Anda di halaman 1dari 8

Sirosis Biliaris Primer-Antibodi Antimitokondrial Spesifik pada

Hemokromatosis Neonatal
Latar belakang dan Tujuan. Hemokromatosis Neonatal (HN) ditandai dengan
adanya lesi hepar yang berat dan siderosis ekstrahepatik sparing sistem
retikuloendotelial. Etiologinya tidak jelas, meskipun telah dikemukakan sebagai
penyakit alloimun, yang berakibat dari reaksi imunologi pada self-antigen
(alloantigen) dimana tubuh mengenali sebagai benda asing. Peneliti meneliti bayi
dengan HN dan ibunya yang memiliki sera antibodi antimitokondial (AMA),
suatu petanda dari sirosis biliaris primer (PBC).
Bahan dan Metode: Untuk meneliti sumber AMA pada bayi, peneliti meneliti
distribusi isotipe pada serum dari ibu dan bayi. Sampel serum diperoleh pada saat
diagnosis HN, setelah transplantasi hepar (LT, usia 1 bulan), dan sampai 17 bulan
berikutnya.
Hasil. Pada diagnosis HN, serum bayi dan ibu yang mengandung AMA dari
isotipe IgG, predominannya adalah subklas G3 dan G1. AMA secara kuat bereaksi
terhadap subunit pyruvate dehydrogenase complex E2 (PDC-E2), autoantigen
AMA spesifik PBC. Respon anti-PDC-E2 pada bayi dan ibu turun dari waktu ke
waktu, yang ditunjukkan 2 bulan setelah LT (ibu dan anak) dan hilang 10 bulan
kemudian (ibu) dan 17 bulan kemudian (anak).
Simpulan. Hubungan dari AMA subklas IgG1 dan IgG3 yang ditransmisikan
secara maternal dengan gambaran kerusakan hepar pada bayi dengan HN dapar
mengarah ke hubungan kausal antara antibodi dan kerusakan hepar.
1. Pendahuluan
Hemokromatosis Neonatal (NH) merupakan kondisi yang jarang dengan
etiologi yang tidak diketahui ditandai dengan kerusakan hepar perinatal dan
siderosis ekstrahepatik sparing sistem retikuloendotelial [1,2]. Tidak terdapat
faktor genetik atau infeksi yang teridentifikasi yang menjelaskan angka kejadian
60-80%-nya pada kehamilan yang mengikuti indeks kasus [1, 3-7]. Usulan terbaru
bahwa HN adalah penyakit alloimun didasarkan pada pola kejadian yang serupa

dengan penyakit alloimun lainnya, pada kemampuan pemberian imunoglobulin


intravena selama kehamilan yang secara substansial bertujuan untuk memperbaiki
atau untuk mencegah penyakit hepar fetal pada saudara kandung dari pasien, dan
pada gambaran bahwa hepatosit pasien mengandung komponen rakitan dari jalur
kaskade komplemen bersama dengan IgG dari sumber maternal [2, 7-11].
Sebuah bukti langsung bahwa HN adalah autoimun hilang karena tidak
adanya target yang teridentifikasi untuk alloantibodi putatif [9,12]. Autoantibodi
dari sumber maternal, seperti anti-Ro dan anti-La, telah dijelaskan pada beberapa
anak dengan HN [3, 13-17]. Relevansi dari antibodi tersebut, yang tidak spesifik
hepar [18], terhadap proses patogenik pada HN tidak jelas, meskipun mereka telah
mengaitkan dengan penyakit hepar pada kasus-kasus yang jarang [19]. Peneliti
melakukan penelitian pada bayi dengan HN yang memiliki serum yang
mengandung antibodi antimitokondial (AMA), suatu petanda sirosis biliaris
primer (PBC), suatu penyakit yang lebih sering menyerang wanita (>95%) yang
secara khas mengenai middle-AMA yang ditemukan pada bayi ini, yang
menunjukkan sumber ibunya dan membahas relevansi potensial terhadap
terjadinya HN.
2. Bahan dan Metode
2.1 Subjek. Sampel serum dari ibu dan anaknya yang menderita HN, didapatkan.
Ini merupakan kehamilan pertama pada wanita Eropa Timur usia 27 tahun tanpa
adanya riwayat kehamilan signifikan yang meliputi oligohidramnion, symmetrical
intrauterine growth retardation, dan penurunan gerak bayi. Setelah persalinan
spontan pada usia aterm, pasien melahirkan per vaginam bayi laki-laki dengan
berat lahir 2,170 kg (kecil untuk usia kehamilan: < persentil ke-2) dengan lingkar
kepala 33 cm (<0,4 persentil). Skor apgar tidak tercatat dan plasenta tidak
diperiksa; bayi dideskripsikan dalam kondisi yang baik. Dislokasi pinggul kiri
ditemukan.
Evaluasi untuk menyusu yang kurang dan hipoglikemi pada usia 2 hari
teridentifikasi untuk koagulopati [INR 2,3, nilai normal <1,2], resisten terhadap
vitamik K parenteral. Fungsi sintesis hepar rendah [albumin serum 22 g/L,

