BIOLOGA DE ANIMALES III

Semestre 2015-2
8-04-15

FECUNDACION IN VITRO
Karla Paola Garca Cruz; Carlos Andrs Gil Gmez; Sandibel Martnez.

Introduccin
Introduccin
El proceso de fertilizacin es, en trminos generales, el contacto entre el vulo (celula
reproductora o gameto con informacin gentica proveniente del progenitor femenino) y el
espermatozoide (gameto con informacin gentica de origen masculino). Al encontrarse estas dos
clulas haploides, pasan por procesos de reconocimiento especficos para cada especie (Gao et
al, 1986) y empiezan un proceso de fusin con el que integran la informacin de ambas partes, se
reactiva el metabolismo de sntesis de proteinas y se lleva a cabo la proliferacin celular.
Al momento de su descubrimiento, se pensaba que los espermatozoides eran animales
parasticos que vivan en el semen, fue hasta bastante tiempo despus que se determin que
cumplen un papel importante en los procesos reproductivos de las especies, un investigador
llamado Hertwig buscaba un organismo apropiado para realizar observaciones y de esta forma
lleg al erizo de mar Toxopneustes lividus, que tena la gran ventaja de ser altamente comn en la
zona en la que trabajaba y tener gametos transparentes que facilitaban su observacin (Gilbert,
Por la propia naturaleza del proceso, el proceso de fertilizacin es exclusivo de especies con una
diferenciacin sexual y con la capacidad de formar gametos haploides, el proceso ofrece ventajas
como la recombinacin gentica que proporciona una mayor variacin intraespecfica aunque
tambin tiene desventajas como un gasto adicional de energa en los procesos de encontrar
pareja, partiendo de estos principios, algunos autores han sugerido que la reproduccin sexual es
una caracterstica excepcional debido a que favorece la sobrevivencia de grupo y no la individual,
para la cual puede llegar a ser una desventaja (Fisher en Smith, 1968).
Los principales objetivos de la reproduccin sexual son el reproductivo (la generacin de un
nuevo individuo) y esta variacin gentica producto de la recombinacin, se tiene todo un proceso
de reconocimiento e intercambio qumico entre los gametos.
La fertilizacin externa se refiere al proceso a travs del cual los individuos de una especie liberan
sus gametos al medio, los cuales suelen ser medios acuticos, para que se encuentren fuera de
los organismos y empiecen el desarrollo de las cras dentro de este medio, suele asociarse este
mtodo de reproduccin con una mayor produccin de gametos, lo cual incrementa la
probabilidad de que se encuentren los gametos en toda la extensin del volmen del medio.
La fertilizacin externa es considerado como un carcter plesiomrfico en grupos con especies
con ambos tipos de fertilizacin, sin embargo, a travs de estudios de caractersticas asociadas a

reproduccin interna, como es el caso de aletas asociadas a la fijacin de las parejas, se ha

observado que existen grupos que han pasado de fertilizacin externa a interna para volver a
realizar un cambio similar en sentido inverso (Long, 2015).
La regulacin de los procesos de gametognesis en organismos de fertilizacin externa han sido
considerados como resultado de una respuesta a componentes climticos como es el clima y
ciclos anuales, por lo mismo, se reconoce una estacionalidad de la poca reproductiva para estas
especies. Algunas de las caractersticas que ayudan a reconocer estos periodos son un
incremento en el tamao de las gnadas, en conjunto con la liberacin de gametos al medio
(Bronstein, 2014).
Para el caso especfico de nuestro estudio, la almeja chocolata (Megapitaria squalida) es el
bivalvo ms abundante en el noroeste de Mxico y es posible encontrarla desde Baja California
Sur hasta Per. Anlisis cuantitativos de la proporcin de individuos han determinado que la
poblacin se compone de una cantidad ms o menos igual de individuos masculinos que
femeninos, sin embargo, para lograr la identificacin de los sexos de los individuos se suele
requerir el anlisis de los tejidos de las gnadas.
Dada su amplia distribucin, las condiciones climticas a las que se tienen que adaptar son
ampliamente variables, lo que lleva a que el anlisis para zonas especficas es necesario si se
desean determinar apropiadamente la poca de reproduccin y de gametognesis.
Bibliografa
Arellano-Martnez, M., Quiones-Arreola, M. F. Ceballos-Vzquez, P., Villalejo-Fuerte, M.
Reproductive pattern of the squalid callista Megapitaria squalida from northwestern Mexico.
Journal of Shellfish Research. 2006. 25(3): 829-855.
Bronstein, O., Loya, Y. Photoperiod, temperature, and food availability as drivers of the annual
reproductive cycle of the sea urchin Echinometra sp. From the Gulf of Aqaba (Red Sea). Springer.
2014. United States.
Gao, B., Klein, L. E., Britten, R. J., Davidson, E. H. Sequence of mRNA coding for bindin, a
species-specific sea urchin sperm protein required for fertilization. Developmental Biology. 1986.
United States. 83: 8634-8638.
Long, J. A., Mark-Kurik, E., Johanson, Z., Lee, M. S. Y., Young, G. C., Min, Z., Ahlberg, P. E.,
Newman, M., Jones, R., Blaauwen, J., Choo, B., Trinajstic, K. Copulation in antiarch placoderms
and the origin of gnathostome internal fertilization. Nature. 2015. United States. 517: 196-199.
Smith, J. M. Evolution in sexual and asexual populations. The American Naturalist. 1968.
England. 102(927)

