
as
-glutamilcistenas
(principalmente
-glutamil-S-trans-1-
propenilcistena e menor quantidade da -glutamil-S-alilcistena e da -glutamil-Smetilcistena) (HOLUB et al. 2002; LANZOTTI 2006). Sulfxidos de cistena so
compostos de cor branca, cristalinos, no possuem odor quando slidos, sendo
altamente solveis em gua e insolveis na maior parte dos solventes orgnicos
(HOLUB et al. 2002).
Os compostos -glutamilcistenas servem como reserva para a formao das
cistenas, que posteriormente so convertidos em sulfxidos de cistena, conforme
apresentado na Figura 6, item a. Durante o plantio, a germinao e o armazenamento,
apenas uma parte das -glutamilcistenas so gradualmente hidrolisadas e depois
oxidadas para formarem os sulfxidos de cistenas pelo aumento dos nveis da
enzima -glutamiltranspeptidase (h aumento da formao, conforme o decrscimo
da temperatura) (HOLUB et al. 2002).
As -glutamilcistenas que no foram convertidas a sulfxidos de cistena,
transformam em S-alilcistena (SAC) e S-1-propenilcistena, quando extradas em
gua por um longo perodo (Figura 6, item c). Os sulfxidos de cistenas (8 - 19 mg/g
de alho fresco) e as -glutamilcistenas (5 - 16 mg/g de alho fresco) somam
36
37
a) Durante o plantio, a germinao e armazenamento dos bulbos intactos
-glutamilcistenas
hidrolizada
oxidada
Cistenas
-glutamiltranspeptidase
Sulfxidos de cistena
oxidase
S- alilcistena sulfoxido (alliina) (6 - 14 mg/g)
-glutamil-S-trans-1-propenilcistena (3 - 9 mg/g)
-glutamil-S-alilcistena (2 - 6 mg/g)
-glutamil-S-metilcistena (0,1 - 0,4 mg/g)
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------allinase
b) Picado ou macerado
cido sulfnico
No ocorre reao durante o
processamento (picar e macerar)
Tiosulfinatos
- alil metil tiosulfinato (0,3 mg/g)
- alil trans-1-propenil tiosulfinato (0,05 1 mg/g)
- metil trans-1-propenil tiosulfinato (0,02 0,2 mg/g)
- metil metanotiosulfinato (0,05 0,1 mg/g)
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
S-alilcistena (SAC)
S-1-propenilcistena
Extrao em leo ou
solventes orgnicos
Disulfitos
Trisulfitos
Vinil ditiinas
- dialil disulfito
- alil metil disulfito
- dialil trisulfito
- alil metil trisulfito
- 2-vinil-4H-1,3-ditiina
- E-ajoeno
- 3-vinil-4H-1,2-ditiina
- Z-ajoeno
(a) bulbos intactos, (b) depois de picado ou macerado e (c) aps processamento
Fonte: HOLUB 2002
Ajoenos
38
39
enzima aliinase
aliina
alicina
licina
2.1.3 Fitosteris
40
41
42
43
44
Objetivo
Caractersticas
Resultados
Autores
do alho
In natura
Colesterol
presso arterial
e Meta-anlise de 5 estudos.
592 indivduos,
de
12%
do SILAGY E NEIL
20 g/dia), de 1 a 10
semana
meses
Extrato de alho
Extrato
de
envelhecido (7,2
meses
Agregao
Duplo-cego,
Plaquetria
placebo-controlado
alho Colesterol,
Duplo-cego,
g), 6 lipoprotena
e homens
presso arterial
absoro
sntese
MORRIS et al.
(1995)
cross
over, Reduo
de
6%
no STEINER et al.
hipercolesterolmicos
Duplo-cego, randomizado
Sem efeito
BERTHOLD
et
al. (1998)
do
colesterol
900 mg/dia de alho em p Colesterol
Randomizado,
ISAACSHON
(Kwai) 12 semanas
controlado,
pacientes
al. (1998)
et
hipercolesterolmicos
300 mg de extrato de alho, Colesterol,
McCRINDLE
3x/dia, 8 semanas
hiperlipidmicos
al. (1998)
lipoprotenas,
(tipo
et
familiar)
10 g de alho/dia, perodo Colesterol,
23
de 4 meses
hipercolesterolmicos,
presso arterial
voluntrios Reduo
colesterol
do
nvel
LDL,
de DURAK
et
VLDL, (2004)
al.
45
continuao
Forma de administrao Objetivo
Caractersticas
Resultados
Autores
do alho
0,125; 0,25 e 0,5 mg/Kg Atividade
de
leo
de
Administrio
Modelo
animal:
do
leo
animais em cada.
diminuio
de (2004)
lceras
mucosa
gastrointestinal)
1
mg
de
hidroalcolico
de
Modelo
animal:
de 400 g e em jejum de 12
horas
et
al.
(2005)
segundos
25 mg/kg de extrato de Reduo
20
34%
minutos
(Z) dos
43%,
triacilgliceris
respectivamente e em 18 e
(TG)
24% os TG
46
47
que
ocorrem
na
diabetes,
aterosclerose
doenas
48
49
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS*
____________________________________________________________________
* De acordo com as normas do Guia de Apresentao de Teses. Biblioteca/CIR Centro de
Informao e referncia em Sade Pblica. 2 ed. So Paulo; 2006.
50
51
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58
59
CAPTULO 2
60
1 INTRODUO
61
et al. 1999). O tratamento trmico pode induzir a formao de novos compostos que
so produtos da reao de Maillard (PRM), sendo que alguns destes compostos so
potencialmente txicos podendo diminuir o valor nutricional de alimentos devido ao
comprometimento de aminocidos essenciais, notadamente a lisina (NICOLI et al.
1997; NICOLI et al. 1999; KAUR e KAPOOR 2001).