rentang normal: 35-50]. Indeks penurunan fungsi hepatik dan renal meskipun
dengan terapi untuk dugaan sepsis dan bayi tersebut dipindahkan ke Pusat Hepar
Anak pada Rumah Sakit Kings College pada usia 7 hari. HN dicurigai dari usia
pasien, riwayat dan hasil pemeriksaan klinis-laboratorium [ferritin serum
1481ng/mL (nr: 20300), INR 5,37, albumin 26g/L, AST 44IU/L (nr: 1050),
ALT 30IU/L (nr: 1050), dan bilirubin total 292 mol/L (nr: 320)]. Sebelum
transfusi darah, total iron binding capacity adalah 28 mol/L(nr: 5072) dan
saturasi transferin adalah 70% (nr: 2050%) pada serum darah perifer.
Konsentrasi imunoglobulin serum adalah IgG, 5.53g/L (nr: 513); IgM, 0.63g/L
(nr: 0.050.2); dan IgA, 0.63g/L (nr: 0.010.08). Pemeriksaan autoantibodi
dengan imunofluoresensi indirek dan pemeriksaan molekuler menunjukkan
keberadaan AMA spesifik-PBC dalam serum dari anak dan ibunya (lihat di
bawah).
Diagnosis HN dikonfirmasi pada usia 12 hari dengan gambaran
mikroskopis spesimen biopsi mukosa bibir bawah, yang menemukan granul
hemosiderin di dalam sel-sel kelenjar asimer submukosa (Gambar 1). Bayi
diterapi dengan desferrioxamine intravena, sodium selenite pentahydrate, dan Nacetylcysteine dan disokong dengan transfusi darah dan produk darah. Pada usia
10 dan 16 hari, bayi diberikan imunoglobulin intravena (0.5g/kg), dan pada hari
ke 21 bayi menjalani single-volume exchange transfusion [22].
Status klinis yang buruk mendorong untuk dilakukan transplantasi hepar
pada usia 12 hari. Bayi menerima belahan alograf hepar cytomegalovirus
mismatched (donor+/resipien-). Pemeriksaan hepar yang dieksplantasi ditemukan
sirosis postnekrotik dengan kolestasis kanalikuler dan hepatoseluler (Gambar 2).
Bayi mengalami pemulihan lambat namun terus menerus. Yang mengikuti
episode terisolasi dari lip smacking, dan karena adanya mikrosefali, bayi
menjalani pemeriksaan neurologis lengkap, yang menemukan tidak adanya
penyebab untuk kejang; magnetic resonance imaging (MRI) menunjukkan
struktur otak yang normal dengan turrisefali. Bayi dipulangkan ke rumah pada
usia 92 hari, 2 bulan setelah transplantasi hepar. Dislokasi pinggul telah berhasil
ditangani pada usia 10 bulan dengan reduksi dan casting. Alergi terhadap antigen

