Manual de Laboratorio de Biotecnología Farmacéutica 2014

UNIVERSIDAD AUTNOMA DEL ESTADO DE MXICO
FACULTAD DE QUMICA
PROGRAMA EDUCATIVO
QUMICO FARMACUTICO BILOGO
UNIDAD DE APRENDIZAJE
BIOTECNOLOGA FARMACUTICA
MANUAL DE LABORATORIO
ELABORARON:
D. en C. Enrique Morales Avila
D. en C. Jonnathan G. Santilln Bentez
Dra. en C. Ma. Dolores Hernndez
Julio 2013
Contenido
Congruencias con el contenido programtico de la unidad de aprendizaje..............................3
Evaluacin del curso.................................................................................................................4
Reglamento de laboratorio........................................................................................................5
Manejo de residuos peligrosos.................................................................................................7
Propsito general......................................................................................................................8
Prctica No. 1 Obtencin de cido ctrico con hongos........................................9
Prctica No. 2 Glucolisis anaerbica y Fermentacin.........................................13
Prctica No. 3 Obtencin de emulsina de almendras........................................17
Prctica No. 4 Curva de crecimiento microbiano y obtencin de proteasas
................................................................................................................................................22
Prctica No. 5 Fermentacin alcohlica...................................................................26
Prctica No. 6 Polmeros y biopolimeros.................................................................30
Practica No. 7 Preparacin de soluciones madre para los medios de
cultivo...................................................................................................................................33
Practica No. 8 Preparacin de los Agares para cultivar in vitro....................37
Prctica No. 9 Cultivo in vitro de plantas (semillas)...........................................40
Practica No. 10 Cultivo in vitro de plantas (rganos vegetales)....................42
Prctica No. 11 Obtencin del colorante natural Betalaina a partir de cultivos vegetales de
Beta vulgaris (betabel)............................................................................................................44
Prctica No. 12 Bioinformtica y biotecnologa..................................................50
Prcti
Introduccin
A travs de los siglos, el empleo de microorganismos en procesos fermentativos ha trascendido hasta
nuestros das en la industria alimentaria, qumica y farmacutica. Gracias al descubrimiento de la
gran variedad de aplicaciones potenciales de las bacterias, levaduras y hongos, surgi la
microbiologa industrial y el desarrollo de esta especialidad, as como la necesidad del hombre por
optimizar procedimientos tecnolgicos, para la elaboracin de productos de panificacin, cerveceros,
vincolas, lcteos, proteicos, antibiticos y aminocidos, entre otros, se cre una nueva rea
denominada biotecnologa.
La biotecnologa es una disciplina cientfica derivada de la biologa y la tecnologa que utiliza la
materia viva para degradar, sintetizar y producir los materiales (bioconversiones-biosntesis) en
consideracin a la actividad agroeconmica o a la industria en forma fcil y con buen rendimiento
econmico.
Esta rama aprovecha las enzimas libres o fijas, los microorganismos y a las estructuras sub-celulares
activas como biocatalizadores.
La biotecnologa farmacutica es la rama de la biotecnologa encargada del desarrollo de productos
biolgicos, estos se originan a partir de organismos vivos y clulas cultivadas para su transformacin
en protenas, hormonas, anticuerpos e incluso genes, sirviendo en ltimo trmino para desarrollar
nuevos tratamientos. Si bien hoy en da los productos farmacuticos representan entre el 5 % y el 7
% del mercado, se estima que en el 2010 las ventas de este tipo de producto superaron el 30 % del
total. Una de las principales ventajas de los frmacos producidos desde organismos vivos frente a los
tradicionales, es que provocan menos efectos secundarios, sin embargo su principal inconveniente
radica en la mayor dificultad de elaboracin, que eleva sustancialmente los costos de fabricacin.
Por otro lado, resulta ms atractiva la idea de utilizar biotecnologa aplicada a plantas para la
produccin de bienes de alto valor agregado tales como frmacos, pigmentos y saborizantes, nuevos
materiales de soporte para aplicaciones especificas, productos alimentarios innovadores y servicios
de alto valor, tales como procesos de seleccin de nuevos frmacos, procesos de diseo y
escalamiento de bioprocesos (ingeniera de procesos), servicios de diagnostico molecular de
enfermedades, que por sus mtodos qumicos de sntesis y procesos tradicionales.
Congruencias con el contenido programtico de la unidad de aprendizaje

Prctic
a
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Nombre de prctica
Sesione
s
Obtencin de cido ctrico por 2
hongos.
Glicolisis
anaerobia
y 1
fermentacin.
Obtencin
de
emulsina
de 1
almendras.
Curva de crecimiento y obtencin 1
de proteasas.
Fermentacin alcohlica.
2
Polmeros y biopolimeros
1
Preparacin de soluciones madre 1
para medios de cultivo
Preparacin de agares para cultivos 1
in vitro
Cultivo in vitro de plantas 1
(semillas)
Cultivo in vitro de plantas (rganos
vegetales)
Obtencin del colorante natural 3
Betalaina a partir de cultivos
vegetales
de
Beta
vulgaris
(betabel).
Bioinformtica y biotecnologa
1
Tema
Extraccin de ADN, PCR y 1

tcnicas
delectroforticas
(Laboratorio virtual WEB).
Transformacin
bacteriana 1
(Laboratorio virtual WEB).
Obtencin
de
penicilina
y 2
comprobacin de su accin
antibitica.
5.1.
1.5.1.
Microorganismos industriales
2.1.
Metabolismo energtico
3.1.1.
Fuentes de enzimas
3.1.1.
Fuentes de enzimas
3.2.
3.5.
4.2.
Fermentadores
Inmobilizacin celular
Produccin de metabolitos
secundarios
secundarios
secundarios
secundarios
Tcnicas de cultivo de tejidos
4.2.
4.2.
4.2.
4.2.
5.1.
5.1.9.
6.0
6.2.
Tcnicas
gentica
Tcnicas
gentica
de
ingeniera
de
ingeniera
Sistemas de husped para

DNA recombinante
Obtencin
de
productos
farmacuticos a travs de la
biotecnologa.
Antibiticos.
Evaluacin del curso

Evaluacin de laboratorio
Reportes
Aspecto
Presentacin general
Resultados
Discusin
Conclusiones (incluye cuestionario)
Referencias
Total
Valor
5
20
60
10
5
100
Desempeo en laboratorio
Aspecto
Conocimiento de la metodologa
Desarrollo de la prctica
Total
Valor
30
70
100
Calificacin final de Laboratorio

Reportes
Desempeo en laboratorio
Examen
Proyecto final *especificaciones
Total
Valor
50
30
10
10
100
Formato de los reportes

Identificacin
Objetivos
Resultados: no fotos, incluir grficos y observaciones generales observadas.
Discusin: realizar una discusin basada en argumentos cientficos slidos (artculos cientficos,
libros, patentes, reportes tcnicos, etc.)
Conclusiones: conclusiones puntuales del experimento extrapoladas con los conocimientos
adquiridos en la discusin.
Cuestionario
Referencias
Reglamento de laboratorio
El alumno conocer y aprender el reglamento interno y reconocer que su acatamiento har ms
seguro su trabajo en todo el laboratorio.
Debido a los riesgos que implica la manipulacin de sustancia perjudiciales al organismo humano, el
qumico debe siempre comportarse respetuoso de los peligros inherentes de su actividad y ejercer las
mayores precauciones. Es igualmente importante que conozca el dao que estas sustancias, mal
tratadas o mal desechadas pueden ocasionar a la salud humana y al ecosistema.
Por lo anterior, consideramos que es indispensable que todo profesional de la qumica conozca
adecuadamente el reglamento bsico al que debe ajustarse su comportamiento. El respeto de dicho
reglamento ayudar a preservar su salud e integridad fsica, lo sensibilizar sobre el hecho de que su
labor conlleva un riesgo para sus semejantes y su medio ambiente, y le permitir desarrollar el
sentido crtico necesario para enfrentar aquellas situaciones imprevistas para las que este reglamento
no es suficiente.
Se sugiere que este reglamento se lea y analice adecuadamente antes de iniciar cualquier actividad en
el laboratorio de biotecnologa farmacutica.
Reglamento bsico
A continuacin se presenta una serie de reglas bsicas que deben seguirse en el laboratorio de
biotecnologa farmacutica.
Conocer bien las propiedades fsicas, qumicas y toxicolgicas de las sustancia que se van a utilizar.
Usar bata de algodn, as como los materiales de proteccin necesarios (cofia, guantes, gafas).
Manipular el equipo caliente con guantes de asbesto o pinzas para evitar quemaduras.
Mantener libre de objetos innecesarios la zona de trabajo.
Nunca perder de vista los reactivos y el sistema con que se est trabajando.
No comer, fumar o jugar dentro del laboratorio.
Utilizar todo el material de laboratorio limpio y seco.
Nunca pipetear los reactivos con la boca.
Nunca regresar al envase original los remanentes de reactivos no utilizados.
Lavarse bien las manos al inicio y al final de cada sesin de laboratorio.
Antes de usar un reactivo, verificar los datos anotados en la etiqueta y consultar las propiedades
fsicas, qumicas y toxicolgicas para el manejo adecuado.
Nunca probar el sabor u olor de ningn producto a menos que sea estrictamente necesario y seguro.
Para oler una sustancia, esta no deber colocarse directamente bajo la nariz; por el contrario, se
mueve la mano sobre ella para percibir su aroma sin peligro.
Los productos qumicos nunca se tocan directamente con las manos, especialmente aquellos que,
adems de su toxicidad pueden producir quemaduras graves.
Todo compuesto voltil o que desprenda humos o vapores txicos deber manejarse en las campanas
o permanecer en un lugar ventilado.
Si se derrama cido sobre la mesa, se bebe recoger inmediatamente y lavar la superficie con agua
varias veces.
No debe mirarse dentro de un tubo o matraz que contenga una reaccin o sustancia que este
calentando.
Las soluciones concentradas de bases o cidos deben neutralizarse antes de ser desechadas al
desage.
No se deben tirar por la tarja lquidos inflamables, irritantes o lacrimgenos.
Cuando utilice cidos, hgalo en la campana de extraccin y siempre protegindose con guantes y
lentes de seguridad.
Para preparar una solucin diluida de cido se debe aadir, lentamente, con agitacin y con
enfriamiento externo, el cido al agua, nunca el agua sobre el cido ya que la reaccin es exotrmica
y puede proyectarse violentamente.
Manejo de residuos peligrosos

Los residuos peligrosos son aquellos residuos producidos por el generador con algunas de las
siguientes caractersticas: infecciosas, combustibles, inflamables, explosivas, reactivas, radioactivas,
voltiles, corrosivas y/o txicas, que pueden causar dao a la salud humana y/o al medio ambiente.
As mismo se consideran peligrosos los envases, empaques y embalajes que hayan estado en
contacto con ellos.
Al final de cada prctica se presentar una propuesta de clasificacin, registro y recoleccin de los
residuos qumicos, para su posterior almacenamiento y confinamiento.
Los residuos peligrosos biolgico infecciosos (R.P.B.I.) deben clasificarse y recolectarse de acuerdo
a la norma NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, que considera como R.P.B.I. los siguientes:
Los cultivos y cepas almacenados de agentes infecciosos.
Los cultivos generados en los procedimientos diagnsticos y de investigacin, asi como los
generados en la produccin de agentes biolgicos.
Su activacin y tratamiento se lleva a cabo entre otros, por mtodos qumicos o trmicos, es el caso
de la desinfeccin con hipoclorito de sodio y esterilizacin por calor seco o calor hmedo
frecuentemente utilizados en las reas de microbiologa.
Fuente: Gua para el manejo de residuos peligrosos de la UAEM (julio, 2006).
Propsito general
El propsito de este manual de laboratorio es introducir al alumno en las principales tendencias de
la biotecnologa moderna, como una disciplina capaz de aplicarse a las ciencias farmacuticas.
Poniendo de manifiesto que por medio de esta disciplina, se pueda acelerar el largo proceso que va
desde el descubrimiento de un nuevo frmaco hasta su produccin comercial.
Asimismo explicar y aplicar tcnicas de obtencin de cido ctrico, etanol, y colorantes por va
biotecnolgica, reconociendo las implicaciones en la reduccin de los costos de produccin,
proteccin al medio ambiente e incremento de la eficacia del principio activo.
En el curso prctico, se permitir al alumno aplicar sus habilidades para el desarrollo de
investigaciones relacionadas con la obtencin de frmacos por la va biotecnolgica y ser capaz de
reconocer como a travs de sus tcnicas se puede lograr la produccin de frmacos con mayor
relacin riesgo-beneficio.
FACULTAD DE QUMICA, UAEM