O alho consumido principalmente aps o processamento trmico ao invs
de cru que leva a certa diminuio no contedo de seus compostos bioativos e no seu
potencial antioxidante (NICOLI et al. 1999; KAWAMOTO et al. 2004; PEDRAZACHAVERR et al. 2006; PEDRAZA-CHAVERR et al. 2007). Portanto de suma
importncia verificar se a coo e a fritura do alho preservam o contedo dos seus
compostos bioativos e o seu potencial antioxidante in vitro.
2 ASPECTOS TICOS
Tendo em vista que este projeto no envolve seres humanos, foi encaminhado
ao Comit de tica em Pesquisa da Faculdade de Sade Pblica/ Universidade de
So Paulo uma declarao informando tal fato, conforme normas de resoluo 196 de
10/10/1996, do Conselho Nacional de Sade, que regulamenta as pesquisas
envolvendo seres humanos (Anexo 1).
3 ASPECTO AMBIENTAL
62
4 OBJETIVOS
4.1 Geral
4.2 Especficos
reao de Maillard;
5 MATERIAIS E MTODOS
63
5.2 Amostras
64
Bulbo 1
3,86
6,41
5,59
5,96
2,74
2,94
6,58
1,59
5,33
1,85
1,64
4,04
1,98
Bulbo 6
7,16
6,21
6,52
3,52
3,35
5,64
6,13
6,84
3,02
1,96
5,04
1,87
65
66
12 kg
13 kg
12 kg
Adio de gua
13 L gua
Alho cru - 12 kg
Alho cozido - 18 kg
Alho frito - 6 kg
Liofilizao
4,3 kg
3,3 kg
4,8 kg
Triturao
Tamisao
67
Cru
Cozido
Testes in vitro
Composio proximal
(umidade, fibra alimentar solvel e
insolvel, lipdios,
protenas, cinzas)
Perfil de cidos graxos
Selnio, zinco e cobre
Fenlicos totais
Quercetina, miricetina e
apigenina - HPLC
Alicina
Fitosteris
Compostos da reao de
Maillard
Potencial antioxidante testes ORAC, Rancimat e caroteno/cido linolico
Frito
68
C.
- Fibras: para as anlises de fibras totais, solveis e insolveis utilizou-se o
69
70
71
1,0
40
15
1,5
200
10
10
Correo de fundo
Elementos (comprimento de onda / nm)
3 pontos
Cu (324,75) e Zn (206,20)
72
retido no filtro sofreu nova extrao, sendo que o seu sobrenadante foi direcionado
para o mesmo balo do anterior. Foram utilizados 10 mL de solvente para lavagem
final do resduo, sendo este descartado. Os sobrenadantes foram completados para o
volume de 50 mL com os respectivos solventes (etanol ou gua destilada ou
metanol/gua - 70:30 v/v).
A segunda foi de acordo com GORINSTEIN et al. (2006b) com modificaes
(Figura 13). Foram pesados 3 g de amostra e adicionados 20 mL de etanol ou gua
destilada ou metanol/gua (70:30 v/v), a amostra foi agitada por 6 horas a 4 oC em
agitador magntico, centrifugada por 10 minutos a 2570 x g e em seguida filtrada. O
sobrenadante foi armazenado em balo volumtrico de 50 mL. O resduo retido no
filtro sofreu nova extrao, sendo que o seu sobrenadante foi direcionado para o
mesmo balo do anterior. Foram utilizados 10 mL de solvente para lavagem final do
resduo, sendo este descartado. Os sobrenadantes foram completados para o volume
de 50 mL com os respectivos solventes (etanol ou gua destilada ou metanol/gua 70:30 v/v).
A terceira metodologia tambm foi descrita por GORINSTEIN et al. (2006b),
na qual se obteve extratos altamente lipoflicos (Figura 14). Foi pesado 1 g de
amostra e adicionados 50 mL de acetona/gua (75:25 v/v), a amostra foi agitada
(temperatura ambiente) por 2 horas em agitador magntico e depois filtrada. O
resduo retido no filtro sofreu nova extrao e os sobrenadantes foram transferidos
para um funil de decantao. Foi adicionado 150 mL de ter dietlico. A fase superior
contendo os compostos lipoflicos foi lavada vrias vezes com gua, e em seguida
filtrada com sulfato de sdio. O filtrado foi evaporado em rotaevaparador e
posteriormente suspenso em 25 mL de acetona.
Todos os extratos, aquoso, etanlico, metanol/gua e acetona, obtidos das 3
metodologias foram colocados em frascos mbar, sob atmosfera de nitrognio e
armazenados no freezer -18 oC at o momento das anlises.
73
Amostra - 3 g
Extrao com 20
mL de gua
Extrao com 20
mL de etanol
Extrao com 20 mL de
metanol/gua (70:30 v/v)
Ultrassonificao por 20
minutos
2a extrao
Filtrao
Resduo
Sobrenadante
Volume completado
para 50 mL
74
Amostra - 3 g
Extrao com 20
mL de gua
Extrao com 20
mL de etanol
Extrao com 20 mL de
metanol/gua (70:30 v/v)
Filtrao
Resduo
Sobrenadante
Volume completado
para 50 mL
75
Amostra - 1 g
2a extrao
Filtrao
Resduo
Sobrenadante
Funil de decantao
Filtrao
Suspenso em 25
mL de acetona
Evaporao
76
Este
mtodo
colorimtrico
baseia-se
na
reduo
dos
cidos
do
reagente
Folin-Ciocalteu
pelos
fenlicos
medida
77
y = 9,8695x + 0,0151
(R2 = 0,9943)
78
Concentrao (g)
0,05 0,3
0,05 0,3
0,05 0,3
Coeficiente de correlao
0,9934
0,9970
0,9951
Limites de
deteco (g/mL)
Quercetina
Miricetina
Apigenina
0,21
0,12
0,19
Limites de
Recuperao
Quantificao (g/mL)
(%)
0,44
0,39
0,63
98,06
99,34
99,08
5.3.6.3 Alicina
79
5.3.6.4 Fitosteris
80
2C/min
264 C (5 minutos)
275 C (2 minutos).
81
82
83
IAA = TI amostra
TI controle
84
6 RESULTADOS E DISCUSSO
85
Tabela 5 - Composio centesimal (mdia + desvio padro) em base seca dos alhos
cru, cozido e frito liofilizados.