susu, gandum, dan telur terdiagnosis pada usia 13 bulan selama evaluasi ruam
urtikaria. Infeksi virus Epstein Barr (EBV) terdiagnosis pada usia 16 bulan (EBV
DNA 136,907 salinan/mL, darah) dan pada usia 19 bulan infeksi saluran nafas
atas disertai dengan demam dan limfadenopati luas (EBV DNA 3,653,748
salinan/mL). Penyesuaian pada regimen imunosupresi secara cepat diikuti oleh
perbaikan klinis. Perkembangan normal pada usia 22 bulan, tanpa bukti klinisbiokimia dari penyakit hepatobilier, meskipun viremia EBV masih menetap (EBV
DNA 2,169,653 salinan/mL).
2.2 Pemeriksaan Autoantibodi. Sampel serum diperoleh dari anak saat datang
dan saat usia 17 bulan kemudian (yang meliputi sampel sebelum dan sesudah
transplantasi hepar) dan dari ibu saat diagnosis HN pada bayi serta 4 dan 10 bulan
setelah melahirkan dites untuk autoantibodi. Informed concent diperoleh.
Pemeriksaan autoantibodi mengikuti prinsip-prinsip pada Deklarasi Helsinki.
Sampel disimpan pada suhu -800C sampai digunakan.
Autoantibodi dilihat dengan menggunakan imunofluoresensi (IFL) dengan
menggunakan substrat jaringan hepar/ginjal/gaster tikus (KSL Slide, INOVA, San
Diego, CA) dan sel-sel epitel manusia (HEp-2) (INOVA) pada saat memulai dilusi
serum 1/20 sampai habis. Autoantibodi terhadap hepar dan antigen nuklear dites
dengan kombinasi immunoassay yang meliputi ELISA (INOVA; EUROIMMUN,
Lbeck, Germany), multiparametric line immunoassay (EUROIMMUN), dan
Western blot. Pemeriksaan-pemeriksaan tersebut berdasar pada antigen M2
(AMA) yang dimurnikan dari mitokondria jantung babi; pada rekombinasi
individual E2 pyruvate dehydrogenase complex (PDC), branched chain oxoacid
dehydrogenase complex (BCOADC), dan oxoglutarate dehydrogenase complex
(OGDC) yang diekspresikan dalam sistem baculovirus (DIARECT, Freiburg,
Germany); atau pada ekstrak dari hepar primata atau dari nukleus sel Hep-2,
sebagaimana telah dijelaskan [23-27].
AMA pada awalnya dideteksi dengan IFL. AMA kemudian ditandai oleh
line immunoassay dan oleh MIT3 ELISA yang targetnya adalah molekul hibrid
yang berisi epitop-epitop mayor dari PDC-E2, BCOADC-E2, dan OGDC-E2

dikombinasikan dengan antigen M2 (M2-3E ELISA, EUROIMMUN).Untuk


meneliti spesifisitas respon AMA, reaktivitas terhadap autoantigen mitokondrial
spesifik-PBC diuji dengan in house ELISA. In house ELISA menggunakan
rekombinan antigen PDC-E2, BCOADC-E2, dan OGDC-E2 (DIARECT) sebagai
target individual. Secara ringkas, sumur-sumur pada plate dengan dasar yang rata
(MaxiSorp, NUNC, Thermo Scientific, Roskilde, Denmark) dilapisi dalam
triplikat dengan ODC-E2 (1 g/mL), BCOADC-E2 (1 g/mL), dan OGDC-E2 (2
g/Ml) diencerkan dalam larutan phosphate buffered saline (PBS, Sigma-Aldrich,
Coylton, Ayrshire, UK) yang mengandung Bovine Serum Albumin (BSA) pada
suhu 370C selama 1 jam. Setelah tahapapan pemblokan dengan BSA 2% selama 1
jam diikuti dengan 3 pencucian, sampel serum (1/100) dalam 0.1% PBS/Tween20
(Sigma-Aldrich) ditambahkan pada sumur-sumur dan plate yang telah dilapisi dan
diikubasi selama 1,5 jam dalam suhu ruangan pada shaker/ alat kocok. Setelah
pencucian (3x), horseradish peroxidase-conjugated anti-human IgG (INOVA)
ditambahkan. Plate kemudian didiamkan pada suhu ruangan selama 45 menit dan
chromogenic substrate tetramethylbenzidine (INOVA) ditambahkan. Plate
kemudian didiamkan pada suhu ruangan selama 15 menit dalam gelap. Reaksi
diakhiri dengan 100 L/well 4N H2SO4 dan absorbansi (densitas optikal, OD)
pada 450 nm dibaca terhadap well-well kosong pada alat pembaca mikroplate
(MRX, Dynex Technologies).
Reaktivitas IgG subklas-spesifik anti PDC-E2 diteliti dengan in-house
ELISA, dengan menggunakan horseradish peroxidase-labelled anti-IgG1, IgG2,
IgG3, and IgG4 (SouthernBiotech, Birmingham, AL) sebagaimana telah
dijelaskan [28]. Tiap sampel diuji pada triplikat dan rata-rata densitas optikal
dihitung.
3. Hasil
Pada saat datang ke unit kami pada umur 7 hari, serum bayi yang
mengandung AMA dari isotipe IgG dengan titer 1:80 dengan IFL; serum ibu yang
dalam waktu bersamaan mengandung AMA dengan titer 1:320 untuk IgG dan
1:40 untuk IgM. Autoantibodi lainnya, yang meliputi anti-nuklear, anti-otot polos,