PROGRAMA EDUCATIVO: Qumico Farmacutico Bilogo
UNIDAD DE APRENDIZAJE: Biotecnologa Farmacutica
Prctica No. 1 Obtencin de cido ctrico con hongos
Introduccin
El cido ctrico es un constituyente natural de los frutos. Hasta 1920, la mayor exigencia del mismo
era satisfecha primeramente por la extraccin a partir de limones, sin embargo eran necesarios de 30
a 40 toneladas de limn para producir 1 tonelada de cido ctrico. En 1893 Wehmer indico que
algunos hongos de la especie Penicilium eran capaces de producir cido ctrico cuando se
desarrollaban en soluciones azucaradas y con sales inorgnicas, desde 1920 se desarrollaron con
xito procesos de fermentacin utilizando principalmente cepas de Aspergillus niger, aunque
tambin se han empleado diversos tipos de levaduras.
Objetivo general
Obtener cido ctrico por cultivo de esporas de Aspergillus niger en medio de cultivo enriquecido
con sales apropiadas para la generacin y crecimiento de la biomasa.
Fundamento terico
El cido ctrico se obtiene por extraccin natural de los jugos de frutas ctricas o artificialmente por
la transformacin del azcar realizada con algunos microorganismos entre los que se destacan ciertas
especies de hongos correspondientes al gnero Aspergillus. Estos trabajos de produccin metablica
con hongos se iniciaron en la dcada de los aos veinte con crecimientos miceliares en superficie,
continuaron algunos aos ms tarde con procesos sumergidos en cubas profundas y actualmente se
llevan a cabo tanto en superficie como en fermentadores de hasta 220 metros cbicos de volumen.
Lo realmente valioso de este tipo de produccin biotecnolgica es que ha alcanzado niveles muy
importantes, pues por esta va microbiolgica se obtiene ms del 99 % de la produccin mundial de
este cido orgnico que comercializado como monohidratado o como anhidro, es utilizado
fundamentalmente en las industrias de alimentos y bebidas en las que aumenta o preserva el sabor de
los jugos, de los extractos de jugo de fruta, de los caramelos, de los helados y de las mermeladas.
En la industria farmacutica (10% de la utilizacin total) se utiliza el citrato de hierro y el cido
ctrico como preservante de sangre, o en la elaboracin de tabletas, pomadas y en algunas
preparaciones cosmticas. En la industria qumica (25% del uso total) el cido ctrico se utiliza como
reemplazo de polifosfatos, como agente antiespumante, como reblandecedor y para el tratamiento de
textiles, mientras que en la industria metalrgica los metales puros se producen como citratos
metlicos.
10
Aspectos de seguridad e higiene

Para el uso de microorganismos son necesarios los implementos de seguridad que garanticen la salud
de usuarios tal como bata, cofia, goles, cubre boca, uso de mechero y soluciones desinfectantes.
Todo el material debe estar estril antes y despus de la prctica.
Materiales y reactivos:
*NOTA: el material necesario para el cultivo debe estar ESTERIL
Aspergillus niger
Erlenmeyer de 500 ml con tapn de algodn
Pipetas volumtricas
Jeringa desechable de 5 ml
Embudo Buchner de porcelana con matraz kitazato (solicitar con anticipacin al tcnico)
Asa micolgica
Papel indicador pH (1-7)
Mechero
Placa de agitacin orbital (solicitar con anticipacin al tcnico)
Gasas
Agua estril inyectable
Sacarosa
Nitrato de amonio
Dihidrogenofosfato potsico
Sulfato de magnesio
Hidrxido de calcio
cido sulfrico diluido
Piridina
Anhdrido actico
Hielo
Procedimiento
Primera parte
Dejar crecer durante aproximadamente 10 das a temperatura ambiente.

Sembrar Aspergillus niger en agar sabouraud (el medio se prepara en tubo de ensayo, se esteriliza con calor hmedo 15 psi
Segunda parte
Preparar un medio de cultivo lquido que por su composicin permita el crecimiento miceliar.
00 mL (pH: 2) que incluye: 19.0 g de sacarosa, 230 mg de nitrato de amonio, 100 mg de dihidrogenofosfato potsico, y 0.03g de sulfato de magnesio.
11
12
Para un ensayo cuantitativo, se debe consultar alguna farmacopea en la que se encuentren tcnicas especficas de anli
La aparicin de un color rojo indica la presencia de citrato.
a 15 mililitros
Se adicionan 5 mililitros de anhdrido
actico ydesepiridina,
mezcla.agregar unos pocos miligramos de un citrato disuelto o suspendido en 1 mililit
Identificacin cualitativa de citratos:

el sobrenadante, una
vez lavado en fro (agua de
hielo) se precipitan algunos
cristales de cido ctrico.
Se obtiene un precipitado de sulfato de calcio insoluble por lo que se filtra la solucin.
11. En
Una vezcon
neutralizado,
calienta y se
excesodiluido.
del hidrxido, con el que probablemente se obtiene un precipitado insoluble
El filtrado es tratando
cantidades se
equivalentes
deaade
cido un
sulfrico
Se filtra la solucin.
placa de agitacin (150 rpm) porDespus
espacio de
de 77 aa 14
14 das
das:en los que se controla peridicamente el pH para facilitar la obtencin del metabolito.
El medio de cultivo (microorganismo incluido), se macera y filtra, resultando un licuado cuyo pH se debe neutralizar
Una vez esporulado el hongo (en el medio agar sabouraud), se le agregan 5 mL de agua estril, se agita suavemente para desprend
ren al erlenmeyer donde se encuentra el medio de cultivo preparado con azucares 7 sales inorgnicas.
tivamente lenta puesto que la superficie de la capa de hongos ser pequea en comparacin con el volumen, inversamente con el empleo de recipientes
Cuestionario
Cul son los anlisis cuantitativos recomendados por la farmacopea en el proceso de obtencin de
citrato?
Cul es la va metablica que utiliza el Aspergilus niger para la produccin de citrato?
Es posible inhibir la sntesis de citrato por l microorganismo?
Por qu es importante el control del pH para la obtencin del producto?
Por qu es til el citrato en la industria farmacutica?
Cul son las razones para el uso de Aspergillus niger en relacin a otros microorganismos?
Observaciones
Bibliografa
CRUEGUER, Anneliese. Manual de Microbiologa Industrial. Editorial Acribia S.A. Zaragoza
Espaa.
3 edicin. 1989.
JAGNOW, Gerhard. Biotecnologa Introduccin con experimentos modelo. Editorial Acribia S.A.
Zaragoza Espaa. 1991.
PRESCOTT, S.C. Microbiologa Industrial. Aguilar S.A. Ediciones Madrid.
13

FACULTAD DE QUMICA
Prctica No. 2 Glucolisis anaerbica y Fermentacin
Introduccin
La respiracin celular es el conjunto de reacciones qumicas mediante las cuales se obtiene energa a
partir de la degradacin de sustancias orgnicas, como los azucares y los cidos, principalmente.
Comprende una primera fase donde se oxida la glucosa y requiere del oxigeno, por lo que recibe el
nombre de glucolisis anaerobica, la reaccin que se lleva a cabo en el citoplasma de la clula.
La fermentacin es un proceso catablico de oxidacin incompleto, siendo el producto final un
compuesto orgnico. Estos productos finales son los que caracterizan los diversos tipos de
fermentaciones.
En el proceso de fermentacin anaerbica intervienen dos sustancias orgnicas, que son metabolitos
de un mismo sustrato que durante el proceso de fermentacin se escinde en dos sustancias orgnicas
diferentes:
Sustancia reductora: Es la que dona los hidrogeniones y por lo tanto se oxida.
Sustancia oxidante: Es la que acepta los hidrogeniones y por lo tanto se reduce.
En los seres vivos, la fermentacin es un proceso anaerbico y en l no interviene la cadena
respiratoria. Son propias de los microorganismos, como las bacterias y levaduras. Tambin se
produce la fermentacin en el tejido muscular de los animales, cuando el aporte de oxgeno a las
clulas musculares no es suficiente para el metabolismo y la contraccin muscular.
Objetivo
Observar los efectos en una situacin simulada de la fermentacin anaerobia que en la realidad se
efecta en los seres vivos y verificar la inhibicin ocasionada en la ruta metablica de la glicolisis
por el NaF.
Fundamento terico
De todos los organismos vivientes solo unas pocas especies son estrictamente anaerobias, esto es,
que solamente pueden vivir en ausencia de oxigeno. La mayora son microorganismos, en particular
aquellas especies propias del ambiente que tiene poco oxigeno o que carece de l, es decir, en los
intestinos de los animales, en el suelo profundo, en sedimentos que se encuentran bajo los lagos y
ocanos o en pantano donde el oxigeno esta casi totalmente ausente. Un ejemplo de estas bacterias
del suelo Clostridium perfringens, que causa la gangrena gaseosa en infecciones de heridas.
El producto de la fermentacin vara de un tipo de clula o microorganismo a otro. Cuando se
requiere concentracin repetida de clulas musculares, el suministro de oxigeno no tiene capacidad
para mantener el paso de las demandas metablicas de la clula. En estas condiciones ciertos tipos
clulas musculares esquelticas regeneran NAD convirtiendo piruvato a lactato (fermentacin del
acido lctico). Las clulas de levaduras han enfrentado el desafo de la vida anaerobia con una
solucin metablica diferente, convierten el piruvato a etanol (fermentacin alcohlica, ver figura 1).
14
Figura 1. Esquema metablico de la fermentacin.

Materiales y reactivos
Tubos de ensayo de 13 x 100 con tapn de plstico (preguntar al profesor)
Vasos de precipitado de 300 ml
Bao maria
1 hoja de papel milimtrico
Manguera de plstico transparente de 3-5 mm de dimetro (se consigue en los acuarios, el dimetro
debe coincidir con la parte superior de la pipeta pasteur, tambin se puede usar un equipo de
venoclisis)
Pipera pasteur
Agua destilada
Levadura (fresca 5 a 10%)
Glucosa (5 a 10%)
Fluoruro de sodio (5 a 10%)
15
16
vadura y colocar cada pesada en un tubo de ensayo esteril adicionando 3 mL de solucin glucosada al 10 %, incubar 72 h a 28 C, transcurrido el tiemp
Examinar los tubos de la siguiente manera (si es posible durante 6 lecturas).

