3.1.1.

DETERMINACION DE HISTAMINA

Histamina: Amina biognica producida por la descarboxilacin del aminocido histidina.

3.1.2.

OBJETIVO

Determinar la cantidad de histamina en la MP recibida.

3.1.3.

ALCANCE

El procedimiento se aplica desde la Recepcin de Materia Prima.

3.1.4.

FUNDAMENTO: Rida Quick Histamin,

Es un ensayo colorimtrico para la cuantificacin de Histamina en pescado fresco, congelado

conservas en el rango de 0 a 40 ppm (mg/kg).
3.1.5.

MATERIAL Y METODOS

COMPONENTES DEL KIT Neogen 9515B

288 micropozos desglosables recubiertos con anticuerpos.

288 micropozos desglosables para mezclado con marca roja.

12 frascos con control de Histamina. Etiqueta amarilla.

02 frascos de solucin de Conjugado. Etiqueta azul.

6 sobres conteniendo polvo Buffer diluente (sample diluent) para extracto de muestra (10 mM
PBS). Se disuelve 1 sobre en 1 litro de agua. Se guarda en oscuridad a temperatura ambiente.

2 frasco cada uno con 40 ml de Buffer de lavado concentrado (Wash buffer). El contenido de 1
frasco se disuelve en 960 ml de agua. Se guarda en oscuridad a temperatura ambiente.

2 frasco de solucin de Substrato K-Blue. Etiqueta verde

2 frascos de solucin stop. Etiqueta roja.

Equipo:

Molinillo o licuadora.

Probeta graduada a 100 ml.

Vaso de vidrio para preparacin de la muestra.

Papel filtro, pipetas1 ml., Tubo de ensayo.

Pipeta para dispensar 100 ul y bolsa de 1000 puntas de pipeta.

Balanza

Probeta plstica graduada de 100 ml

Reactivos:

Agua destilada

3.1.6.

PROCEDIMIENTO

Preparacin de la Muestra Para Pescado Crudo Fresco o Descongelado AOAC 937.07

a:
1. Limpie y eviscere tres pescados.
2. Haga tres cortes transversales de 2,5cm (1 pulg.) de grosor: uno

detrs de las aletas

pectorales, otro a la mitad del Orificio de respiracin y el tercero detrs del orificio de
respiracin.
3. Retire los huesos de las rebanadas.
4. Mezcle o muela o corte muy finamente las muestras combinadas

hasta que sean

homogneas.
5. Almacene las muestras a una temperatura de 2 a 8C hasta su anlisis.(Si no puede
trozar finamente las muestras Con una tijera,
plstica gruesa y proceda ah a

coloque los trozos dentro de una bolsa

desmenuzarlas por presin de los dedos).

6. Preparacin de la muestra: luego de molido

7. Moler y homogenizar la muestra. Pesar (segn muestra a realizar) y agregarle

agua destilada

(segn muestra a realizar)

Muestra representativa y
homogenizada puesta en
bolsa o frasco plstico

Agua a
adicionar

Mezclado
y filtrado

5 ppm

10 gr.

90 ml

SI

10 ppb

10 gr.

77 ml

SI

15 ppb

10 gr.

115 ml

SI

10 gr.

154 ml

SI

40 ppb

10 gr.

154 ml

SI

50 ppb

10 gr.

190 ml

SI

20 ppb

Dilucin del extracto filtrado

Adicionar
muestra
Adicionar
muestra
Adicionar
muestra
Adicionar
muestra
Adicionar
muestra.
Adicionar
muestra

500 ul al frasco con 10 ml de buffer diluente de

PROCEDIMIENTO DE MEZCLADO DE MUESTRA CON AGUA

100 ul a un vasito con 5 ml de diluente de

100 ul

a un vasito con 5 ml de diluente de

100 ul al un vasito con 5 ml de diluente de

100 ul a un vasito con 10 ml de diluente de
100 ul a un vasito con 10 ml de diluente de

Agitar vigorosamente por 20 segundos. Esperar 5 minutos. Agitar nuevamente por 20 segundos.
Esperar 5 minutos. Agitar nuevamente la muestra por 20 segundos. Dejar sedimentar por 30
segundos. Filtrar el sobrenadante. El extracto se coloca en un recipiente limpio.
1. PROCEDIMIENTO FILTRADO:
Conservas - filtre usando papel de filtracin rpida use la jeringa con filtro Neogen provedo en
el kit de extraccin. (Saque el embolo, coloque sobrenadante, coloque el embolo y presione.)
Pescado - filtre usando papel de filtracin rpida o deje que la mezcla sedimente (lo hace
rpidamente). Usando la pipeta de 100 ul retire sobrenadante libre de residuos.
2. USO DEL KIT ALERT

Separar pozos de mezclado (rojos) tantos como control y muestras a evaluar. Separar el
mismo nmero de pozos con anticuerpos (blancos). Ejemplo si va a evaluar 3 muestras
debe separar 4 pozos rojos y 4 pozos blancos

Usando 1 sola punta de pipeta, adicione 100 ul de Conjugado (frasco azul) a

todos los pozos rojos
Usando 1 nueva punta de pipeta adicione 100 ul del control al primer pozo rojo.
Con esa misma punta mezcle el contenido 3 veces (aspirar y botar suavemente).