Componente
Umidade
6,47+ 0,09b
6,59 + 0,12b
4,78 + 0,08a
Cinzas
4,21 + 0,07b
4,15 + 0,08b
2,99 + 0,08a
Protenas
18,54 + 0,19b
18,53 + 0,64b
13,88 + 1,20 a
Lipdios
0,66 + 0,00b
0,63 + 0,00b
17,88 + 0,31c
Fibras Totais
10,04 + 0,74a
10,33 + 0,30a
12,74 + 0,60b
Fibras solveis
7,19 + 0,57a
7,99 + 0,26a
9,04 + 0,63b
Fibras insolveis
2,85 + 0,40a
2,34 + 0,12a
3,71 + 0,25b
60,08 + 0,86b
59,77 + 0,44b
47,73 + 0,93a
Carboidratos*
O perfil lipdico foi determinado nas amostras de alho porque este influencia
na reduo ou no incremento do colesterol plasmtico. Nas amostras de alho cru e
cozido os cidos graxos encontrados em maior abundncia foram o linolico
(insaturado) e palmtico (saturado), conforme apresentado na Tabela 6. J no alho
frito, alm do linolico e palmtico, foram encontrados em grandes quantidades o
eladico (trans) e o olico (insaturado). O alto contedo de cidos graxos trans no
alho frito (14,85%) devido ao processo de fritura com 50% de gordura vegetal
hidrogenada. Sabe-se que os trans podem aumentar colesterol total e no-HDL
(ASCHERIO 2006).
Os cromatogramas referentes anlise de cidos graxos no padro e nas
amostras de alho encontram-se no Anexo 4.
86
Alho cru
Alho cozido
Alho frito
C16:0 (Palmtico)
18,73+ 0,01b
19,35 + 0,02c
12,40+ 0,13a
C18:0 (Esterico)
0,00a
0,00a
7,77 + 0,09b
0,00a
0,00a
14,85 + 0,01b
7,04+ 0,02a
7,12 + 0,01a
28,26 + 0,64b
C:18:2 (Linolico)
68,82 + 0,03b
68,69 + 0,32b
34,04+ 0,46a
C20:1 (Eicosenoico)
5,41 + 0,01c
4,84 + 0,01b
2,68 + 0,14a
Total saturados
18,73
19,35
20,17
Total monoinsaturados
12,45
11,96
45,79
sendo Trans
0,00
0,00
14,85
68,82
68,69
34,04
C18:1 (olico)
Total poliinsaturados
Letras diferentes na mesma linha indicam diferena estatisticamente significante (p < 0,05).
6.3 Minerais
presentes
no
alho
so
Se-metilselenocistena
gama-
87
Tabela 7 - Minerais (mdia + desvio padro) em base seca dos alhos cru, cozido e
frito liofilizados.
Componente
Alho cru
Alho cozido
Alho frito
(mg/kg)
(mg/kg)
(mg/kg)
Selnio
1,53+ 0,02a,b
1,78 + 0,09b
1,28+ 0,17a
Cobre
6,25 + 0,09a
6,73 + 0,07a
4,70 + 0,02b
Zinco
28,14 + 0,30b
30,29 + 0,32c
22,25 + 0,11a
Letras diferentes na mesma linha indicam diferena estatisticamente significante (p < 0,05).
88
do alho cru
89
Figura 15 - Teor de fenlicos totais (mg EAG/100g), em base seca, dos diferentes
processamentos do alho.
c
c
c
b
b
a b
a
a
b a b
b a
b
a a
Mtodo 1 = Nuutila et al. (2003) com modificaes; Mtodo 2 = Gorinstein et al. (2006b) com
modificaes; Mtodo 3 = Gorinstein et al. (2006b).
Letras diferentes no mesmo solvente e mtodo indicam diferena estatisticamente significante (p <
0,05).
Em geral, a gua foi o solvente que melhor extraiu compostos do alho quando
comparados com os demais solventes (etanol, acetona, metanol/gua) (Tabela 8, 9 e
10). Assim como no estudo de GORINSTEIN et al. (2009) a acetona foi o solvente
menos eficaz na extrao dos compostos fenlicos desta especiaria.
90
Solvente
Slidos solveis
(mg/mL)
(mg EAG/100g)
aquoso
34,30+ 0,25d
177,00 + 13,49d
etanol
0,30+ 0,10a
14,52 + 0,76a,b
30,90 + 0,36c
68,07 + 1,80c
aquoso
30,17 + 0,06c
187,68 + 14,79d
etanol
0,47+ 0,06a
5,69 + 0,45a
28,43+ 0,68b
17,55 + 1,63a,b
acetona
0,40 + 0,10a
30,70 + 2,70b
1 = Nuutila et al. (2003) com modificaes; 2 = Gorinstein et al. (2006b) com modificaes; 3 =
Gorinstein et al. (2006b).
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferena estatisticamente significante (p < 0,05).
Solvente
Slidos solveis
(mg/mL)
(mg EAG/100g)
aquoso
23,90 + 0,10b
52,29 + 0,42f
etanol
0,50 + 0,00a
7,89 + 0,18b
34,00 + 0,10d
75,37 + 2,82g
aquoso
35,97 + 0,21e
30,48+ 0,99e
etanol
0,83 + 0,15a
4,19 + 0,10a
29,07+ 0,45c
19,55 + 1,09d
acetona
0,50 + 0,10a
13,44 + 0,54c
1 = Nuutila et al. (2003) com modificaes; 2 = Gorinstein et al. (2006b) com modificaes; 3 =
Gorinstein et al. (2006b).
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferena estatisticamente significante (p < 0,05).