El objetivo general de esta prctica fue obtener tanto ovocitos como espermatozoides de las
gnadas de almejas chocolatas (Megapitaria squalida), para con ellos poder hacer posteriormente
la inseminacin artificial in vitro.

Los objetivos particulares fueron:

1) Conocer la anatoma de las almejas para poder localizar las gnadas.
2) Conocer las diferencias morfolgicas de los gametos (ovocitos y espermatozoides).
3) Desarrollar una tcnica de obtencin de gametos.
4) Elaborar preparaciones con los ovocitos y espermatozoides obtenidos para que se lleve a
cabo la fecundacin in vitro.
5) Observar las diferencias morfolgicas que se llevan a cabo en el cigoto despus de la
fecundacin.
Justificacin
Los procedimientos de la fecundacin in vitro (FIV) en los animales estn dirigidos principalmente
a poder desarrollar nuevas tecnologas para ampliar los conocimientos sobre los procesos
involucrados en el complejo fenmeno de la reproduccin as como implementar biotecnologas
en los animales domsticos, de importancia comercial y especies silvestres para mejorar la
eficiencia reproductiva y gentica de dichas especies.
Hiptesis
Al realizar las preparaciones de ovocitos y espermatozoides, si se lleva cabo la fecundacin in
vitro, entonces se podr observar en dichas preparaciones la presencia de cigotos los cuales
presentaran diferencias morfolgicas en comparacin con el ovocito no fecundado, como puede
ser la presencia de la membrana de fecundacin y la divisin celular (mitosis).
Metodologa
Material biolgico: Se obtuvieron 6 almejas chocolatas de un restaurante un da antes y se les
mantuvo en agua de acuario.
Posteriormente se escogieron dos de ellas, se abrieron con ayuda de un bistur y se ejerci
presin para lograr su apertura. Una vez abiertas, se identific la gnada.
Una vez identificada la gnada de las dos almejas, cada una se extrajo en una caja Petri y se
maceraron para identificar los gametos masculinos y femeninos en el microscopio de luz.
Para la fecundacin in vitro se tom una gota de cada una de las cajas Petri y se mezclaron en
un portaobjetos para verlo al microscopio de luz. En una caja Petri aparte se mezcl el macerado
de la gnada del
macho y hembra
y tambin se
observaron
al
microscopio.
Posteriormente
se
esper
a
observar
la
fecundacin.

Fig.1 Diagrama de fecundacin invitro

Garca Cruz Karla Paola

Resultados
Dentro de las seis almejas chocolatas con las que se contaba, se logr separar a una hembra y
un macho, para obtener los gametos se abri a las almejas y se extrajeron las gnadas (Figura
1) las cuales se maceraron (Figura 2), de las gnadas maceradas se hicieron preparaciones para
observarlas al microscopio ptico a 40x (Figura 3) y as poder diferenciar a los gametos (ovocitos
y espermatozoides). Una vez identificados, se elaboraron preparaciones con los ovocitos y
espermatozoides para que se llevara a cabo la fecundacin in vitro, en estas preparaciones se
observ que efectivamente en algunos ovocitos se llev a cabo la fecundacin in vitro y se pudo
observar tanto la capa hialina alrededor del huevo as como la membrana de fecundacin e
incluso en algunos casos el inicio de la divisin celular la cual originaria posteriormente al cigoto
de dos clulas (Figura 4).

Figura 1: Se muestran las almejas abiertas: (A) hembra y (A-1) macho. Tambien se sealan
las gnadas (G) de un color caf-verdoso.

Figura 2: Macerado de las gnadas en cajas Petri: (A) hembra y (A-1) macho, se puede
distinguir un cambio en el color del macerado, en el caso de la hembra es ms obscuro.

Figura 3: Preparaciones realizadas con los macerados: (A) hembra; se muestran los ovocitos
con un tamao considerable, (A-1) macho; se muestran los espermatoziodes de menor
tamao que los ovocitos y redondos.