Tubo
A: cada tres minutos
11. Hacer el anlisis de la grfica y un anlisis de varianza
(ANOVA)
Tubo B: cada minuto
Tubo C: cada 15 minutos
y hacer una grafica colocando en la ordenada el tiempo en minutos y en la abscisa la produccin de CO2 en mL.
Colocar en bao mara a 37 C. (Si el procedimiento estuvo bien hecho, solo quedara una columna de aire en la parte su
Medir la altura del lquido en la manguera en U al conectar.
ico e introducir 0.5 mL de agua por el lado opuesto de la manguera (tenga cuidado el agua no debe llegar al medio de cultivo).
Conectar un segmento de manguera (40 cm) a la parte superior de la pipeta Pasteur.
tubo y taparlo, invertir suavemente para mezclar. No debe Introducir

quedar airedeenforma
la parte
cuidadosa
superiorundel
segmento
tubo. de una pipeta Pasteur en el tapn de plstico.
una tercera parte del tubo con suspensin de levadura*, agregue otra tercera parte con solucin de glucosa y termine de llenarlo con solucin de fluorur
2.2. Tubo B: Llene una tercera parte del tubo con suspensin de levadura* y agregue solucin de glucosa hasta llenarlo totalmente.
2.1. Tubo A: Llene una tercera parte del tubo con suspensin de levadura* y luego agregue agua destilada hasta llenarlo totalmente.
Marcar tres tubos de ensayo y prepararlos de la siguiente manera
Procedimiento
Cuestionario
1. El ATP da el impulso inicial para inicial al glucolisis, fosforilando la glucosa. Cul es la reaccin
involucrada en el proceso?
2. La fructosa 1-6-difosfato origina dos triosas que pueden interconvertirse. Cules son estas?
3. Los dos productos de la glucolisis piruvato y NADH, se pueden metabolizar siguiendo dos vas
muy diferentes segn el tipo de clula en la cual se generan. Cules son estas dos vas?
5. Escriba la reaccin de la fermentacin del cido lctico. Y diga dos ejemplos de clulas que la
realizan.
6. Escriba la reaccin de la fermentacin alcohlica y diga dos ejemplos de clulas que la realizan.
7. Escriba la reaccin general de la respiracin celular u oxidacin aerobia.
8. En qu lugar u organlo de las clulas procariotas y eucariotas se da la fermentacin (oxidacin
anaerobia del NADH) y la respiracin celular (oxidacin aerobia) y bajo qu condiciones se da cada
una?
9. Qu influencia tiene el NaF en el proceso de la fermentacin y por medio de que mecanismo lo
hace?
Observaciones
Bibliografa
CORN Y STUMPF, Bioqumica Fundamental, Editorial Limusa, 1998
DEVORE G. y Muoz Mena, Qumica Orgnica, Editorial Publicaciones Culturales, Mxico 1992.
17

FACULTAD DE QUMICA
Prctica No. 3 Obtencin de emulsina de almendras
Introduccin
Se obtendr la enzima emulsina (-galactosidasa) a partir de almendras amargas, la cual es capaz de
degradar los enlaces -glucosidicos, presentes en polmeros como la celebiosa o maltosa obteniendo
azucares simples como D-glucosa o D-galactosa.
Objetivo
Obtener una enzima, la emulsina, a partir de almendras dulces.
Comparar la actividad de la emulsina obtenida, bajo dos diferentes temperaturas por accin sobre el
p-nitro fenil - -D- glucsido.
Fundamento terico
Las almendras dulces son muy nutritivas: ms de la mitad de su peso corresponde a grasas
vegetales digeribles, tienen ms protenas que la carne de vaca y son ricas en fsforo, calcio y
vitaminas del grupo B. Tambin poseen una enzima, la emulsina o sinaptasa, que favorece la
digestin. Desde el punto de vista medicinal, aumentan la secrecin de leche materna cuando
sta es escasa y tienen propiedades antihelmnticas, esto es, favorecen la expulsin de
lombrices intestinales. La leche de almendra, que se obtiene triturando almendras secas y
peladas y luego mezclndolas con agua, se recomienda como sustituto de la leche de vaca y
en tratamientos de problemas cardiovasculares y diabetes.
Las almendras amargas contienen adems amigdalina, un glucsido que por accin de la emulsina y
en presencia de agua, produce cido cianhdrico. Este cido, antiguamente llamado cido prsico, se
combina con el potasio para dar cianuro potsico, que es un veneno muy potente. Por suerte,
las almendras amargas, como su propio nombre indica, tienen mal sabor y son raros los casos de
envenenamiento involuntario por ingestin de esta variedad.
UNIONES GLUCOSDICAS
La unin glicosdica ms frecuente es la unin 1,4. El carbono anomrico de un azcar se
enlaza al tomo deoxgeno de C4 del segundo anillo.
18
Celobiosa: enlace glusdico -1,4.

La celobiosa, disacrido obtenido a partir de la hidrlisis parcial de la celulosa, contiene un enlace
1,4. El carbono anomrico de una unidad de glucosa se une, a travs de un enlace ecuatorial
() carbono-oxgeno, al C4 de otra unidad de glucosa. A este enlace acetlico -1,4 entre
dos molculas de glucosa se lo denomina enlace -1,4glucosdico.
Maltosa: enlace glucosdico -1,4.

La maltosa es un disacrido que se obtiene cuando se trata el almidn con cebada germinada,
denominada malta.Este proceso de malteado es el primer paso para la obtencin de cerveza,
transformando los polisacridos y monosacridos que fermentan fcilmente. Igual que la
celobiosa, la maltosa contiene un enlace glucosdico 1,4 entre dos unidades de glucosa. La
diferencia en la maltosa es que la estereoqumica del enlace glucosdico es en lugar de .

Erlenmeyer de 125 mL
Erlenmeyer de 250 mL
Vidrio de reloj
Embudo de vidrio (puede ser sustituido por un embudo Buchner con matraz Kitasato, solicitar
previamente al tcnico laboratorista)
Pinzas de tres dedos con nuez
Esptula
Agitador de vidrio
19
20
la extraccin con hexano, en las mismas condiciones.
ue las almendras en un vaso de precipitados de 400 mL, agregue 100 mL de agua caliente y deje remojar durante 15 minutos, despus de este tiempo pe
asvase su extracto hexnico procedente de la extraccin a temperatura ambiente o a reflujo, a un matraz de 125 ml y adapte un sistema de destilacin pa
Nota:
.
Extienda las almendras desengrasadas sobre un vidrio de reloj y permita que se sequen en la campana, ya secas debern pesarse y guardar
3. Filtre la mezcla.
4. Lave con 10 mL de hexano.
Coloque 30 g de las almendras peladas y molidas en un matraz Erlenmeyer de 500 mL al que se le adapta un tapn horadado, a
n manual, no caliente y mantenga estas condiciones por 15 minutos, posteriormente suspenda la agitacin.
Desengrase de las almendras

Procedimiento
Almendras 30 g
Hielo
Hexno
Acetona 50 mL
cido actico al 1 %
p-nitro fenil-D-glucosido
Probeta de 25 mL
Recipiente de peltre
Frasco vial
Matraz de bola con refrigerante
Matraz kitasato con embudo buchner
Placas de agitacin magntica con barra magntica
21
Con qu otros nombres se conoce a la emulsina?
Por su modo de accin, cmo se clasifica esta enzima?
Escriba la reaccin que se produce entre la enzima y el glucsido.
La comparacin de la actividad enzimtica de la emulsina extrada de las dos muestras de almendras
dulces tratadas, a que conclusiones le lleva.
Qu otro glucsido natural podra emplear para comprobar la actividad de la enzima?
Qu usos podra darle al residuo de las almendras?
Proponga un mtodo para hacer la determinacin cuantitativa del p-nitro fenol formado durante la
reaccin con emulsina.
Cuestionario
6. Agite y observe los cambios y el tiempo en que se producen.
quela en un frasco vial, agregue 2 ml de agua destilada, agite y agregue 1 mg del p-nitro fenil--D-glucsido.
Tome un poco de la emulsina que se encuentra en el papel filtro y colquela en un vidrio de reloj y deje s
Comprobacin de la actividad de la emulsina

5. Mantenga la solucin en el bao de hielo durante 10 minutos, posteriormente filtre por gravedad.
ina se puede recuperar del papel filtro y coloca en un vidrio de reloj y se seca por evaporacin.
4. La solucin filtrada se enfra en bao de hielo, y se le aade poco a poco 25 mL de acetona.

3. Se suspende la agitacin y se filtra por gravedad (o al vacio).
Pesar 10 g de polvo de almendras desengrasadas y colocarlas en un matraz Erlenmeyer de 125 mL

r 40 ml de cido actico al 1 %, someta la mezcla a una agitacin constante durante 20 minutos.
Extraccin de la emulsina
Observaciones
Bibliografa
Giral .J. y Rojahn, Productos Qumicos y Farmaceuticos, Mx. (1966).
Quintero Angelina. Facultad de Qumica. Tesis. Mxico D.F. (1963)
Methods in enzimology Vol.VIII, pg. 42
Baker, Pardoe, Hapton, Nature, 197, 231 (1963)
http://bq.unam.mx/wikidep/uploads/MensajeBioquimico/Mensaje_Bioq04v28p061_Polaina_04.pdf
22

FACULTAD DE QUMICA
Prctica No. 4 Curva de crecimiento microbiano y obtencin de proteasas
Introduccin
Los microorganismos producen una gran variedad de enzimas, la mayora de las cuales son
generadas en bajas cantidades y estn involucradas en procesos metablicos celulares. Muchas
enzimas importantes de produccin industrial, como las proteasas, son obtenidas utilizando
fermentacin. De manera general, este proceso se puede definir como una operacin unitaria que
consiste en la transformacin biolgica de materias primas a productos a travs de microorganismos.
Objetivo
Establecer una curva de crecimiento a partir de un cultivo controlado de Bacillus subtilis.
Establecer el grado de relacin entre la produccin metablica secundaria de proteasas y las
diferentes fases de una curva de crecimiento microbiano.
Fundamento terico
El incremento poblacional que resulta de la multiplicacin celular, es un componente esencial de la
funcin microbiana, y con l se asocian, tanto el crecimiento, como la generacin metablica; de
hecho, las bacterias son mquinas de duplicacin constante en las que se incluyen reacciones cuya
finalidad es la formacin de las macromolculas necesarias para el ensamblaje de las nuevas
estructuras celulares de sus descendientes. Como en la mayora de los procariotes, el desarrollo de
una clula individual es continuo hasta la divisin en dos clulas nuevas (fisin binaria), el
conocimiento de las caractersticas de crecimiento de un microorganismo es muy importante, pues
con ello se pueden reproducir los procesos industriales y aumentar los rendimientos propios de los
procesos generadores de metabolitos.
En cultivos de produccin por lotes (sistema batch), el aumento en la masa celular como
consecuencia del cambio en el nmero de clulas o absorbancia (Abs) por unidad de tiempo
(Velocidad de crecimiento), permite establecer una curva tpica de crecimiento (Figura 1) en la que
se pueden observar las diferentes fases de la misma: latencia (a), exponencial (b), estacionaria (c) y
muerte celular (d), y el grado de asociacin de estas con la generacin de metabolitos primarios y
secundarios, pues los primeros son aquellos que se forman durante el crecimiento exponencial,
mientras que los segundos, como las proteasas objeto de la prctica, se producen casi al final de la
fase exponencial de crecimiento y son compuestos que no hacen parte del metabolismo energtico de
la clula.
23
Figura 2. Curva de crecimiento bacteriano, 1. Fase lag (latencia), 2. Fase log (exponencial). 3. Fase
estacionaria. 4. Fase de muerte celular.
El crecimiento microbiano se traduce en un incremento en la masa celular, en donde la Velocidad de
crecimiento, es el cambio en el nmero de clulas o absorbancia (Abs), experimentado en unidad de
tiempo.
Durante el crecimiento de los microorganismos, se generan una serie de metabolitos, que pueden
clasificarse como primarios y secundarios. Los primarios son aquellos que se forman durante la fase
de crecimiento exponencial y adems se forman como parte del metabolismo energtico de las
clulas, mientras que los metabolitos secundarios se forman casi al final de la fase exponencial de
crecimiento y son compuestos que no hacen parte del metabolismo energtico de la clula. Como
ejemplos de metabolitos se encuentran etanol, proteasas, entre otras.
*NOTA: Material estril necesario
24
Espectrofotmetro
agitador orbital
centrfuga
bao de agua
erlenmeyer (250 mL)
tubos de ensayo (3)
pipetas estriles de 1 y 5 mL
papel milimetrado.
Microorganismo Bacillus subtilis
Caldo nutritivo
Solucin de cido tricloroactico
casena (leche)
25
26
Una vezobservaciones.
alcanzada la fase exponencial, este volumen completo se utiliza como inculo del erlenmeyer y se incuba a 28 C con una agitacin orbit
10. Anotar
e cultivo y cuantificar la absorbancia (550 - 600 nm), utilizando como blanco el medio de cultivo estril que se almacena en los frascos pequeos.
ciona un mililitro de cido tricloroactico.
9. Se llevan los tres tubos a bao de agua (30C) durante 30 minutos.
L de medio de cultivo microbiano libre de clulas, previamente sometido durante 2 minutos a 100 C.
Con ayuda de un asa de cultivo, se toma una muestra del microorganismo a utilizar y transferir al tubo de ensayo dispuesto con los ci
Tubo 2 + 1 mL de medio de cultivo microbiano libre de clulas.