anti mikrosomal hepar ginjal, anti-double stranded DNA, dan antigen antiextractable nuclear, tidak dapat ditunjukkan.
AMA bayi dan ibu bereaksi hanya dengan PDC-E2 (Gambar 3(a)) dan
milik klas IgG. Autoantibodi bayi secara predominan termasuk pada IgG3 dan
lebih kecil pada isotipe IgG1 (Gambar 3(b)). Tidak terdapat reaktivitas anti-PDCE2 dari isotipe IgM atau IgA. Distribusi antibodi anti-PDC-E2 yang sama terlihat
pada ibu, dengan perbedaan bahwa IgG4 dan IgM (1:40) antibodi anti-PDC-E2
juga tampak (Gambar 3(b)). Konsentrasi antibodi IgG2 anti-PDC-E2 dapat
diabaikan pada ibu dan bayi. Pada usia 4 bulan (3 bulan setelah transplantasi
hepar), serum anak masih bereaksi terhdap PDC-E2, meskipun titer antibodi lebih
rendah dibanding saat diagnosis (Gambar 3(c)). Reaktivitas anti-PDC-E2 juga
mengalami penurunan pada serum ibu (Gambar 3(c)). Antibodi anti-PDC-E2
dapat ditunjukkan pada anak usia 10 bulan dan dapat terdeteksi secara serentak
pada serum dari ibunya. Pada usia 17 bulan, reaktivitas anti-PDC-E2 pada anak
mengalami penurunan di bawah ambang detektabilitas (OD: 0,2; titik potong:
0,24; Gambar 3(c)). Antibodi klas IgM atau IgA anti-PDC-E2 tidak pernah
ditemukan pada anak.
4. Pembahasan
AMA, sebuah autoantibodi spesifik-penyakit hepar, dilaporkan di sini
untuk pertama kalinya pada bayi dengan HN. Semua bukti mengindikasikan
bahwa AMA bayi berasal dari ibu, karena termasuk dalam kelas IgG yang
melintasi plasenta dan menunjukkan pola IgG3 dan IgG1 yang sama pada ibu dan
bayi [29,30]. Serum ibu juga mengandung kuantitas kecil AMA dari isotipe IgG4
dan IgM, yang tidak melintasi plasenta [29]. Baik pada ibu dan bayi, AMA
memiliki target PDC-E2, antigen mayor AMA pada PBC, namun secara khusus
tidak reaktif dengan BCOADC-E2 dan OGDC-E2, dimana PBC biasanya dikenali
dengan serum yang mengandung antibodi anti-PDC-E2 [20, 21, 31].
Whitington dan kolega mendeskripsikan in vitro ikatan terhadap hepatosit
oleh antibodi isotipe IgG1 dan IgG3 maternal, yang diduga memiliki sasaran
alloantigen hepar pada bayi dengan HN setelah melintasi plasenta [8,9]. IgG