91
Solvente
Slidos solveis
(mg/mL)
(mg EAG/100g)
aquoso
22,03 + 0,12c
86,95 + 1,64c
etanol
11,60 + 0,17b
13,33 + 1,07a
26,07+ 0,06e
121,82 + 3,11e
aquoso
21,57 + 0,80c
100,41 + 2,65d
etanol
11,60 + 0,46b
14,94+ 0,62a
23,23 + 0,29d
28,28 + 0,80b
acetona
4,80 + 0,20a
15,13 + 0,61a
1 = Nuutila et al. (2003) com modificaes; 2 = Gorinstein et al. (2006b) com modificaes; 3 =
Gorinstein et al. (2006b).
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferena estatisticamente significante (p < 0,05).
92
Alho cru
Quercetina
Miricetina
Apigenina
mg/100g*
mg/100g*
mg/100g*
12,33 + 0,84b
Tr
Tr
Tr
Tr
Tr
Tr
Alho cozido
11,24 + 0,39
Alho frito
9,39 + 0,54a
* Base seca.
Tr = valores abaixo do limite de quantificao.
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferena estatisticamente significante (p < 0,05).
6.4.3 Alicina
A alicina pode ser estimada pela atividade da allinase por um mtodo que
determina, por espectrofotometria, a quantidade total de 2,4-dinitrofenilhidrazina que
reage com grupos carbonilas. Este se baseia na reao da alliina-allinase produzindo
duas molculas de cido pirvico e uma molcula de alicina.
93
Alho cru
85,10 + 5,62b
Alho cozido
80,42 + 4,44b
Alho frito
11,08 + 0,33a
*Os resultados obtidos foram expressos em mol de cido pirvico (AP)/g de amostra em base seca.
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferena estatisticamente significante (p < 0,05).
6.4.4 Fitosteris
94
Campesterol
Stigmasterol
mg/100g
mg/100g
mg/100g
Alho cru
9,79 + 0,21a
0,99 + 0,04a
ND
Alho cozido
11,66 + 0,54a
0,61 + 0,06a
ND
Alho frito
48,24 + 1,39b
13,05 + 0,55b
3,47 + 0,46
Amostras
95
vezes superior ao produto cru. A coco (100 oC) tambm apresentou valores bem
superiores de IF quando comparados com o alho cru, porm este valor foi 2 vezes
superior.
Durante o processamento trmico do caf (torrefao a 200-250 C por 5-15
minutos) ocorre a formao de um grande nmero de compostos volteis como as
melanoidinas e os PRM (BUETLER 2008), assim como em cereais matinais do tipo
flakes (cozimento a 80-95 C, e peletizao por extruso; e no final tostagem entre
150-170 C). Altas temperaturas e baixa atividade de gua so fatores que favorecem
as reaes de Maillard (DELGADO-ANDRADE et al. 2005; RUFIN-HENARES
et al. 2006). No estudo de SHIBAO (2010), o teor de Compostos Intermediarios
Fluorescentes (CIF) livre para cereais do tipo flocos variou de 12,7 a 46,46 CIF/mg
de amostra, enquanto que para os cereais tipo granola foi de 44,49 a 52,94 CIF
livre/mg de amostra. J para o caf o teor medio de foi de 232,89 CIF livre/mg
IF/mg*
Alho cru
7073,89 + 175,12a
Alho cozido
14383,39 + 498,62b
Alho frito
45321,46 + 965,65c
*Os resultados obtidos foram expressos em Intensidade de Fluorescncia (IF) por mg de amostra em
base seca.
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferena estatisticamente significante (p < 0,05).
96
97
geral, a acetona no foi um bom solvente para extrair compostos com capacidade
antioxidante.
FERNNDEZ-LPEZ et al. (2005) verificaram que o suplemento de alho
utilizado em almndegas bovina no inibiu a oxidao lipdica, medida pelo aparelho
Rancimat, pois o ndice de estabilidade lipdica foi menor quando comparado ao
controle. QUEIROZ et al. (2009) constataram que o alho picado sem a adio de sal
e o alho frito apresentaram os melhores IAA.
Outro teste escolhido para a avaliao do potencial antioxidante total das
amostras de alho foi o ORAC (Tabelas 15, 16 e 17). Esta metodologia avalia o efeito
protetor da amostra, por comparao ao Trolox. Inicialmente, medida a rea sob a
curva de decaimento da fluorescena utilizando-se a amostra como agente
antioxidante. A seguir, a mesma rea medida, utilizando-se o antioxidante padro
Trolox. O clculo envolvendo estas reas e as concentraes da amostra e do padro
indica a capacidade antioxidante da amostra. Esta uma das poucas tcnicas
disponveis que avalia no s o tempo de proteo, mas tambm a extenso da
mesma (OU et al. 2001).
Os melhores valores de ORAC encontrados para os alhos cru (Tabela 15),
cozido (Tabela 16) e frito (Tabela 17) foram nos extratos aquosos. Em geral, os
extratos etanlicos apresentaram menor desempenho.
98
Tabela 15 - Potencial antioxidante (mdia + desvio padro) dos extratos de alho cru
liofilizado segundo o mtodo e solvente de extrao.
Mtodo
Solvente
Atividade antioxidante
%IOL*
IAA**
ORAC (mol
Trolox/mL)***
aquoso
53,91 + 1,81 b
11,45 + 0,52 d
etanol
53,86 + 4,01 b
1,06 + 0,06 a
0,83 + 0,07a
69,86 + 0,44c
1,51 + 0,04c
8,01 + 0,28c,d
aquoso
42,05 + 2,18a
1,21 + 0,06b
6,95 + 0,56c
etanol
36,26+ 0,26a
1,59 + 0,01 c
0,78 + 0,12a
66,64 + 1,28 c
7,23 + 0,55b,c
acetona
42,26 + 3,79a
1,57 + 0,09a,b
1 = Nuutila et al. (2003) com modificaes; 2 = Gorinstein et al. (2006b) com modificaes; 3 =
Gorinstein et al. (2006b).
*IOL = inibio da oxidao lipdica pelo sistema -caroteno/cido linolico.
**IAA = ndice de atividade antioxidante utilizando o aparelho Rancimat. IAA = tempo de induo
(h) da amostra / tempo de induo (h) do controle.