Esterilizar en autoclave.
e ensayo con cinco mililitros,
un erlenmeyer
cien
mililitros y veinticinco mililitros repartidos en frascos pequeos a razn de aproximadamente 3 m
Tubo
1 + 1 mL decon
agua
(blanco).
Al inicio de prctica, cada uno de los grupos de trabajo debe alistar ciento treinta (130 mL) de un medio de cultivo nutritivo preparado s
determinar
la produccin
se toman
muestras
con la periodicidad
indicada y se centrfugan (4.000 rpm, 10 minutos).
mLPara
de solucin
de casena
o lecheproteasas
muy diluida
siguiendo
las instrucciones
siguientes:
Parte 1. Curva de crecimiento
Parte 2. Determinacin de proteasas
Procedimiento
Cuestionario
Menciona al menos tres ejemplos de metabolitos primarios y secundarios de utilidad farmacutica,
obtenidos del metabolismo bacteriano.
Esquematiza la reaccin de las proteasas sobre la casena o leche.
Cul son los factores que afectan la obtencin de las proteasas?
Menciona las ventajas y desventajas de la obtencin de metabolitos intracelulares y extracelulares.
Observaciones
En esta prctica se utilizar como mtodo para determinar el crecimiento microbiano, la medida de la
densidad ptica, para ello se registrarn los resultados obtenidos en la siguiente tabla:
Lecturas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Tiempo de cultivo
Absorbancia (550 nm)
Reportar los datos obtenidos a partir de la accin del sobrenadante sobre la protena casena.
Bibliografa
Jagnow, G., David, W. Bitecnologa. Introduccin con experimentos. 1991. Editorial Acribia.
Zaragoza, Espaa. 251p.
Madigan, M., Martinko, J., Prker, J. 2004. Brock. Biologa de los Microorganismos. Dcima
edicin. Pearson Education S.A. Madrid. 1011p.
Martnez, M., Carrascal, A., Martnez, P. 1999 Manual de Laboratorio. Introduccin a la
Biotecnologa. Facultad de ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Bogot. 81p.
27

FACULTAD DE QUMICA
Prctica No. 5 Fermentacin alcohlica
Introduccin
La fermentacin alcohlica es un proceso anaerbico realizado por las levaduras y algunas clases de
bacterias. Estos microorganismos transforman el azcar en alcohol etlico y dixido de carbono. La
fermentacin alcohlica, comienza despus de que la glucosa entra en la clula. La glucosa se
degrada en un cido pirvico. Este cido pirvico se convierte luego en CO 2 y etanol. Los seres
humanos han aprovechado este proceso para hacer pan, cerveza, y vino. En estos tres productos se
emplea el microorganismo Saccharomyces cerevisae.
Objetivo
El alumno debe utilizar el metabolismo de las levaduras para producir alcohol etlico (etanol), a
partir de un jugo enriquecido con azcares fermentables.
Fundamento terico
La fermentacin alcohlica es utilizada desde la antigedad para realizar productos como la cerveza
o el vino. Sin duda, dichos procesos fueron esenciales para el desarrollo de la alquimia en la Edad
Media. Los descubrimientos qumicos posteriores llevaron al investigador, Gay-Lussac, a describir la
reaccin de fermentacin que tena lugar partiendo de la glucosa, con obtencin de etanol. Fueron
muchos cientficos los que intentaron dar explicacin al proceso que hoy conocemos como
fermentacin, pero hasta 1818 se descubre que las causantes del proceso eran las levaduras. Pocos
aos despus, se descubre la enzima responsable del proceso, la zimasa, otorgndose el Premio
Nobel de Qumica en 1897, por dicho descubrimiento, a Eduard Buchner. En los aos posteriores, se
sigui trabajando en el tema, hasta que en 1929, se descubre el co-factor NADH, esencial en el
proceso de fermentacin, pues su principal funcin es el intercambio de electrones.
Para describir la palabra fermentacin se refiri originalmente al metabolismo anaerbico de los
compuestos orgnicos mediante microorganismos o sus enzimas para dar lugar a productos ms
simples que la materia prima. La definicin actual es: Cualquier accin microbiana controlada por
el hombre para obtener productos tiles. Como todos los seres vivos, los microorganismos crecen,
se reproducen y segregan algunos compuestos bioqumicos de importancia para el hombre; estas son
las caractersticas en las que se ha basado el uso de los microorganismos como productores de
fermentacin, la que de una manera esquemtica se puede representar como:
Temperatura + O2
Microorganismos + CO2(g) + Productos intra y extracelurares.
Microorganismos + nutrientes
En el curso de la fermentacin alcohlica, el cido pirvico es descarboxilado a acetaldehdo y a

CO2. La reduccin de acetaldehdo forma etanol. Se pueden producir otras sustancias en pequeas
28
cantidades en especial el glicerol y el cido actico. Este proceso se lleva a cabo a atas
concentraciones de azucares (20 %) y a valores de pH entre 5.0 y 6.0; adems se requiere de un
inoculo grande y vigoroso. La cepa debe estar previamente adaptada a ciertos agentes qumicos
inhibitorios de crecimiento microbiano como lo es el pirosulfito y metabisulfito de sodio, adems de
ser resistente a grandes concentraciones de etanol y ser temperatura dependiente (alrededor de 20 C)
de acuerdo con el tipo de cepa empleado.
1 Agitador de vidrio
1 Anillo de Fierro
1 Cuchillo
1 Coladera grande
1 Matraz de destilacin
1 Mechero Bunsen
2 Pipetas graduadas de 5 ml
1 Pipeta graduada de 10 ml
1 Pinzas para tubo de ensayo
3 Pinzas universales
1 Pinzas Hoffman
1 Franela
1 Mortero con pistilo
1 Tela de alambre con asbesto
2 Tapones monohoradados
3 Tubos de ensayo de 16x150mm
1 Termmetro
1 Vaso de precipitado de 250 ml
45 cm de Manguera de ltex de 4mm de dimetro
1 Refrigerante
2 Soportes universales
1 Frasco claro con tapa, de 3 a 5 litros, de boca ancha.
1 Frasco claro sin tapa de 200 a 300 m
100 g de Glucosa
250g de cascara de pia
200 mL de jugo de pia
250g de piloncillo o azcar
100 mL de Hidrxido de bario al 2 %
6 mL de reactivo de Fehling A y B
2 L de Agua
29
Microorganismo de trabajo
Se emplear Saccaromyces cerevisiae, ser mantenido en tubos con medio inclinado de Sabouraddextrosa-agar, una vez inoculados los tubos se incubarn a 28 C durante 43 h.
Medios de cultivo y medio de produccin
La formacin del medio de cultivo para la elaboracin del inoculo o semilla se realizar con los
siguientes componentes:
Harina de granos
* piloncillo o melazasa tratadas (todas ajustadas a 25 Brix) 15 % de azucares.
** Jugo de frutas
(NH4)2SO4 ..1.0 g/L
(MgSO4.7H2O) .1.0 g/L
(NH4)2HPO4..1.0 g/L
Extracto de malta .10.0 g/L
pH .5.0-6.0
Procedimiento
Consideraciones
* Cuando un medio de cultivo se prepara a base de piloncillo, disolver este en un mnimo de agua y
calentar lentamente hasta la disolucin, pasarlo a l garrafn correspondiente y ajustar la
concentracin de azcares que se pide adicionando agua o piloncillo disuelto.
Nota. Esta prctica se llevara a cabo en 3 sesiones de laboratorio.
Primer Sesin
Comprimir la pulpa de la pia hasta obtener un volumen

Lavar, pelar
aproximado
y hacerde
trocitos
200 mldede2.5
jugo
cm aproximadamente de la cscara y de la pulpa de la pia (u otra
Lavar perfectamente 1 frasco claro de 3.5 L de boca ancha.
Adicionar al frasco 200 ml de jugo de fruta, toda la cscara de la pia en cuadritos, 250 g de piloncillo, 100 g de az
Del sobrenadante se extraer con 3 mL y se depositar en un tubo de ensayo.
Determinar
A la7.tapa
del frascoelsepHle har un orificio para adaptar 45 cm de manguera de ltex de 4 mm de dimetro a la cual se le col
30
31
Explica la diferencia metablica entre la fermentacin alcohlica y lctica?
Menciona al menos dos rutas metablicas diferentes que involucren la fermentacin alcohlica.
Por qu son necesarios los azucares reductores?
La descarboxilacin del piruvato es reversible? Explica detalladamente tu respuesta.
Cul son los productos de la reaccin catalizada por piruvato deshidrogenasa?
En una clula concreta, Cul son los factores que determinan el destino catablico del piruvato?
Cul es la coenzima derivada de la vitamina B1 que participa en la descarboxilacin oxidativa del
piruvato?
Cul es el fin metablico del piruvato?
Cuestionario
acin de pH y azucares reductores (repetir los pasos 7,8 y 9, de la primera sesin: (pH) y Azucares Reductores ( + o -).
Montar el equipo de destilacin y destilar el alcohol.
Transcurridos los 6 das, se decantar el sobrenadante en un vaso de precipitado.

Filtrar el sobrenadante.
Segunda Sesin
Anotar observaciones
Continuar la fermentacin por otros 6 das.
Se abre lentamente la pinza de Hoffman, con el objeto de que el gas producido entre en contacto con la
Transcurridas las 24 h sumergir la manguera de ltex del frasco en 100 mL de solucin de hidrxido de Bario al 2%, dispuesta en un fr
el segundo tubo. Calentar suavemente con el fin de detectar la presencia de azucares reductores.
teriormente agregan 1.5 mL de reactivo de Fehling A y 1.5 mL de reactivo de Fehling B
Observaciones
32
Bibliografa
CORN Y STUMPF, Bioqumica Fundamental, Editorial Limusa, 1998
DEVORE G. y Muoz Mena, Qumica Orgnica, Editorial Publicaciones Culturales,
Mxico 1992.
33
AUTNOMA DEL ESTADO DE MXICO

FACULTAD DE QUMICA
Prctica No. 6 Polmeros y biopolmeros
Introduccin
Los polmeros son tan antiguos como la vida misma ya que toda la vida en la tierra se basa en tres
tipos de polmeros: DNA, RNA y protenas. Las macromolculas o polmeros son molculas con una
estructura bsicamente covalente entre sus tomos pero que poseen un elevado peso molecular. Se
consideran polmeros molculas con masa moleculares superiores a 10 3 - 104, pudiendo llegar a
valores del orden de 1010 como el cido desoxirribonucleico. Este elevado peso molecular, y
consecuentemente tamao, es lo que les confiere unas propiedades peculiares.
Objetivo general.
Conocer procedimientos bsicos para la obtencin de polmeros naturales y sintticos, tiles en
procesos de biotecnologa.
Fundamento terico
El polmero es un compuesto qumico que posee una elevada masa molecular y que es obtenido a
travs de un proceso de polimerizacin. En tanto, la polimerizacin consiste en la unin de varias
molculas de un compuesto a partir del calor, la luz o un catalizador, con la misin de conformar
una cadena de mltiples eslabones de molculas y as entonces obtener una macromolcula.
Existen numerosos grupos de investigacin dedicados al estudio de las aplicaciones de los polmeros
inteligentes en biotecnologa y biomedicina. En este campo, destaca el uso de estos materiales como
vehculo para la administracin de frmacos. Por ejemplo, las caractersticas que presentan
determinados polmeros son de especial relevancia en la fabricacin de sistemas de suministro de
insulina para el tratamiento de pacientes diabticos.
Otra aplicacin interesante es el uso de sistemas polimricos biodegradables como soporte o
andamiaje en la regeneracin de tejidos o bien como implante para la fijacin de fracturas seas.
La industria farmacutica cuenta actualmente con diversos fabricantes de polmeros comerciales
sensibles a cambios de pH que son empleados como recubrimiento de frmacos.
34
En el campo de las tecnologas electrnicas, los polmeros conductores presentan similitud con los
fenmenos biolgicos, las propiedades y las funciones que realizan los msculos naturales. Gracias
al comportamiento electro-mecnico de estos polmeros inteligentes se han desarrollado msculos
artificiales con sensibilidad al tacto, que son capaces de empujar un obstculo de acuerdo al esfuerzo
necesario.
Los necesarios del laboratorio de biotecnologa farmacutica.
Materiales, reactivos y procedimiento:

Biopolmero de almidn
Los biopolimeros son plsticos derivados del almidn de maz. Se trata de un material que supone
diversas aplicaciones. Sus principales caractersticas es que puede degradarse en el medio ambiente
como la materia orgnica.
2.5 g de almidn o fcula de papa.
2.0 ml de glicerina
3 ml de HCl (dil)
3 mL de NaOH (dil)
Mezclar en un vaso de precipitado todos los ingredientes a excepcin del NaOH y agregar 20 mL de
agua. Colocar en un bao maria durante 15 min en agitacin constante. La solucin se pondr
viscosa. Neutralizar la mezcla agregando los 3 mL de la solucin de NaOH y mezclar.
Verter el contenido sobre una placa de vidrio, extendindolo lo ms homogneamente posible.
Colocar en una estufa (no mayor de 100 C) hasta secar.
Formacin de polmeros de Alginato
Se realiza por precipitacin de la solucin de alginato sdico, gota a gota, sobre una disolucin de
cloruro clcico. Concentraciones de alginato sdico: 2,5 y 3,5% y concentracin de cloruro clcico:
0,5. Las esferas resultantes se dejan en agitacin suave por media hora y posteriormente se lavan con
agua destilada.
Polimeros de Slime
100 mL de disolucin de polialcohol vinlico 4% (PVAL). 250 ml de disolucin de borato de sodio
4% en recipiente cuentagotas 1 Colocar 10 ml de PVAL 2 Adicionar 15 gotas de la solucin de
borato de sodio al PVAL y remueve hasta que no se produzca ningn cambio 3 Saca el polmero del
recipiente y djalo encima de la mesa. Observa las propiedades del producto que has obtenido.
35
Formacin de polmeros de quitosano

Se sintetizan por precipitacin de una solucin al 2% de quitosano disuelto en cido actico al 2%,
sobre otra disolucin de hidrxido sdico. Se utilizarn dos concentraciones de hidrxido sdico:
0,5 y 1,0 M. Las esferas de quitosano formadas se mantienen por 30 min en la solucin de NaOH y
luego se lavan con abundante agua destilada hasta llegar a la neutralidad. El polmero resultante es
soluble en cidos diluidos y presenta pobres propiedades mecnicas.
Cuestionario
Qu es un polmero?
Qu es un biopolmero?
De acuerdo a su origen, cmo se pueden clasificar a los polmeros?
Que es una reaccin de policondensacin
Que son los homopolmeros y los copolimeros
Describe dos tipos de reacciones por las que se puede llevar a cabo la polimerizacin.
Describe las aplicaciones biotecnologcas de los polmeros.
Realiza una revisin bibliogrfica donde se mencione el uso de polmeros en procesos de
biotecnologa (cita las referencias).
Observaciones
Estudio de propiedades mecnicas:
- Comparar las propiedades qumicas de los diferentes polmeros. (Estralos suavemente y despus
fuertemente).
- Prueba si un trozo pequeo se aplana cuando lo aprietas.
Bibliografa
Billmeyer F.W. 1975. Ciencia de los polmeros. Ed. Reverte
MARA CINTA VINCENT VELA, SILVIA LVAREZ BLANCO, JOS LUIS ZARAGOZ
CARBONELL. 2006. Ciencia y tecnologa de polmeros. Ed. Universitaria Politec.Valencia
36

FACULTAD DE QUMICA
Practica No. 7 Preparacin de soluciones madre para los medios de cultivo
Objetivo
Que el alumno obtenga un conocimiento prctico sobre los diversos mtodos de preparacin de
medios de cultivo para propagar in vitro.
Fundamento terico
Son muchos los componentes de un medio para cultivar material vegetal "in vitro": por ejemplo, se
encuentran las sales minerales que incluyan todos los elementos esenciales tanto micro como
macronutrientes, las vitaminas tales como riboflavina, tiamina, piridoxina, cido nicotnico, cido
pantotnico, biotina, y cido flico. Aminocidos tales como L-glutamina, asparragina y cistena, los
hexitoles como mioinositol, hormonas y reguladores del crecimiento, una fuente de carbono y un
agente gelificante.
Un mtodo de hacer menos tedioso el trabajo consiste en preparar lo que se conoce como "soluciones
madre" de algunos de estos componentes. Estas soluciones tienen una concentracin que suele ser
10, 100 e incluso 1000 veces superior a la concentracin final del medio. Su ventaja no estriba slo
en el hecho de que hay que pesar menos veces cada vez que se prepara el medio sino tambin la
exactitud de la pesada ya que algunos compuestos estn tan diluidos en la solucin final, que la
pesada que habra que hacer estara por debajo de los lmites de exactitud de las balanzas de
precisin.
Las soluciones madre se conservan en frio y en bote color mbar durante algunos meses,
desechndose ante cualquier seal de precipitacin. Se suelen preparar soluciones madre de las sales
minerales, los aminocidos, hormonas, vitaminas y hexitoles, mientras que la fuente de carbono y el
agente gelificante se pesan cada vez ya que se necesitan en cantidades muy elevadas y no se
conservan bien en solucin.
En el caso de las hormonas es mejor preparar una solucin madre de cada una de ellas y medir
volmenes determinados y congelarlos.
37
Materiales y reactivos:
Botes de cristal o de plstico (preferiblemente de los primeros por su transparencia), que en algunos
casos habrn de ser de color mbar para proteger de la luz determinados compuestos que son
fotosensibles.
Balanza granataria
Balanza analtica
Esptulas de distinto tamao para pesar
Precauciones.
Para medidas desde 0.01 g se utilizar la balanza granataria. Para valores inferiores la balanza
analtica.
Antes de pesar hay que tarar el recipiente donde se est haciendo la pesada.
Nunca se debe pesar directamente sobre el platillo de la balanza, favor de colocar pesa sustancias.
Antes de introducir la cucharilla de pesar en un frasco de reactivo hay que asegurarse de que est
limpia y seca. Es una precaucin que evita la contaminacin de los reactivos.
Hay que tener la precaucin de tomar del frasco de reactivo muy poca cantidad de modo que en la
medida de lo posible se evite devolver al frasco parte de lo que se tom.
Procedimiento
Normas generales a la hora de preparar las disoluciones
Si la disolucin se va a remover con un agitador mecnico el mejor recipiente es un vaso de
precipitados. Si la agitacin es manual, suele ser mejor un erlenmeyer.
- Antes de empezar a aadir los solutos se deber poner un 70% del volumen total de agua
- Cuando una disolucin incluya ms de un reactivo, estos se aadirn uno a uno y teniendo la
precaucin de no aadir uno hasta que el otro est totalmente disuelto.
- Para enrasar al volumen final se utiliza un matraz aforado o una probeta, nunca un vaso de
precipitados o un erlenmeyer.
- Una vez preparada se debe guardar en un frasco perfectamente etiquetado en el que figuren los
siguientes datos:
- Tipo de solucin. Ej. Macro de MS, sol A de DKW etc
- Grado de concentracin. Ej 100 X (100 veces ms concentrada que la solucin final)
- Componentes con frmula y peso en g/l
- Fecha de preparacin
- Nombre de los integrantes del equipo
Equipo 1 Preparar 250 ml de la solucin de macronutrientes del medio MS.
Equipo 2 Preparar 250 ml de la solucin de Calcio MS y 250 ml de la solucin de Hierro y EDTA
MS. En este segundo caso, se deber poner en el recipiente donde se prepara la disolucin un
volumen de agua de aproximadamente un 80% del final y adicionar la solucin de hierro. Cuando se
haya disuelto, adicionar poco a poco y en agitacin las sales de EDTA hasta su total disolucin.
38
Si es necesario, se puede calentar un poco la disolucin. Guardar en frasco mbar y colocar en

refrigeracin.
Equipo 3 Preparar 250 ml de la solucin de micronutrientes del medio MS.
Equipo 4 Preparar 250 ml de la solucin de vitaminas del medio MS.
Equipo 5 Preparar 250 ml de de cada una de las siguientes soluciones A, B, C y D del medio DKW.
Equipo 6 Preparar 250 ml de cada una de las siguientes soluciones: F1, G, H y las hormonas del
medio DKW.
- La solucin H se prepara del siguiente modo: se pone en el recipiente donde se prepara la
disolucin un volumen de agua de aproximadamente un 80% del final y se adiciona la sal de hierro.
Cuando se haya disuelto, se adicionan poco a poco y en agitacin las sales de EDTA hasta su total
disolucin. Si es necesario, se puede calentar un poco la disolucin. Guardar en frasco mbar
en refrigeracin.
- Hormonas. Se prepararn 10 ml de cada una de las disoluciones.
Para cada una de ellas se proceder del siguiente modo: Se pesar la hormona en el un tubo aforado.
Se le aaden unas gotas de NaOH 1N y se disuelve. A continuacin se va aadiendo poco a poco y
agitando, agua destilada hasta enrasar los 10 ml. Se agita bien y se reparte en 10 eppendorf.
Se rotulan cada uno de ellos y se guardan en el congelador.
Equipo 7 Preparar 250 ml de la solucin E
Equipo 8 Preparar 250 ml de la solucin F2. Primero se preparan 500 ml de la solucin de biotina.
De estos 500 ml, se toman 250ml y se les aade la cantidad correspondiente a 250 ml del resto de las
vitaminas. Despus de la explicacin anterior, se prepararan las soluciones madre de las sales,
vitaminas, aminocidos y hormonas necesarias para los medios DKW y MS. Veamos la composicin
de cada uno de ellos:
Lo ms normal es preparar soluciones que contengan varios componentes, de modo que la
preparacin de la solucin final sea ms rpida y tenga menos margen de error.
Veamos la composicin de cada una de las soluciones madre de ambos medios:
39
Observaciones
Bibliografa
LVAREZ Tinaut, Carmen y Espinosa Borreguero, Francisco. Guiones de prcticas de Biotecnologa Vegetal.
Universidad de Extremadura (Badajoz)
DRIVER, J.A., Kuniyuki, A.H. (1984). In vitro propagation of Paradox walnut rootstock. Hort. Science, 19(4).
MURASHIGE, T. And Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue
cultures. Physiologa Plantarum, 15, 473-497.
REVILLA Bahillo, ngeles y Ords, Ricardo. Guiones de prcticas de Biotecnologa Vegetal. Universidad de
Oviedo
40

FACULTAD DE QUMICA
Practica No. 8 Preparacin de los Agares para cultivar in vitro.
Objetivo
El estudiante tendr conocimiento de la preparacin de los agares para cultivar plantas in vitro a
partir de las soluciones madre (practica 1), para con ello tenga mas claro el concepto de micro
propagacin de plantas para mejora biotecnolgica.
Fundamento terico
El trmino cultivo de tejido vegetal implica una amplia gama de tcnicas de cultivo tanto de
rganos, como de tejidos y clulas e incluso plantas completas, entre las que se encuentra la micro
propagacin; la recuperacin de embriones; la regeneracin de plantas a partir del callo y la
suspensin de clulas, as como el cultivo de protoplasma, anteras y microsporas, que se utilizan
sobre todo para la multiplicacin de plantas en gran escala (Segretin, 2006).
Autoclave Sacarosa
Algodn Agar-Agar
Frascos gerber
Tubos de cultivo
Ligas
Papel aluminio
Matraz de 1000ml
Moscas magneticas
Termoplato
Campana de flujo laminar
Agua destilada
Etanol
Soluciones madre del MS
41
Procedimiento
Para la preparacin de los Agares para medio de cultivo para plantas:
El medio de cultivo es el Murashige & Skoogque que consta de una amplia cantidad de nutrientes los
cuales se muestra en la siguiente tabla:
Para su preparacin en 1000 mL se pesan las cantidades de cada uno de los compuestos o en su
defecto si estos ya se tienen pre-pesados y en un frasco limpio por separado solo se agrega la
cantidad adecuada segn el volumen a preparar.
Agrega el agua destilada al matraz en que se preparara, disolver el medio ya pesado, agitar muy bien
hasta observar cierto grado de solubilizacin. Agregar la sacarosa Ajustar el pH a 5.8 y agregar el
agar-agar (0.8 % agar; 8 g /L y 30 g de sacarosa por litro).
Someter a calentamiento con agitacin sin que llegue a la ebullicin. Proceda a vaciar el medio en
frascos limpios y asegrese de llenarlos con aproximadamente 50 mL, 2/4 del recipiente o segn vea
necesario. Meter a la autoclave para su esterilizacin (250 F, 15 lb, 15 min). Pasado este periodo de
esterilizacin, se sacan de la autoclave y se dejan enfriar y se meten a refrigeracin o bien a una
alacena limpia.
42
Observaciones
Bibliografa
KRIKORIA, A. (1990). Medios de cultivo: generalidades, composicin y preparacin. Universidad
de Nueva York. New York, E.U. 1-19
MROGINSKI, A. (2008). Establecimiento de cultivos vegetales in vitro. Unidad de investigacin de
Biotecnologa. Cali, Colombia. 1-22
43