terisolasi dari bayi tersebut mampu untuk berikatan dengan hepatosit murin dan
untuk menginduksi nekrosis melalui aktivasi komplemen [8,9], suatu kejadian
yang secara imunohistokimia tercermin pada kumpulan komponen komplemen
terminal pada hepatosit bayi HN [10].
AMA yang tampak pada pasangan ibu-bayi memiliki sasaran PDC-E2,
suatu autoantigen yang secara tipikal dikenali oleh AMA dari pasien PBC, dan
termasuk dalam isotipe IgG3 complement-fixing dan IgG1, keluarga dari antibodi
yang dijelaskan oleh Whitington [8]. Antibodi IgG3 dan IgG1 terutama efisien
pada aktivasi sistem komplemen dan pada perekrutan sel-sel yang membawa
reseptor Fc yang memiliki kemampuan untuk fagositosis dan antibody-dependent
cell-mediated cytotoxicity [32-34]. Sebagai catatan adalah bahwa kemampuan
AMA untuk mengaktivasi sistem komplemen telah dijelaskan pada pasien dengan
PBC [35,36].
Jika AMA IgG3/IgG1 tampak pada bayi dalam penelitian ini mengenali
sasaran hepar yang secara patogenik relevan, sebagaimana dikemukakan untuk
PBC [37,38], AMA IgG3/IgG1 juga dapat berkontribusi terhadap perkembangan
kerusakan dan kegagalan hepar yang berat.
AMA kadangkala dideskripsikan pada penyakit hepar pada pasien anakanak. Gregorio dkk melaporkan seorang anak perempuan usia 12 tahun
mengalami hepatitis autoimun dengan AMA spesifik-PBS [39]. AMA menetap
sepanjang perjalanan penyakitnya sekalipun dengan terapi; pasien meninggal pada
usia 24 tahun dengan kegagalan hepar, yang mengikuti beberapa episode
ketidakpatuhan terhadap terapi dan peritonitis bakterial spontan [39]. Lebih
berkaitan dengan kasus kami, PDC-E2 yang memiliki sasaran AMA IgG3 dan
IgG1 yang ditransfer melalui plasenta telah dilaporkan pada dua bayi dengan
acute liver injury yang bertahan sampai antibodi menghilang [28].
AMA terlihat pada ibu dari pasien dengan HN dalam penelitian ini adalah
menarik untuk dua alasan: AMA terutama termasuk ke dalam isotipe IgM, yang
memberi kesan bahwa AM diproduksi sebagai bagian dari respon autoiumn
primer; yang konsentrasinya makin menurun dari waktu ke waktu dan secepatnya
menghilang, yang mengimplikasikan bahwa stimulus yang memicu autoantigen

telah surut. Hilangnya AMA, meskipun kadangkala dilaporkan, adalah tidak biasa,
karena AMA cenderung menetap sekali terdeteksi, menunjukkan adanya
perkembangan PBC [40]. Ibu dari bayi yang dilaporkan dalam peneliitan ini
secara teratur dimonitoring untuk kemungkinan munculnya AMA kembali,
khususnya pada kasus kehamilan baru.
Laporan terbaru menunjukkan bahwa AMA dapat dideteksi pada 40% pasien
dengan acute liver failure ketika antibodi terlihat dengan highly sensitive MIT3
ELISA [41,42]. Dalam penelitian kami, pemeriksaan MIT3 ELISA digunakan
untuk mengkonfirmasi hasil IFL; pemeriksaan ini menunjukkan AMA baik pada
ibu maupun bayi. Hubungan familial pada AMA dicirikan dalam penelitian ini,
AMA yang dideskripsikan oleh Leung dkk dengan menggunakan MIT3 ELISA
bersifat sementara [41]. Ketidaknampakannya berkaitan dengan kurangnya
kecurigaan genetik terhadap PBC. Prevalensi sesungguhnya dan keterlibatan
AMA yang mungkin pada penyebab kerusakan hepar berat yang menyertai HN
perlu untuk diteliti dengan menggunakan teknik yang sama-sama sensitif pada
rangkaian bayi yang terkena.
Meskipun peneliti tidak dapat secara definitif menghubungkan AMA
dengan lesi hepar pada bayi, dan HN merupakan komplikasi yang tidak diketahui
dari kehamilan pada wanita dengan PBC, tidak terdapat penyebab lesi hepar yang
lain yang teridentifikasi. Peneliti juga tidak dapat menyingkirkan AMA untuk
menjadi berkaitan dengan penyakit hepar yang terlihat pada bayi ini, karena
lintasan transplasental dari AMA telah dilaporkan pada bayi dengan lesi hepar dari
kasus yang tidak diketahui [28]. Selain itu, prevalensi AMA pada pasien HN
dan/atau ibu mereka belum dievaluasi.