***ORAC = teste da capacidade de absorbncia de oxignio radical. Os resultados obtidos foram
expressos em mol Trolox/mL).
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferena estatisticamente significante (p < 0,05).
99
Solvente
Atividade antioxidante
IOL (%)*
IAA**
ORAC (mol
Trolox/mL)***
aquoso
62,05 + 2,29d
1,14 + 0,08a,b
10,66 + 1,49e
etanol
47,04 + 1,65 a
1,19 + 0,04a,b
0,34 + 0,01a
57,62 + 1,06c,d
1,49 + 0,12c
3,63 + 0,13b
aquoso
54,42 + 1,08b,c
1,26 + 0,03a,b,c
7,74 + 1,24d
etanol
58,96 + 2,14c,d
1,42 + 0,13b,c
0,96 + 0,14a
61,07 + 0,52d
1,14 + 0,20a,b
3,12 + 0,20b
1,07 + 0,01a
1,15 + 0,03a
acetona
1 = Nuutila et al. (2003) com modificaes; 2 = Gorinstein et al. (2006b) com modificaes; 3 =
Gorinstein et al. (2006b).
*IOL = inibio da oxidao lipdica pelo sistema -caroteno/cido linolico.
**IAA = ndice de atividade antioxidante utilizando o aparelho Rancimat. IAA = tempo de induo
(h) da amostra / tempo de induo (h) do controle.
***ORAC = teste da capacidade de absorbncia de oxignio radical. Os resultados obtidos foram
expressos em mol Trolox/mL).
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferena estatisticamente significante (p < 0,05).
100
Tabela 17 - Potencial antioxidante (mdia + desvio padro) dos extratos de alho frito
liofilizado, segundo o mtodo e solvente de extrao.
Mto
do
Solvente
Atividade antioxidante
%IOL*
IAA**
ORAC (mol
Trolox/mL)***
1,05 + 0,03
a,b
13,91 + 0,46e
aquoso
62,20 + 2,37
etanol
62,32 + 3,69c
1,53 + 0,12c
0,15 + 0,09a
48,35 + 1,55b
1,22 + 0,12b
3,64 + 0,14c
aquoso
68,65 + 3,74c
1,22 + 0,04b
10,93 + 0,27d
etanol
52,24 + 3,21b
1,47 + 0,02c
0,55 + 0,03a
61,52 + 0,35c
1,44 + 0,08c
1,88 + 0,02b
acetona
23,40 + 0,17a
1,00 + 0,03a
0,21 + 0,15a
1 = Nuutila et al. (2003) com modificaes; 2 = Gorinstein et al. (2006b) com modificaes; 3 =
Gorinstein et al. (2006b).
*IOL = inibio da oxidao lipdica pelo sistema -caroteno/cido linolico.
**IAA = ndice de atividade antioxidante utilizando o aparelho Rancimat. IAA = tempo de induo
(h) da amostra / tempo de induo (h) do controle.
***ORAC = teste da capacidade de absorbncia de oxignio radical. Os resultados obtidos foram
expressos em mol Trolox/mL).
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferena estatisticamente significante (p < 0,05).
101
GORINSTEIN et al. (2010) verificaram que quando o alho foi cozido por 10
minutos a capacidade antioxidante se manteve, porm quando o mesmo foi frito esta
se reduziu. J no estudo de JIMNEZ-MONREAL et al. (2009) o potencial
antioxidante do alho diminuiu com a coco e com a fritura em 59 e 58%,
respectivamente.
Figura 16 - Inibio da oxidao lipdica (IOL), pelo sistema -caroteno/cido
linolico, dos diferentes processamentos do alho.
80
60
70
a
b b
a
b
a
50
a a
b
c
b
a
a
40
30
alho cru
alho cozido
20
alho frito
10
0
aquoso
etanol
mtodo 1
metanol/gua
aquoso
etanol
mtodo 2
metanol/gua
acetona
mtodo 3
Letras diferentes no mesmo solvente e mtodo indicam diferena estatisticamente significante (p <
0,05).
102
1,6
1,4
1,2
b b
a
a a
a,b
a a a
1
0,8
alho cru
0,6
alho cozido
0,4
alho frito
0,2
0
aquoso
etanol
metanol/gua
aquoso
mtodo 1
etanol
metanol/gua
mtodo 2
acetona
mtodo 3
Letras diferentes no mesmo solvente e mtodo indicam diferena estatisticamente significante (p <
0,05).
14
12
b a
10
alho cru
6
a a
4
2
b b
b
alho cozido
a
a
alho frito
b
a
0
aquoso
etanol
mtodo 1
metanol/gua
aquoso
etanol
mtodo 2
metanol/gua
acetona
mtodo 3
Letras diferentes no mesmo solvente e mtodo indicam diferena estatisticamente significante (p <
0,05).