FACULTAD DE QUMICA
Prctica No. 9 Cultivo in vitro de plantas (semillas)
Objetivo
Que el estudiante se familiarice con la siembra de semillas in vitro, que aprenda las tcnicas para
cultivos de tejidos, rganos vegetales y la obtencin de callos a partir de secciones de zanahoria.
Fundamento terico
La biotecnologa vegetal es el cultivo in vitro de las plantas, en recipientes de vidrio, y supone
mantener las plantas en laboratorio, fuera de su entorno natural, teniendo como sustrato un medio de
cultivo. En la composicin del dicho medio se encuentran elementos minerales, agua, hormonas,
sustancias orgnicas y vitaminas, siendo su porcentaje muy variable segn las especies vegetales y
pudiendo faltar alguno de estos componentes. La biotecnologa actual se centra en la obtencin de
frmaco y vacunas y sobre todo en la obtencin de nuevas especies y variedades con capacidad para
soportar ataque de microorganismos o situaciones de estrs (salino, hdrico, etc.). Es de destacar la
obtencin de nuevos hbridos vegetales, por adicin de ADN forneo, obtenindose los conocidos
organismos transgnicos.
Estuche de diseccin; bistur, pinzas grandes, pinzas pequeas y tijeras.
Frascos gerber con agar para plantas
Tubos con agar para plantas
Vasos de precipitados (7)
Mecheros
Alcohol
Agua estril
Cloro
Probetas
Cajas petri
44
Procedimiento
Procedimiento 1: desinfeccin de semillas
Para nuestra practica con semillas, se dispondrn de diversos tipos de semillas de cereales y frutos
ctricos completos. Las semillas que se extraigan de los frutos ya estn estriles (luego no hay que
desinfectarlas), pero las semillas aisladas s que hay que esterilizarlas (con dos agentes: cloro y
alcohol).
Los pasos a seguir para la desinfeccin son:
1. se deben envolver las semillas en paquetes para poder manipular con las pinzas y una vez hechos
se procede a esterilizarlas.
2. Se sumergen en etanol durante 1 min
3. Se sumergen en solucin de hipoclorito de sodio o cloro al 20% por 15 min.
4. Se enjuagan en tres vasos de precipitados con agua estril, destilada, desionizada durante un par de
minutos por cada vaso (7).
Procedimiento 2: Siembra de semillas (rea estril)
Una vez que se tienen en el 7mo vaso de precipitado de agua estril, las semillas ya estn listas para
su siembra en tubos de ensayo o en frascos gerber, que tiene medio de cultivo para plantas adecuado.
Para sembrar las semillas en los medios de cultivo se enciende el mechero, se lavan las manos hasta
el medio brazo y despus se remojan en etanol al 10% hasta que se seque inician la manipulacin o
bien utilizar guantes estriles. Despus de eso toman el paquete de material estril y las cajas de petri
de vidrio, que nos servir como mesa de trabajo. Con la ayuda de unas pinzas, se pone el paquete de
semillas sobre una caja de precipitados y se abre, con las pinzas se toman las semillas para
depositarlas en el medio de cultivo.
En el caso de los frutos de ctricos completos se procede a esterilizar el fruto entero pulverizando con
alcohol y luego la flamea. En la campana de flujo laminar se abren los frutos (limn, naranja o
mandarina) y se extraen las semillas con unas pinzas. Tras hacer una pequea incisin en la cubierta
se siembran en tubos o frascos gerber con el medio de cultivo adecuado.
Observaciones
Bibliografa
Serrano G.M, Biotecnologa vegetal, Madrid D.L
Pierik, R.L.M. Cultivo in vitro de plantas superiores, Madrid M.P
45

FACULTAD DE QUMICA
Practica No. 10 Cultivo in vitro de plantas (rganos vegetales)
Objetivo
El alumno aprender a realizar el montaje de un cultivo de tejidos vegetales a partir de explantes
nodales.
Fundamento terico
El trmino genrico cultivo de tejidos vegetales involucra a diferentes tcnicas de cultivo de
material vegetal diverso, incluyendo a los protoplastos (clulas desprovistas de su pared celular),
clulas, tejidos, rganos y plantas completas. Mediante stas y otras tcnicas de cultivo, es posible
obtener plantas libres de microbios en un medio nutritivo asptico (estril) en condiciones
ambientales controladas. Tambin se lo conoce como cultivo in vitro de plantas por realizarse en
recipientes de vidrio (hoy tambin de otros materiales). Las primeras experiencias relacionadas con
el cultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902, pero recin en 1922 se logr el primer
experimento exitoso: la germinacin in vitro de semillas de orqudeas. Luego de la germinacin, las
plntulas obtenidas se transfirieron a un medio de cultivo en condiciones aspticas, y as se
mantuvieron protegidas del ataque de patgenos (hongos, virus y bacterias).
Microscopio de diseccin
Microscopio compuesto
Muestra de hongo desarrollado en la caja petri
Asa de platino Formol
Porta y cubre objetos Cutex
Azul o rojo colorantes
Fibra de vidrio
Etiquetas adheribles
46
Procedimiento
Para la obtencin de explantos nodales, se deben de lavar los tallos seleccionados con abundante
agua. Secar cuidadosamente con papel filtro. A continuacin se pasa a eliminar las hojas de los tallos,
cuidado dejar 2 cm del peciolo unido al tallo. Igualmente deben eliminarse las espinas (si las
hubiera). Acto seguido se separa los entrenudos (que deben contener al menos una yema axilar) con
ayuda de unas tijeras. Debemos conseguir porciones de tallo de unos 4-5 cm aproximadamente.
Para la estilizacin de los explantos nodales, se envuelven en una gasa y se introduce en un bote que
contenga 100 ml de la disolucin desinfectante (hipoclorito de sodio o cloro al 20%) durante 10 min
(agitar espordicamente). Despus se lava 3 veces en vasos de precipitado con agua estril,
ayudndose de unas pinzas largas. Una vez desinfectado el material vegetal se procede a la siembra
en los frascos gerber o en tubos de ensaye con medio de cultivo.
Para la siembra de los explantos nodales se enciende el mechero (todo en esterilidad) y se abre el
paquete del material estril y las cajas petri que nos servir como mesa de trabajo. Con ayuda de
unas pinzas, se pone el paquete de explantos nodales sobre la caja petri, se abre y se toman con las
pinzas, para depositarlas en el medio de cultivo.
La introduccin del material vegetal en los frasco gerber debe ser muy cerca de la llama y usando
pinzas estriles.
Observaciones
Bibliografa
Pierik, R.L.M. Cultivo in vitro de plantas superiores, Madrid M.P
Mroginski, A. (2008). Establecimiento de cultivos vegetales in vitro. Unidad de investigacin de
Biotecnologa. Cali, Colombia. 1-22
Agrios G.N. 1998. Fitopatologa, 3era Edicin, Mxico, 838 pp.
47
FACULTAD DE QUMICA, UAEM

Prctica No. 11 Obtencin del colorante natural Betalaina a partir de cultivos vegetales de Beta
vulgaris (betabel)
Introduccin
Las Betalanas (BL) son pigmentos vacuolares hidrosolubles presentes en las plantas del orden de las
Centrospermas, como el Betabel (Beta Vulgaris). Estn compuestos por las Betacianinas (BC) de
color rojo y las Betaxantina de color amarillo, ambas con diversos epmeros, son pigmentos
hidrosolubles con buenas caractersticas organolpticas para ser utilizados en productos lcteos,
bebidas, confitera cosmticos y farmacuticos, ya que imparten coloraciones que van del rojo al
amarillo. Adems su uso est aprobado por la FDA desde 1960 y en Mxico la secretaria de salud
permite su aplicacin en alimentos y cosmticos.
Objetivo
Obtener colorantes naturales (betalainas) por medio del cultivo in vitro de Beta vulgaris, como una
tcnica biotecnolgica para la produccin de pigmentos de uso industrial.
Fundamento terico
El uso del color es una necesidad esttica de la humanidad y est inmersa en la historia de su
desarrollo cultural. Los colorantes estn presentes en casi todas las plantas. De stos, unos son
producidos directamente por la actividad fisiolgica de las plantas, mientras que otros son producto
de transformaciones artificiales de sustancias de procedencia vegetal. Los que se encuentran ya
formados en la naturaleza, suelen estar disueltos o formando depsitos granulares en las clulas
superficiales de las plantas.
Los colorantes vegetales se hayan concentrados en las vacuolas celulares de un sin nmero de
plantas, en donde a su vez sin encontrarse en estado puro, se asocian con otros principios como
aceites, resinas, y en particular con los taninos que son de carcter astringente.
Los colorantes naturales los podemos definir como aquellos que se obtienen de la materia animal y
vegetal sin proceso qumico. Estos son principalmente colorantes mordientes, aunque se conocen
unos de la tina de disolventes, de pigmentos, directos y de los tipos cidos. No se conocen colorantes
naturales del tipo sulfurado, disperso, azoico o en rama.
A partir de la Beta vulgaris (betabel) se extrae la betalaina, pigmento natural presente en esta raz
que le confiere su color rojo caracterstico y que se emplea en la industria agroalimentaria, cosmtica
y farmacutica, para la obtencin de un colorante denominado rojo de remolacha.
Ante las restricciones impuestas por los organismos internacionales para regular el uso de colorantes
de tipo sinttico, renace la necesidad de usar colorantes de origen natural. En este contexto, el cultivo
de clulas y tejidos vegetales es una excelente alternativa que puede ayudar en el conocimiento y
desarrollo de nuevas variedades de plantas productoras de colorantes o de nuevos sistemas de
produccin, como lo es el cultivo masivo de clulas u rganos vegetales.
48
El trmino CTV se refiere al cultivo in vitro de cualquier estructura viva de una planta, sean estas,
clulas, un tejido o un rgano, bajo condiciones aspticas. El principio de CTV es simple: Primero,
es necesario aislar una parte de la planta a la que se le denomina explate, este explante posee una
potencialidad de diferenciacin capaz de regenerar no solamente tejidos y rganos, sino tambin un
individuo completo; segundo, se provee de un medio ambiente apropiado (medio de cultivo
adecuado a condiciones fsicas propias de cada especie, en el cual pueda expresar su potencial
intrnseco o inducido) y tercero, el trabajo es realizado en condiciones aspticas, es decir, el medio
de cultivo est libre de microorganismos contaminantes. Los primeros pasos de la metodologa para
la obtencin de un metabolito por cultivo de tejidos, son similares a la micro propagacin. Se utilizan
plantas en principio seleccionadas para una elevada produccin del metabolito en cuestin. Por
consiguiente, se utilizan rganos o tejidos en los que se localiza la produccin del metabolito, o en
los que se encuentra su mxima concentracin.
Se establece el cultivo en condiciones aspticas, encontrando los medios y las condiciones ms
adecuadas. Despus de la induccin del callo sobre el explante, se establece un cultivo de clulas en
suspensin. En la mayora de los casos, las sustancias de inters se almacenan en estructuras al
interior de las clulas, lo que plantea la necesidad de desarrollar procesos en dos etapas, una para el
crecimiento y la proliferacin de las clulas vegetales, y otra para la produccin del compuesto de
inters y para, posteriormente, durante la fase de recuperacin del mismo, lisar las clulas que
contengan el metabolito.
Son necesarias las condiciones de seguridad mnimas para el trabajo en el laboratorio, equipo de
proteccin de uso personal, as como el orden y la compostura adecuada dentro del laboratorio.
La prctica de realizar en tres sesiones
Primer sesin: preparacin del medio de cultivo MS
49
Matraz erlenmeyer de 2L
Probeta de 100mL
Pietas de 5 y 10 mL
Tubos de cultivo
Frascos de gerber
Agitadores magnticos
Parrillas elctricas
Matraz aforado de 100 mL
Autoclave
Algodn
Segunda sesin: establecimiento de cultivos
Semillas de betabel
Probeta de 1L
Agua destilada estril
Etanol
Mechero de alcohol
Bisturis
Cajas petri estriles
Pinzas de diseccin de 30 cm
Sesin 3: Establecimiento de cultivos en
Matraz erlenmeyer de 250 mL
Agitador
Espectrofotmetro y celdas
Mecheros de alcohol
Bisturs
Cajas petri estriles desechables
Pinzas de diseccin de 30 cm
Papel aluminio
Ligas
Solucin Stock*
Sacarosa
Phytagel
NaOH 1.0 N
HCI 1.0 N
Solucin amortiguadora pH 4.0
Solucin amortiguadora pH 7.0
Agua destilada
de callo
Vasos de precipitado de 0.5 y 1 L
Cmara de incubacin
Cerillos
Algodn
Solucin de NaCl al 10%
Solucin Jabonosa
Tween 20
suspensin.
Papel aluminio
Ligas
Cerillos
Algodn
Agua destilada
Etanol
50
Procedimiento
Preparacin
de
solucin
Stock
macronutrientes y micronutrientes.
de
Composicin y preparacin
Murashige y Skoog
(medio MS)
de
Tabla 1.
medio
51
a base de los cotiledones y el segundo arriba donde comienza la raz, de forma que obtenemos tres diferentes explantes, cotiledones, races e hipocotilos
52
Los hipocotilos obtenidos sern transferidos a frascos con medio de cultivo fresco e incubados en las mismas condiciones qu
de cultivo, en condiciones aspticas y con ayuda de unas pinzas estriles sacar las plntulas del frasco y depositarlas en una caja petri estril.
Se colocan los frascos en incubacin a 25 C, con un fotoperiodo de 16 h de luz por 8 h de oscuridad.
Sesin 2: Establecimiento de cultivos de callo
l finalizar la esterilizacin, dejar enfriar para que el medio adquiera una textura gelatinosa.
Almacenar a 4C.
Verter el contenido en los recipientes de cultivo y esterilizarlo.

laspH
semillas
a los
frascos conentre
medio
cultivo preparados en la primera sesin (5 semillas), tapar co
ver la solucin preparada al matraz, agitarTransfiera
y ajustar el
para que
se encuentre
5.7de
5.8.
iles transfiera las semillas a una caja petri estril, con ayuda de un bistur, tambin estril separe las semillas.
Aadir 2 g de phytagel, agitar y calentar la solucin hasta que el phytagel quede disuelto.
Verter el contenido d un matraz aforado de 1 L y aforar.