Figura 4: Preparaciones de ovocitos y espermatozoides, en los cuales se llevo a cabo la

fecundacion in vitro en algunos ovocitos: (A) cigoto a 40x; en el cual se puede observar la
capa hialina que cubre la superficie del huevo, asi como la membrana de fecundacion, (A-1)
cigotos a 10x; en los cuales se observa tambien la capa hialina e incluso en algunos de ellos
se observa una forma de pera que dara paso a la division celular.

Discusion:
Primeramente podemos distinguir que la reproduccion en las almejas es anisogmica, ya que los
gametos son distintos, ambos son redondos pero los espermatozoides son de menor tamao que
los ovocitos.
Si bien el proceso de la fecundacion en las almejas chocolatas (Megapitaria squalida) no es bien
conocido, se puede comparar dicho proceso con el ya estudiado en otros organismos marinos
con fecundacion externa como es el caso del erizo de mar.
Podemos decir que si se llevo a cabo la fecundacion in vitro ya que se observo la presencia de la
membrana de fertilizacion y la capa hialina rodeando al huevo. En los erizos de mar: una vez que
los espermatozoides se unen a la zona pelucida tiene lugar la reaccion acrosomica en la cual las
enzimas acrosomicas abren una via de penetracion que permite que el espermatozoide se una a
la membrana plasmatica del ovocito para fecundarlo, poco despues de la fecundacion se produce
la reaccion cortical en la cual la entrada del espermatozoide en la la membrana plasmatica va
acompaada de la fusion de granulos corticales con la membrana plasmatica del ovulo, estos
granulos liberan su contenido y una enzima liberada destruye los receptores de los
espermatozoides situados en la capa vitelina, posteriormente la capa vitelina se separa del ovulo
y las proteinas procedentes de los granulos corticales se asocian con la membrana vitelina
transformandola en una cubierta protectora llamada membrana de fecundacion. Al mismo tiempo
otro material coloidal procedente de los granulos corticales va cubriendo la superficie del huevo y
forma una membrana transparente llamada capa hialina (Epel,1978).
Si bien no pudimos observar todos estos procesos involucrados en la formacion de la membrana
de fecundacion y la capa hialina devido a que se dan de manera rapida, si se observaron ambas
estructuras en los cigotos obtenidos en las preparaciones de ovocitos y espermatozoides.
Otra cosa que se pudo observar en las preparaciones fue la forma de pera del ovulo, esta forma
se debe a que se estaba llebando a cabo la division celular (mitosis), para dar lugar a un cigoto de
dos celulas y asi susesivamente (proceso de segmentacion). Sin embargo no se pudo seguir
observando la division hasta que se completara y se formaran las dos celulas.

Conclusion:
A pesar de la importancia comercial de la almeja chocolata (Megapitaria squalida), se conoce muy
poco sobre su biologa, y casi nada sobre su reproduccin, su fecundacion es externa propia de
animales acuticos, en la cual los individuos lanzan al agua sus gametos.

Mediante los procedimientos de la fecundacin in vitro (FIV) se puede obtener mayor

conocimiento sobre el proceso de la fecundacin en este caso en las almejas chocolatas. La FIV
tambin es una herramienta importante en el mejoramiento de la eficiencia reproductiva de los
organismos de importancia comercial u otras especies.
En el presente trabajo se pudo realizar la fecundacion in vitro de dichas almejas, mediante la
realizacion de preparaciones con ovocitos y espermatozoides obtenidos de las gnadas de un
macho y un hembra, se observaron las diferencias morfolgicas del ovulo despues de la
fecundacion por el espermatozoide asi como el inicio del proceso de segmentacion en la cual hay
una serie de divisiones mitoticas.

Referencia:
El proceso de la fecundacion. David Epel. Investigacion y Ciencia,1978. No. 16:62-73.

RESULTADOS
Una vez que se abrieron las almejas, al tener las gnadas muy parecidas, se tuvieron que observar al
microscopio algunas muestras para verificar la presencia de gametos masculinos y femeninos
respectivamente. Se observ que una de las almejas (hembra) tena una gnada de color verde pastoso y
oscuro, mientras que la otra (macho) presentaba una coloracin caf ms clara.

Fig.1. Gnadas de (Megapitaria squalida).A. Almeja Hembra. B.

Almeja macho.

En el macerado de las gnadas se observa que la coloracin de los macerados es ligeramente

diferente, ya que el macerado de la hembra es de coloracin ms oscura que la del macho.

Fig.2. Macerado de (Megapitaria squalida).A. Almeja Hembra. B.

Almeja macho.

Una vez observados los gametos al microscopio de luz, se pudieron identificar por el tamao,
forma y cantidad. En el caso de los femeninos, estn en menor cantidad, pero son ms grandes y
ovales que los masculinos, pues estos son menos grandes pero en proporcin, son ms.