103
7 CONCLUSES
# O alho cru e seus produtos (frito e cozido) possuem maior quantidade de fibras
solveis que insolveis;
# O teor de cidos graxos poliinsaturados se destaca nos alhos cru e cozido. O
processamento de fritura levou a incorporao de grande quantidade de lipdios totais
e de cidos graxos trans;
# O processamento, independente do mtodo de extrao (1 ou 2), diminuiu o teor de
fenlicos nos extratos aquosos, etanlicos e com acetona. Provavelmente durante o
processamento foram formados conglomerados solveis em metanol/gua, pois
houve aumento no teor de fenlicos para o extrato base dessa mistura;
# A gua foi o solvente que melhor extraiu compostos fenlicos do alho cru quando
comparados com etanol, acetona, metanol/gua. No entanto, para o alho frito o
solvente mais eficiente foi metanol/gua (70:30 v/v);
# A coco no afetou o teor do composto quercetina, porm a fritura diminuiu a
quantidade deste composto. No foi possvel detectar miricetina e apigenina nas
amostras de alho;
# A temperatura utilizada na fritura do alho promoveu a diminuio do teor de
alicina;
# Os fitosteris -sitosterol e campesterol esto presentes em todas as amostras,
sendo que o alho frito apresentou os maiores teores destes compostos, alm de
apresentar stigmasterol, provenientes do leo de soja da fritura;
# No alho cru, a mistura de metanol/gua foi o solvente que contribuiu para melhor
atividade antioxidante pelo sistema -caroteno/cido linolico. J para o alho cozido
e frito, o melhor solvente foi gua;
# O IAA do alho cru e cozido foi maior quando se utilizou os solventes metanol/gua
(mtodo 1) e etanol (mtodo 2), respectivamente. J para o alho frito, o etanol foi o
melhor solvente;
104
# Os melhores valores de ORAC encontrados para os alhos cru, cozido e frito foram
nos extratos aquosos. Em geral, os extratos etanlicos apresentaram menor
desempenho;
# Nos mtodos avaliados, a acetona no foi um bom solvente para extrair compostos
com potencial antioxidante;
# Com o processamento do alho cru em cozido e frito foi observado que no houve
reduo da atividade antioxidante avaliada pelo mtodo Rancimat;
# Os resultados corroboram com o esperado e sugerem que o alho cru e cozido
podem contribuir com benficios para sade, haja visto que estes produtos
apresentam potencial antioxidante, considervel teor de fibras solveis, quercetina,
alicina e fitosteris, todos envolvidos em mecanimos de proteo sade.
105
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS*
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112
CAPTULO 3
PROCESSAMENTO DO ALHO:
INFLUNCIA SOBRE O POTENCIAL
ANTIOXIDANTE EM HAMSTERS
HIPERCOLESTEROLEMIZADOS
113
1 INTRODUO
114
(GORINSTEIN
et
al.
2006b;
GORINSTEIN
et
al.
2006c;
115
2 ASPECTOS TICOS
3 HIPTESE
4 OBJETIVOS
4.1 Geral
4.2 Especficos
hamsters;
116
no tecido heptico e no plasma dos hamsters pelos testes ORAC e ensaio cometa;
5 MATERIAIS E MTODOS
117
Alho liofilizado
Cru
Cozido
Frito
Controle (C)
H + alho cru
Hipercolesterolmico (H)
H + alho cozido
H + alho frito
cozido
Plasma
CT
LDLc
HDLc
VLDL-c
TG
Fgado
Enzimas
antioxidantes
(Cat, GPx e SOD)
Ensaio cometa
ORAC
ORAC
Enzimas
ALS e AST
118
5.3 Animais
119
5.3.1 Experimento
5.4 Raes
120
Quantidade (%)
mximo de 12,5%
mnimo de 22,0%
mnimo de 4,0%
mximo de 10,0%
mximo de 8,0%
121
Rao controle
g/kg rao
%
200,00
20,00
111,00
11,1
50,00
5,00
483,50
48,35
100,00
10,00
40,00
4,00
10,00
1,00
3,00
0,30
2,50
0,25
1000,00
100,00
Rao hiperlipemiante
g/kg rao
%
200,00
20,00
110,00
11,00
1,00
0,10
50,00
5,0
483,50
48,35
100,00
10,00
40,00
4,00
10,00
1,00
3,00
0,30
2,50
0,25
1000,00
100,00
122
Figura 21 - Rao
123
Figura 22 - Anestesia
124
125
Xantina
Por sua vez, os radicais superxido reagem com INT, gerando um composto
vermelho, o corante Formazan.
O2-
INT
corante Formazan
O2
O2 + H2O2
126
Na
2 GSH + ROOH
127
Este mtodo foi realizado no plasma e no tecido heptico dos animais, o qual
avalia o potencial antioxidante da amostra, medindo sua capacidade de proteger a
fluorescena (FL) da oxidao pelo AAPH (dihidrocloreto de 2,2-azobis (2aminopropanol)) no meio reacional, segundo metodologia descrita por CAO et al.
1993 e modificada por OU et al. 2001.
Um branco preparado misturando-se 3 mL de tampo, 15 L de FL e 300
L de AAPH e, pela medida da fluorescncia (excitao 494 nm, emisso = 515 nm),
calculada a rea sob a curva de absorbncia versus o tempo. Para a avaliao da
amostra, preparada uma soluo com 2,7 mL de tampo fosfato, 300 L de amostra
convenientemente diluda, 15 L de FL e 300 L de AAPH, repetindo-se a medio
feita para o branco. A temperatura de incubao da reao de 37 C. A reao com
os radicais livres consome a FL e a fluorescncia decai.
128
Esta tcnica foi realizada em parceria com o Prof. Doutor Marcelo Lima
Ribeiro e com o Ms. Demetrius de Paiva Aai, ambos do Laboratrio de Biologia
Molecular da Unidade de Farmacologia e Gastroenterologia da Universidade de
So Francisco Bragana Paulista-SP.
A fim de avaliar a ao protetora/antioxidante de compostos naturais e
sintticos, diversos trabalhos mostram que o comet assay (single-cell gel
electroohoresis) um mtodo simples, sensvel e reprodutvel para a avaliao de
efeitos antioxidantes in vivo e in vitro. Atravs deste possvel detectar quebras em
fitas simples e duplas e oxidao em bases de DNA (FESTA et al. 2001,
OLDHAM et al. 2002; SHI et al. 2002; PORRINI et al. 2005; DEMETRIUS 2009).
Aps o sacrifcio dos animais parte do tecido heptico foi congelado em
ultrafreezer a - 80oC para a determinao dos danos oxidativos do DNA nas clulas
hepticas por meio do comet assay (POOL-ZOBEL et al. 1994). Resumidamente,
1,5 g de amostra foram colocadas cuidadosamente sobre 1,5 mL de
HISTOPAQUE-1077 e centrifugados a 400 x g por 30 minutos a 20oC. Descartado
o sobrenadante, as amostras foram ressuspendidas em 500 L de Hanks. Alquotas
foram retiradas para avaliar a viabilidade. Foram descartadas aquelas com
viabilidade inferior a 75%.