Lavar las semillas de betabel con mucho cuidado, colocando las semillas en sol. jabonosa, agitando durante un min
Adicionar 30 g de sacarosa y agitar hasta que se disuelva completamente.
las semillas en la solucin de cloro durante 10 min, decantar y lavar con H2O destilada (3 veces).
Agregar 10 mL de solucin stock de micronutrientes (MS x100).
Aadir 5 mL de soluciones de hierro (MS x 200) y agitar.
un matraz
Anadir 100 mL de la solucin stock de macronutrientes (MS A
x10)
y agitar.erlenmeyer de 2 L adicionar 500 mL de H2O destilada.
Sesin 1: Preparacin del medio de cultivo

Vitaminas
(MS x200)
Micronutrientes
(MS x100)
Macronutrientes
(MS x10)
53
Cuestionario
o hasta el final del experimento la biomasa, tomando alcuotas del medio y determinando su absorbancia a 450 nm.
Graficar y determinar por regresin lineal la produccin de betalainas.
tivos celulares se incuban en condiciones de oscuridadEn

con
cada
agitacin
matrazde
se 100
inoculan
rpm (26.0
aprox. 500
1.0 C)
a 750 mg de callo para asegurar la iniciacin del cultivo.
condiciones de asepsia transferir el callo formado por Con

los cultivos
de hipocotilo
a cajas petri.
ayuda del
bistur se fragmenta
el callo y nicamente se utiliza como inoculo el callo joven.
Preparar 1 L de medio liquido MS (igual que en la 1er sesin, excepto por la adicin de phytagel).
na vez aforado, vaciar 50 mL de medio en cada uno de los matraces erlenmeyer a utilizar.
Sesin 3. Establecimiento de cultivos en suspensin
Definir callo, morfognesis y friabilidad

Qu caractersticas son deseables en un callo para la activacin de un cultivo de clulas en
suspensin?
el crecimiento de una suspensin de clulas vegetales puede caracterizarse al igual que los cultivos
bacterianos?
Qu combinacin y proporcin de auxinas y citocinas utilizara para promover la callognesis en un
cultivo determinado?
En los cultivos de semillas in vitro, es necesaria la presencia de azcares en la formulacin del
medio de cultivo?
Observaciones
54
Bibliografa
DELGADO F. Jimnez A y Paredes O. 2000. Natural pigment: carotenoids, anthocyanins and
betalanas. Characteristics, biosntesis, processing and estability. Crit. Rev. Food Sci. And Nut 40:
(3): 173-289.
ABDELNOUR, E. A. y Vincent, E. J., 1994. Conceptos bsicos de cultivo de tejidos Vegetales, catie,
Turrialba, costa rica pp. 38
HURTADO, M.D. y Merino, M.M., 1987. Cultivo de tejidos vegetalales. Trillas. Mxico pp. 232
55

FACULTAD DE QUMICA
Prctica No. 12 Bioinformtica y biotecnologa
Introduccin
La biotecnologa logr que una cantidad considerable de industrias dejaran de existir tal como las
conocamos. Es el caso de la farmacutica, que tiene una rama biofarmacutica que abarca la
elaboracin de tratamientos para diversas afecciones basadas en anticuerpos monoclonales y aspira a
disear, en un futuro, drogas a medida. Tambin est la industria biotecnolgica per s y la de los
alimentos, hoy modificados para resolver los problemas de la cantidad producida y la adicin de
propiedades.
La Bioinformtica, una especialidad que a nivel mundial tiene apenas 15 aos, es una disciplina muy
innovadora que trata de utilizar el potencial del clculo y las herramientas de computacin para
resolver problemas muy complejos de la biologa, como por ejemplo, secuenciar genomas.
Objetivo
Introducir las bases de datos accesibles a travs de Internet de importancia en el rea biolgica.
Comprender la utilidad de las mismas como herramientas de acceso a informacin y programas de
cmputo actualizados.
Fundamento terico
En las ltimas dcadas, cientficos alrededor del mundo se han dedicado a obtener las secuencias
tanto protenas como de cidos nucleicos. Aunque en sus inicios estos esfuerzos fueron aislados,
poco a poco la cantidad de datos generada se hizo excesiva para ser manejada por laboratorios
aislados. Adems, con el advenimiento de nuevas tecnologas de secuenciacin, se generaron
proyectos conjuntos entre laboratorios cuyo objetivo nico era la secuenciacin de un genoma en
particular. Se hizo entonces necesaria la organizacin de bancos de datos donde las secuencias
generadas pudieran ser depositadas. Desde el inicio, la comunidad cientfica estuvo de acuerdo en
que estos bancos de datos deberan tener acceso libre a nivel mundial.
Mucho antes de que el genoma humano se completara en el ao 2003,
(http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml), existan ya decenas de este
tipo de bancos de datos. Actualmente, existen bancos de datos definidos, sumamente extensos de los
cuales se derivan secciones donde se puede tener acceso a informacin ms especfica.
56
Materiales
Sala de Acceso a internet
Acceso a las bases de datos genticos
Procedimiento
Se visitarn diferentes sitios en Internet y su instructor le indicar las principales caractersticas de
los mismos. Dependiendo del tiempo y el acceso a Internet, se revisarn los siguientes sitios:
Direccin de la pgina web
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?
DB=pubmed
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/
http://www.genome.jp/kegg/
http://www.ebi.ac.uk/embl/
http://www.webact.org/WebACT/home
http://www.sanger.ac.uk/Software/ACT/
Descripcin
Base de datos general, no solo de
secuencias de macromolculas
sino tambin acceso a libros y
revistas en el rea de ciencias de
la salud.
Adems, acceso a programas de
cmputo para anlisis
de
secuencias de protenas, genes o
genomas.
Programa de cmputo que
encuentra secuencias similares en
protenas y cidos nucleicos
Base de datos de Japn
Base de datos Europeo
Banco de datos de comparacin
de genomas de procariotas, que
permite la visualizacin on line
de hasta cinco genomas de forma
simultnea,
utilizando el
herramienta de comparacin
Artemis, desarrollada por el
Instituto Sanger.
Herramienta de comparacin de
ADN Artemis
Cuestionario
Cul son los objetivos de las bases de datos?
En funcin de tu formacin profesional Cul es la utilidad que encuentras al consultar las bases de
datos sugeridas?
Qu importancia tienen el conocimiento de las bases de datos mundiales en tu carrera?
Conoces bases de datos nacionales Cules?
Observaciones
57
Bibliografa
Switzer, R. y L. Garrity. Experimental Biochemistry: Theory and exercises in fundamental methods.
3rd edition, Freeman and Company, New York 1999 Romero
FACULTAD DE QUMICA
Prctica No. 13. Extraccin de ADN, PCR y tcnicas electroforticas (Laboratorio virtual
WEB)
Introduccin
Desde la dcada de 1950 y 1960, los bilogos moleculares han aprendido a caracterizar, aislar y
manipular los componentes moleculares de las clulas y organismos. Estos componentes incluyen el
ADN, el repositorio de informacin gentica; ARN, un pariente cercano de ADN cuyas funciones
abarcan desde que acta como una copia de trabajo temporal de ADN a reales funciones estructurales
y enzimticas, as como una parte funcional y estructural del aparato traslacin; y protenas, el tipo
de molcula en las clulas estructural y enzimtica principal.
La reaccin en cadena de polimerasa es una tcnica muy verstil para la copia de ADN. En breve,
PCR permite una sola secuencia de ADN que se copien (millones de veces) o alterado de manera
predeterminada.
Electroforesis en gel es una de las principales herramientas de la biologa molecular. El principio
bsico es ADN, ARN, y protenas pueden ser separadas por medio de un campo elctrico. Gel de
electroforesis en agarosa, ADN y ARN pueden separarse de tamao ejecutando el ADN a travs de
un gel de agarosa.
Objetivo
Que el alumno obtenga conocimiento sobre los mtodos actuales de extraccin y anlisis de ADN
utilizando laboratorios virtuales encontrados en internet.
Fundamento terico
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en ingls) fue descrita por primera vez
en 1985 por Kary B. Mullis. Esta invencin lo hizo acreedor en 1993 del Premio Nobel en Qumica,
debido al gran impacto que ha tenido esta tcnica en el rea de la bioqumica. Su objetivo y funcin
es la de obtener mediante amplificacin in vitro cantidades masivas de ADN incluso a partir de
muestras de ADN muy pequeas.
Para realizar el PCR ms sencillo, se requiere conocer las secuencias que rodean la regin a
58
amplificar, luego se producen oligonucletidos complementarios a estas secuencias mediante sntesis