Fig.3. Gametos de (Megapitaria squalida).A. Algunos gametos femeninos estn

enmarcados. B. Gametos masculinos (algunos enmarcados)

Fig.4. Ovocitos de (Megapitaria squalida) el contorno color rosa muestra a un cigoto,

pues comienza la primera divisin, teniendo forma de pera o chichn. Los contornos en
azul, representan la capa de fecundacin que se forma alrededor del vulo una vez que
el espermatozoide penetra al ovocito.

Fig.5. vulo fecundado de (Megapitaria squalida) el

contorno color blanco muestra la membrana vitelina.

Fig.6. Acercamiento del vulo de (Megapitaria squalida) a 40x. vulo fecundado

mostrando capa hialina y membrana de fecundacin (remarcado en gris)

Fig.7. Acercamiento del vulo de (Megapitaria squalida) a 40x. Cigoto listo para la
segmentacin en su primera divisin

DISCUSIN
El proceso de fecundacin es un proceso muy complejo, como se pudo observar en la prctica.
En el caso de nuestro equipo, usamos almejas. El usar este modelo biolgico, result de gran
conveniencia porque la extraccin de gnadas de estos animales es de suma facilidad y adems,
liberan un elevado nmero de gametos de los cuales, hay mayor probabilidad de que lleguen a
interactuar en el agua marina y generen nueva descendencia, lo que los hace ideales para

estudiar el proceso de la fecundacin. En nuestro caso, usamos agua de acuario, y a los gametos
femeninos solo se les agreg cierta cantidad de espermatozoos.
Aunque es cierto que el proceso es fcil, el conocer que a las almejas debamos mantenerlas en
las condiciones favorables para llevar acabo la prctica, fue de gran ayuda, ya que debimos de
mantenerlas en una condicin parecida a su medio ambiente, a los gametos despus de extraer
las gnadas debimos de tenerlos en agua salina, ya que al ser organismos de vida acutica, si no
se mantenan en ese estado, en el caso de las almejas, podran haber muerto y los gametos,
sufrir un choque osmtico.
En cuanto al proceso de fecundacin solo se alcanz a observar cuando el espermatozoide haba
ingresado al vulo, pero si conocemos la teora, al lograr el espermatozoide hacer eso, significa
que tuvo que liberar enzimas digestivas que le permitieran perforar las capas que cubren al vulo
para llegar hasta el, y lo ms impresionante, en un tiempo relativamente corto.
En el caso de la almeja, se sabe que presentan fecundacin externa y que la liberacin de los
gametos al medio es un evento crtico, ya que los gametos son viables por un corto periodo de
tiempo, por lo que el xito de la fertilizacin puede depender del grado de sincrona de los
individuos durante el desove (Himmelman 1981). En nuestro caso, si fue posible observar la
fecundacin.
Se pudo ver la membrana de fecundacin, que como menciona la bibliografa consultada, es una
cubierta protectora que es formada por protenas procedentes de los grnulos corticales que se
asocian con la membrana vitelina ya desunida (que se distancia de la superficie del huevo por
entrada de agua) y la capa hialina, procedente de los grnulos que cubre la superficie del huevo
formando una membrana transparente. Se sabe que una vez que los gametos fusionan sus
ncleos, se forma el cigoto y comienza la segmentacin por mitosis, que suponemos, son los
vulos en forma de pera que observamos.
Conclusin
Se logr nuestro objetivo, el poder realizar la fecundacin in vitro. Aunque este proceso de cierta
manera nos result sencillo, el conocer previamente las condiciones que se requeran para
lograrlo fueron de gran utilidad para que tuviramos xito. Cabe mencionar tambin que debido a
la falta de tiempo, no se pudo observar el proceso completo de segmentacin, pero si se
observaron indicios de este.
Por tanto, la fecundacin es un proceso complejo, que requiere de bastante gasto de energa por
parte de los organismos para que este proceso se lleve a cabo y de cierta manera, lograr la
permanencia de la especie.
El utilizar animales invertebrados, en nuestro caso almejas, es ideal para el estudio sobre la
fecundacin, porque al liberar muchos gametos, hay mayor probabilidad de encontrar algn vulo
fecundado, y satisfactoriamente se puede decir que lo observamos.

Epel D. 1978. El proceso de la fecundacin.Investigacin y Ciencia. N.16:62-73.

Romo P. 2010. ESTRATEGIA REPRODUCTIVA DE Megapitaria squalida (SOWERBY, 1835) EN

DOS ZONAS DE BAJA CALIFORNIA SUR, MXICO. Centro interdisciplinario en Ciencias
Marinas. Instituto politcnico Nacional (IPN). La Paz, Baja California Sur.