A verso alcalina do ensaio do cometa foi realizada de acordo com SINGH
et al. (1988). Em suma, 10 L da suspenso celular previamente obtida foram
misturados agarose low melting point 0,5% (Promega), postos sobre uma lmina e
cobertos com uma lamnula. Estas foram imersas em uma soluo de lise gelada
(2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, 1% SDS, pH 10 com 1% Triton X-100
e 10% DMSO) e permaneceram a 4oC overnight. Este procedimento removeu o
citoplasma e a maior parte das protenas nucleares, deixando o DNA supercoiled
em um formato nucleide. A presena de quebras no DNA relaxa a espiralizao do
DNA e a subseqente eletroforese alcalina relaxa ainda mais as alas do DNA, que
ficaro, aps a eletroforese, com aspecto de um cometa. O tamanho da cauda de
cometa reflete a extenso das rupturas das hlices de DNA, e pode ser quantificado
por mtodos de intensificao de imagem e anlise computacional.
129
A atividade desta enzima foi medida pela tcnica descrita por REITMAN e
FRANKEL (1957), adaptada para o uso do kit AST/TGO Liquiform. A TGO
promove a transferncia do grupamentos amina de -aminocidos para -cetocidos.
O oxaloacetato formado determinado atravs da formao de hidrazona que
apresenta intensa colorao em meio alcalino.
Para a curva-padro foram preparadas solues contendo de 0 a 0,4 mL de
piruvato de sdio, de 0,6 a 1,0 mL de substrato para TGO (tampo, cido cetoglutrico, cido L-asprtico e azida sdica), 0,2 mL de gua deionizada e 1,0 mL
do reagente de cor (2,4-dinitrofenilhidrazina e HCl). Aps 20 minutos temperatura
ambiente, foram adicionados 10 mL de NaOH. Posteriormente, aps 5 minutos
temperatura ambiente, as absorbncias destes padres foram verificadas a 505 nm,
sendo que estes valores equivalem a 0 a 190 U/mL de TGO. Para as amostras, foi
utilizado 0,25 mL de substrato para TGO (2 minutos a 37 oC), adicionado 0,05 mL da
amostra (60 minutos a 37oC), 0,25 mL do reagente de cor (temperatura ambiente por
20 minutos) e 2,5 mL de NaOH. Aps 5 minutos temperatura ambiente, a
absorbncia verificada a 505 nm e a atividade enzimtica obtida na curva-padro.
130
131
6 RESULTADOS E DISCUSSO
132
Rao
controle (%)
0,00
Rao
hiperlipemiante (%)
2,52
Cprico ((C10:0)
0,00
3,26
Lurico (C12:0)
0,04
36,07
Mirstico (C14:0)
0,19
14,27
Palmtico (C16:0)
11,31
12,24
Esterico (C18:0)
3,34
5,50
25,67
18,39
53,96
7,31
0,17
0,03
Cis-11-Eicosadienico (C20:1)
5,32
0,41
Total saturados
14,88
73,86
Total monoinsaturados
30,99
18,80
Total poliinsaturados
54,13
7,34
133
reconstituda com gua, sem passar pelo processo de peletizao. Em geral, o teor de
umidade em dietas peletizadas para roedores varia de 7 a 10% (FROTA et al. 2008;
MENDONA et al. 2009).
O coeficiente de eficincia alimentar (CEA) foi menor para os grupos H e R e
maior para os grupos C, Z e F. De forma coerente, os grupos C, Z e F foram os
grupos que apresentaram maior ganho de peso. O grupo R teve menor incremento de
peso, ingerindo a mesma quantidade de rao.
H
62,06+3,72a
Grupos
R
66,63+16,23a
Z
56,63+13,07a
F
61,40+13,19a
122,70+15,30a
122,03+21,49a
114,50+19,43a
121,70+13,34a
126,40+12,68a
Ganho de peso(g)
62,35+13,52a,b
54,40+10,14 a,b
47,87+10,94a
65,07+10,08b
65,00+16,62b
Consumo de gua
(mL/dia)
16,22+6,95b
10,44+2,76a
11,11+3,70a
11,73+5,71a
11,02+2,65a
Consumo de rao
(g/dia)*
9,13+0,64a
8,87+0,53a
8,59+0,91a
9,43+1,07a
8,66+0,70a
22,76+4,01a,b,c
20,44+2,82a,b
18,58+2,74a
23,00+2,53b,c
25,02+4,72c
CEA (%)
* Base seca
CEA = coeficiente de eficincia alimentar (ganho de peso/consumo de rao total x 100).
C = grupo controle; H = grupo hipercolesterolmico; R = grupo hipercolesterolmico + alho cru; Z =
grupo hipercolesterolmico + alho cozido; F = grupo hipercolesterolmico + alho frito.
Letras diferentes na mesma linha indicam diferena estatisticamente significante (p < 0,05).
134
135
136
CT (mg/dL)
HDL-c
no HDL-c
(mg/dL)
(mg/dL)
TG (mg/dL)
94,96 + 5,06a
69,10 + 5,61a
29,40 + 1,84a
87,30 + 4,42a
154,94 + 3,36c
95,30 + 4,03c
60,00 + 2,45d
198,70 + 4,72d
132,38 + 9,80b
88,30 + 8,15b
45,30 + 2,26b
157,40 + 1,97b
124,62 + 8,80b
81,30 + 7,47b
42,60 + 4,01b
152,10 + 9,86b
127,44 + 7,29b
78,70 + 8,74b
52,40 + 4,88c
178,20 + 10,43c
137
Variveis
GPx (moL/min.mg ptn)
0,83 + 0,07b
2,13 + 0,11b,c
11,28 + 1,16b,c
0,64 + 0,06a
1,54 + 0,09a
9,22 + 0,43a
0,87 + 0,07b,c
2,19 + 0,10b,c
12,40 + 1,04c
0,95 + 0,04c
2,23 + 0,14c
15,41 + 1,54d
0,88 + 0,06b,c
2,07 + 0,06b
10,38 + 0,97a,b
138
grupos que receberam rao rica em colesterol e alho (R, Z e F) (Tabela 24). Neste
caso, o processo de fritura (grupo F) no alterou o potencial antioxidante quando
comparado com o grupo que recebeu alho cru (R). A ingesto de alho contribuiu com
o aumento da capacidade antioxidante em hamsters hipercolesterolemizados,
observado pelos altos valores de ORAC no plasma e no tecido heptico. O potencial
antioxidante do grupo Z foi 17% (plasma) e 21% (tecido heptico) maior do que o
grupo H. No estudo de VICENTE (2009) o grupo de animais que consumiram 2 mL
de infuso de caf foi 25,1% superior ao obtido para o grupo que no consumiu esta
bebida.