qumica automatizada y estos son utilizados como cebadores (primers) en una reaccin de
polimerizacin cclica catalizada por la ADN polimerasa.
La electroforesis es el movimiento de partculas cargadas en un campo elctrico. A diferencia de las
protenas, las cuales pueden tener una carga positiva o negativa, los cidos nucleicos estn cargados
de forma negativa debido a su esqueleto de grupos fosfato. Por lo tanto, en una electroforesis, los
cidos nucleicos migrarn hacia el polo positivo, es decir, el nodo. La concentracin de agarosa
tpicamente utilizada para electroforesis est entre el 0.5 % y el 2%. La concentracin a usar se
escoge segn el tamao del cido nucleico a analizar. Esto porque la concentracin de agarosa define
el tamao de los poros de la matriz, a mayor concentracin, menor el tamao de los poros y
viceversa. Durante la electroforesis, los cidos nucleicos lineales con un alto peso molecular
migrarn al nodo ms lentamente que cidos nucleicos lineales con un menor peso molecular. La
razn de esto es que los cidos nucleicos de alto peso tardan ms tiempo en atravesar los poros de
agarosa. En el caso de cidos nucleicos no linealizados, como plsmidos circulares en conformacin
nativa, la migracin no solo depender del peso molecular sino tambin de otros aspectos como el
grado de super-enrollamiento que ste posea. Generalmente en una preparacin de plsmido se
pueden observar distintas conformaciones de la misma molcula, la forma super-enrollada, la forma
semi relajada y una relajada. Dependiendo de las condiciones externas como pH y salinidad se
pueden observar todas las formas o solo una (s).
Materiales
Procedimiento
Realizar una detallada discusin sobre las tcnica revisadas que incluya:
Realizar diagramas de procedimiento tcnico.
Equipos utilizados
Tipos y utilidad de los reactivos
Fundamento de las tcnicas
Aplicacin sobre la biotecnologa farmacutica.
Consultar los laboratorios virtuales de la pgina http://learn.genetics.utah.edu/
Cuestionario
A que se le denomina tcnicas de biologa molecular.
Elabora una lista de herramientas de biologa molecular utilizadas en la actualidad.
Menciona alguna aplicacin de las tcnicas revisadas de biologa molecular para el desarrollo de
productos farmacuticos?
59
Observaciones
60
Bibliografa
FACULTAD DE QUMICA
Prctica No. 14 Transformacin bacteriana (Laboratorio virtual WEB)
Introduccin
La transformacin gentica de bacterias es un procedimiento por el cual se introduce material
gentico a una bacteria. Existen otros procesos de insercin del material gentico, que dependiendo
del organismo receptor y el mecanismo, algunos reciben nombres como transfeccin o transduccin.
Generalmente, el material gentico insertado es conocido como plsmido (DNA circular), pero
pueden insertarse otras formas de material gentico, como DNA o RNA. Los plsmidos utilizados
para la transformacin de bacterias contienen en general, uno o varios genes de inters, un gen
reportero (que permite visualizar la transcripcin del plsmido), y un gen de resistencia a un
antibitico, que permite seleccionar a la bacteria transformada de otras, por su capacidad de crecer en
medio que contiene el antibitico de resistencia.
Objetivo
Que el alumno obtenga conocimiento sobre los mtodos de transformacin bacteriana utilizados en
la actualidad y descritos en laboratorios virtuales encontrados en internet.
Fundamento terico
Aunque las bacterias se reproducen por un proceso asexual (fisin binaria), poseen mecanismos para
lograr la variabilidad gentica que necesitan para adaptarse a un entorno cambiante. En general
existen dos formas de cambiar la dotacin gentica de una bacteria, las mutaciones y la transferencia
de fragmentos de ADN de unas bacterias a otras con posterior recombinacin de los fragmentos
adquiridos en el cromosoma o en los plsmidos de las bacterias receptora.
Uno de los procesos naturales de transferencia de material gentico de una bacteria a otra, junto con
la conjugacin y la transduccin, que es una integracin directa del ADN. Experimentalmente
consiste en hacer penetrar un fragmento de ADN en una bacteria para provocar en ella una
recombinacin gentica. Por extensin (abusiva) se habla a veces de transformacin para designar un
proceso idntico que afecta a las clulas eucariticas (levaduras, clulas animales y vegetales).
Las transformacin tienen muchas aplicaciones, como la produccin de protenas, la produccin de
los mismos plsmidos, entre otros.
61
Conocemos dos formas de recombinacin: la recombinacin homloga y la transposicin. En la

recombinacin homloga el fragmento de ADN aceptado es muy similar a una parte del genoma del
a bacteria y, tras situarse al lado, se intercambian con l por un mecanismo de rotura,
entrecruzamiento y reunin de sus cadenas de ADN (figura 5). La transferencia previa a este tipo de
recombinacin puede ocurrir mediante tres vas: la penetracin de ADN desnudo directamente a
travs de la pared de la clula receptora (transformacin), mediante un bacterifago que infecta
diferentes poblaciones bacterianas (transduccin), o por transferencia de plsmidos y en su caso
de genes cromosmicos arrastrados por plsmidos desde las bacterias donadoras a las receptoras
(conjugacin) (figura 5).
Figura 5. Mecanismos de recombinacin gentica.
Materiales
62
Procedimiento
Realizar diagramas de procedimiento tcnico.

Consultar los laboratorio virtual de la pgina:
Realizar una detallada discusin sobre las tcnica revisadas que incluya:
Equipos utilizados
Tipos y utilidad de los reactivos
Fundamento de las tcnicas
Aplicacin sobre la biotecnologa farmacutica.
Cuestionario
Describe los principales mecanismos naturales de variabilidad gentica de las bacterias.
Describe los mecanismos in vitro para inducir variabilidad gentica de las bacterias
Menciona al menos dos aplicaciones en la industria farmacutica de la variabilidad gentica inducida
en bacterias.
Observaciones
Bibliografa
63
64

FACULTAD DE QUMICA
Prctica No. 15. Obtencin de penicilina y comprobacin de su accin antibitica
Introduccin
Los antibiticos son por definicin molculas con actividad antimicrobiana, que incluyen una gran
cantidad de compuestos pertenecientes a diferentes familias qumicas. Son metabolitos secundarios,
producidos en la mayora de los casos despus de la fase de crecimiento. Los primeros procesos para
la produccin de penicilina, que fue el primer antibitico conocido, implicaban el crecimiento de
Penicillium notatum sobre la superficie de un medio lquido (Czapek-Dox-glucosa). El perodo de
incubacin era usualmente de 6-12 das y posteriormente la penicilina se extraa con solventes previa
separacin del micelio.
Objetivo
Obtencin de penicilina por inoculacin de esporas de Penicillium chrysogenum previamente
sembradas en agar sabouraud en medio de cultivo liquido que contiene los nutrientes apropiados
para la generacin y crecimiento de la biomasa.
Fundamento terico
En la Figura 4 se muestra un esquema de la biosntesis de penicilina. Las distintas penicilinas son
producidas a partir de P. chrysogeizuin por adicin de una apropiada cadena carboxlica en cantidad
adecuada en el medio de cultivo, pero solamente tienen valor teraputico la penicilina G y la V.
Ambas tienen un espectro y actividad similar, pero la penicilina V es ms estable a pH cido, lo que
permite su administracin por va oral.
La produccin de penicilina como otros procesos biotecnolgicos est dominada por su aspecto
competitivo entre los grandes laboratorios productores, que realizan permanentes esfuerzos de
mejoramiento en cada rea del proceso: cepa, fermentacin y separacin. El proceso a grandes
rasgos implica el cultivo de P. chrysogenum en reactores de volumen creciente hasta una escala de
500.000 L, separacin del micelio por filtracin y extraccin del antibitico del caldo, seguida por la
cristalizacin o precipitacin cida del mismo.
Penicilina: fabricacin industrial
La fabricacin de penicilina es un ejemplo del proceso tpico de obtencin de antibiticos. El hongo
utilizado industrialmente pertenece al grupo del Penicillum chrysogenum y es particularmente activo
sobre el estafilococo, estreptococo y neumococo, as como sobre la mayor parte de los
microorganismos Gram positivos, presentando escasa accin sobre los Gram negativos.
65
Las 4 fases principales para la fabricacin de penicilina son:

Fermentacin
Separacin del micelio del caldo fermentado y extraccin de la penicilina por medio de disolventes
Purificacin con disolventes y formacin de la sal sdica de la penicilina
Ensayos de control y almacenamiento.
Figura 4. Ruta sinttica de la penicilina

Preparacin:
El caldo de cultivo para la fermentacin se obtiene por infusin acuosa de maz, aadiendo de un 2 a
un 3% de lactosa, y tambin se adicionan compuestos inorgnicos conteniendo hidrgeno, oxgeno,
fsforo, azufre, potasio, magnesio, nitrgeno y trazas de hierro, cobre y zinc. La adicin de ciertos
compuestos que favorecen el crecimiento del hongo debe evitarse, ya que podran ser tolerados al
administrar el producto, ni su eliminacin sera econmica. Despus de buscar el pH a 4.5-5.0, el
medio de cultivo se pasa al fermentador, que est equipado con un agitador vertical, con un sistema
de introduccin de aire esterilizado por filtracin y con serpentines para mantener la temperatura
deseada. El hongo se introduce por medio de conducciones estriles y con ayuda de airea presin.
Durante el crecimiento el medio se esteriliza con vapor a presin, y la temperatura se mantiene entre
23 y 25C.
El aire estril permite el crecimiento del hongo aerobio, y la agitacin facilita su uniforme
distribucin en el seno del lquido. Se requiere un volumen de aire por minuto y por volumen de
medio de cultivo. El proceso se controla a intervalos que oscilan entre 3 y 6 horas; al cabo de unas 50
a 90 horas el crecimiento se va haciendo ms lento, lo que indica que el hongo se ha desarrollado
por completo. La masa se enfra a 5C a causa de la inestabilidad de la penicilina a la temperatura
ambiente, y se separa el micelio en un filtro de tambor rotatorio. Debido a su baja toxicidad pueden
ser utilizadas grandes dosis de penicilina; solamente un pequeo porcentaje de personas desarrollan
alergia.
66
Microorganismo
Cultivo en agar inclinado de Penicillium chrysogenum (DSM 1.075) realizado en agar Sabouraudglucosa: glucosa: 40.0g, peptona: 10.0g, agar: 15.0g, agua corriente: 1L (pH 5.6)
Son necesarias las condiciones de seguridad mnimas para el trabajo en el laboratorio, equipo de
proteccin de uso personal, as como el orden y la compostura adecuada dentro del laboratorio.
1 jeringa desechable de 5 ml
Agua estril para inyeccin
Algodn
Gasa
Esptula
Pipetas estriles
Asa de siembra
Tubos de ensayo estriles
Papel indicador pH (1-7)
Embudo de vidrio con filtro redondo
Mechero Bunsen
Erlenmeyer de 500 ml
Papel filtro
Cajas petri inoculadas con Bacillus subitlis, Escherichia coli o Pseudomonas fluorescens
Glucosa 2,0g
Peptona 10,0g
Extracto de levadura 1,0g
Agar 12,0g
Agua desmineralizada pH 7
NaCl (0.9 %, estril)
67
68
o de cultivo (lactosa: 30.0 g, glucosa: 10.0g, extracto de levadura: 40.0g, nitrato sdico: 3.0 g, dihidrogenofosfato sdico: 0.5g, fenilacetato sdico: 0.3
Ajustar a pH entre 5.5 y 6, tapar con algodn y esterilizar en autoclave.
Preparacin del medio de cultivo

Repicar
Penicillium
Chrysogenum
en un
tubo decrecer
ensayo
que contenga
m Chrysogenum en un tubo de ensayo que
contenga
agar sabouraud
inclinado
y dejarlo
durante
8 das. agar sabouraud inclinado y dejarlo crecer
Preparacin del inoculo

Procedimiento
69
Pasado el tiempo, comprobar la actividad de la penicilina por la aparicin de halos de inhibicin alrededor de los d
una caja de petri, la cual previamente ha sido sembrada con un microorganismo sensible a la penicilina
tlis, Escherichia coli o Pseudomonas fluorescens).
Incubar a 28 C por 24 horas.

Impregnarlos con el filtrado del medio
Cortar con perforadora pequeos crculos de papel de filtro.
Evaluacin de la actividad antimicrobiana

Filtrar y recoger los cristales obtenidos.
Aadir un poco de solucin de ter disuelto en trietilamina
Concentrar a vaco hasta reducir a 1/4 el filtrado
Aadir un volumen igual de ter enfriado en un bao de hielo

Adicionar sulfato sdico anhidro en exceso (solo con la punta de la esptula)
Tomar el filtrado y ajustar el pH a 2.0 con cido fosfrico.

Filtrar el caldo de cultivo
Cristalizacin de la penicilina
Lleve el medio al agitador orbital controle el pH cada 2 3 das mantenindolo a pH 5, durante 10 a 15 d
e 5 ml, agua estril para inyeccin, aspersor con alcohol, gasa y mechero; encender el motor de la cabina y la lmpara germicida y dejar durante 20 minu
Realice el mismo procedimiento con 5 ml ms y tape con el algodn.
Agite un poco con cuidado de no regar nada y luego adicionar en el erlenmeyer donde se encuentra el m
Coloque 5ml de agua inyectable con la jeringa y descrguelos sobre el tubo donde se encuentra el inoc
Inoculacin del medio de cultivo
Cuestionario
En la industria farmacutica es necesario el mantenimiento de las cepas de Penicillium, Cmo es
este procedimiento?
Cul es el significado de las unidades de medida de la penicilina?
Menciona los mtodos por los cuales la industria farmacutica puede incrementar la produccin de
penicilina.
Adems de glucosa y lactosa las cepas de Penicillium utilizan una gran variedad de fuentes de
carbono y energa, en base a tu revisin bibliogrfica menciona algunas de gran importancia.
Observaciones
Bibliografa
COOMBS, J. Diccionario de biotecnologa. Editorial Labor, S.A. 1 edicin 1989. Espaa.
CRUEGUER, Anneliese. Manual de Microbiologa Industrial. Editorial Acribia S.A. Zaragoza
Espaa.
70
3 edicin. 1989.
JAGNOW, Gerhard. Biotecnologa Introduccin con experimentos modelo. Editorial Acribia S.A.
Programacin semestral Agosto 2013 Enero 2014
Prctica
Fecha
Observaciones
71

Manual de Laboratorio de Biotecnología Farmacéutica 2014

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