Usando una nueva punta por cada muestra, adicione 100 ul de extracto filtrado
y diluido

a su correspondiente pozo rojo. Con esa misma punta mezcle el

contenido 3 veces (aspirar y botar suavemente).

Sea con puntas nuevas o usando la punta especfica de cada pozo transfiera
100 ul a su correspondiente pozo blanco. (No se olvide cada muestra es una
punta nueva). Al completar la transferencia de todos los pozos agitar
suavemente por deslizamiento en superficie plana por 20 segundos. Elimine
los pozos rojos.
Incubar por 10 minutos los pozos blancos. (Guardar los pozos en oscuridad por 10 minutos).

LAVADO: Despus de la incubacin,

botar todo el contenido de los pozos. Golpee enrgicamente los pozos sobre papel toalla para
eliminar residuos lquidos. Usando una pizeta o una jeringa llenar los pozos con el Buffer de
lavado. Botar el lquido. Repetir 3 veces ms. Despus de botar la ltima solucin de lavado,
golpee rpida y enrgicamente los pozos sobre papel toalla para eliminar residuos lquidos.
Usando 1 nueva punta de pipeta por cada pozo , adicionar 100 ul de Substrato
(frasco verde) a todos los pozos. Agitar por deslizamiento en superficie plana
por 20 segundos.
Incubar por 10 minutos pero en oscuridad.
Usando 1 nueva punta de pipeta por cada pozo adicionar 100 ul
de

Solucin stop (frasco rojo)

a todos los pozos. Agitar por

deslizamiento en superficie plana por 20 segundos

Si hace lectura visual, ponga los pozos encima de un papel blanco (para ver
mejor los colores) y haga lectura mirando de arriba hacia abajo. (Eso es todo).
Compare el tono de color de la muestra contra los correspondientes tonos de
color de los controles MIENTRAS MS AZUL ES EL POZO ES MENOS
HISTAMINA. MIENTRAS MS ROJO ES MAS HISTAMINA.

Ejemplo: CONTROL corrido a 10 ppm la muestra tiene menos de 10 ppm

3. RECOMENDACIONES

El Kit debe ser mantenido en refrigeracin (2-8C). La congelacin lo destruye y todos los
pozos generaran un color Rojizo.

Comience a trabajar el Kit, cuando los reactivos estn a temperatura ambiente. Esto est
referido a pozos, control Conjugado, substrato y solucin stop.

No trabaje el Kit en lugares expuestos al polvo y a plena luz del da.

Trabaje el Kit en lugares bajo techo.

El Kit ALERT HISTAMINA puede ser usado para determinar Histamina

al punto de corte

10, 15,20, 40ppm, etc. Sin Necesidad de cambiar el control provedo en el kit. Slo se debe
cambiar la manera como se realiza la dilucin

de la Muestra. De acuerdo a la tabla-

Preparacin del Extracto.

Se recomienda para la fase de extraccin, usar envases plsticos (bolsas o frascos con tapa),
debido a que el vidrio Captura la histamina, salvo que se disponga de material de vidrio
especial o ya tratado con cido.

Despus de hacer la dilucin (sea con agua o con el diluente de muestra), esta debe
mezclarse mediante agitador magntico.

Agua es agua destilada o Agua San Luis sin gas o similar. No usar agua de cao o agua des
ionizada. Despus de cualquier dilucin de Lquidos no olvide mezclar mediante suave
agitador magntico.

Todos los componentes del kit deben estar a temperatura ambiente antes de ser usados.

4. PREPARACIN DE SOLUCIONES

6 sobres conteniendo polvo Buffer diluente (sample diluent) para extracto de muestra (10 mM
PBS).

Se disuelve 1

sobre en 1 litro de agua. Se guarda en oscuridad a temperatura

ambiente.

2 frasco cada uno con 40 ml de Buffer de lavado concentrado (Wash buffer). El contenido de
1 frasco se disuelve en 960 ml de agua. Se guarda en oscuridad a temperatura ambiente

5. RESULTADOS:

Los resultados se realizan por lectura visual, comparando los tonos de color de los estndares
versus la muestra.

Estndares 0, 2.5, 5, 10, 20 ppm. (Intensidad de color del transparente al rojo oscuro).