Tecido Heptico
7261,20 + 511,27c
14449,91 + 1384,82b
5611,11 + 367,59a
11926,94 + 1299,76a
6204,24 + 824,74a,b
12990,32 + 1333,90a,b
6836,75 + 524,80b,c
14056,66 + 1702,30b
5984,83 + 284,46a
13214,60 + 1210,91a,b
ET = equivalentes de trolox.
C = grupo controle; H = grupo hipercolesterolmico; R = grupo hipercolesterolmico + alho cru; Z =
grupo hipercolesterolmico + alho cozido; F = grupo hipercolesterolmico + alho frito.
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferena estatisticamente significante (p < 0,05).
139
Tabela 25 - Efeito da interveno com alho nos nveis de danos oxidativos ao DNA
avaliada pelo Ensaio cometa.
Grupos
6,76 + 1,00a
8,69 + 0,88b
7,57 + 1,14a
5,31 + 0,71a
9,13 + 1,28b
Os valores representam a mdia do tail moment (TM) em unidades arbitrrias + o desvio padro de
100 clulas.
C = grupo controle; H = grupo hipercolesterolmico; R = grupo hipercolesterolmico + alho cru; Z =
grupo hipercolesterolmico + alho cozido; F = grupo hipercolesterolmico + alho frito.
Letras diferentes na mesma coluna indicam diferena estatisticamente significante (p < 0,05).
140
45,13
43,27
42,62
42,12
43,61
42,26
39,85
39,94
43,17
50
42,96
U/L
40
30
20
10
0
AST
ALT
141
7 CONCLUSES
# O grupo que recebeu alho cru teve menor ganho de peso, mesmo consumindo a
mesma quantidade de rao do grupo cozido e frito;
# Os alhos cru e cozido e frito foram eficazes na reduo de lipdios no plasma dos
hamsters;
# Apenas os grupos hipercolesterolmicos suplementados com alho cru e cozido
obtiveram
melhora
no
potencial
antioxidante
em
relao
ao
grupo
142
8 CONCLUSO FINAL
143
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148
149
150
151
- Composio proximal:
1) Protenas - cido sulfrico P.A. (Dinmica Reagentes para Laboratrio),
hidrxido de sdio P.A., cido brico P.A., cido clordrico P.A e vermelho
de metila e azul de metileno (Labsynth Produtos para Laboratrio LTDA),
sulfato de cobre P.A. e sulfato de potssio P.A (Merck KgaA, Alemanha);
2) Lipdios - clorofrmio P.A., metanol P.A. e sulfato de sdio (CAAL
Produtos Qumicos Ltda);
3) Fibras tampo MES/TRIS, amiloglicosidase, -amilase e protease
(Sigma-Aldrich Co., EUA.); etanol P.A. (CAAL Produtos Qumicos Ltda); l
de vidro e detergente neutro (Merck KgaA, Alemanha); cido clordrico P.A.
(Labsynth Produtos para Laboratrio LTDA).
- Perfil de cidos graxos:
Padro Lipid Standard - Fatty acid methyl ester mixture # 189-19 (SigmaAldrich Co., EUA); trifluoreto de boro-metanol BF3 (Merck KgaA,
Alemanha); hexano P.A., hidrxido de potssio P.A., etanol P.A. (Dinmica
Reagentes para Loboratrio).
- Minerais:
1) selnio - padro multielementar rastrevel, cido nitrco grau HPLC, acdo
clordrico grau HPLC e perxido de hidrognio (Merck KgaA, Alemanha);
2) cobre - padro Titrisol CuCl2 (cloreto cprico), perxido de hidrognio e
cido nitrco grau HPLC (Merck KgaA, Alemanha);
3) zinco - padro Titrisol o ZnCl2 (clorato de zinco), perxido de hidrognio e
cido nitrco (Merck KGaA Alemanha).
- Extratos:
Etanol P.A., metanol P.A. e acetona P.A. (CAAL Produtos Qumicos Ltda).
- Compostos fenlicos totais:
Reagente de Folin-Ciocalteau e cido glico (Sigma-Aldrich Co., EUA);
carbonato de sdio (Synth- Labsynth produtos para laboratrios Ltda).
152
(2,2-azobis(2-amidinopropano),
fluorescena
(3,6-diidroxi-
153
Equipamentos utilizados:
154
155
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
30.0
32.5
35.0
37.5
min
27.5
30.0
32.5
35.0
37.5
min
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
30.0
32.5
35.0
37.5
min
C
18:1
C
16:0
4.0
C
18:2
uV(x10,000)
5.0 Chromatogram
C
18:0
C
20:1
3.0
2.0
1.0
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
30.0
32.5
35.0
37.5
min
156
157
158
159
Rao controle
Rao hipercolesterolmica
160
2007
161
Dados pessoais
2000 Livre-docncia.
Universidade de So Paulo, USP, Brasil.
Ttulo: Teor de Lipdios em Alimentos e sua importncia na Nutrio, Ano de
obteno: 2000.
Palavras-chave: CSI; dieta aterognica; teor de lipdios; Indice de Colesterol;
PCA.
Grande rea: Cincias Agrrias / rea: Cincia e Tecnologia de Alimentos /
Subrea: Cincia de Alimentos / Especialidade: Valor Nutritivo de Alimentos.
Setores de atividade: Nutrio e Alimentao.