La vacuna antipoliomieltica inactivada (IPV) se utiliza para la proteccin contra

la poliomielitis en los Pases Bajos. No est claro si la vacuna IPV parenteral

puede conducir a la imprimacin de el sistema inmune de la mucosa. Hemos
desarrollado y evaluado los ensayos de ELISA para la la deteccin de virus de
la polio-el serotipo especfico de IgA y anticuerpos IgA secretores. Uso estos
ensayos, se examinaron la cintica de la respuesta de IgA en suero secuencial
muestras de 15 pacientes de poliomielitis despus de la infeccin natural con
el serotipo 3 virus de la polio. IgA se mantuvo presente en el 36% de los
pacientes durante un mximo de cinco meses despus de la
infeccin. Adems, la presencia de anticuerpos IgA se examin en un
IPVvaccinated la poblacin que utiliza el suero de los nios pequeos (4-12
aos de edad, n = 177), los nios mayores (13-15 aos de edad, n = 123), los
donantes de sangre sanos (n = 66) y, naturalmente, inmunes las personas de
edad (n = 54). La seroprevalencia de IgA fue baja en los jvenes vacunados los
nios de los tres serotipos (5% -7%), y en nios mayores vacunados para los
tipos 2 y 3 (2% -3%). La seroprevalencia para el tipo 1 fue significativamente
mayor (18%) en los mayores los nios que en los nios ms pequeos. Esta
mayor seroprevalencia es ms probable explica por la persistencia de la
infeccin por IgA siguiente con el serotipo 1 del virus de la polio de tipo salvaje
la tensin durante la epidemia de 1978. La seroprevalencia de tipo 1 - y 2-IgA
especfica fue significativamente mayor en los adultos sanos que en los nios
pequeos. Estos resultados sugieren que al menos parte de la IgA se encuentra
en la poblacin de edad es inducida por Las infecciones no relacionadas con el
calendario de vacunacin IPV. Finalmente, se encontr que parenteral IPV
vacunacin fue capaz de aumentar (secrecin) las respuestas de IgA en el 74%
-87% de una la poblacin expuesta, naturalmente, de edad avanzada (n = 54).
Aunque la presencia de (s) de IgA en IPVvaccinated personas que ha sido
previamente documentada, nuestros hallazgos sugieren que cebado mucosa
con virus vivos es necesaria para obtener una respuesta de IgA despus de VPI
la vacunacin de refuerzo.
introduccin
Respuestas sistmicas de anticuerpos a la infeccin por virus de la polio y la
vacuna (viva o
virus inactivado) han sido ampliamente estudiados. La presencia de circulante
los anticuerpos neutralizantes son suficientes para la proteccin contra la
enfermedad paraltica [13]. En Por el contrario, se sabe menos sobre la
induccin de la inmunidad de la mucosa, lo cual es importante
la limitacin de la circulacin del virus en la comunidad, as como para la
proteccin contra infeccin [7,13].
Un componente importante de la inmunidad de la mucosa es la IgA secretora
(IgAs). La presencia
de IgAs en las superficies mucosas reduce la excrecin viral despus de la
vacuna antipoliomieltica oral (OPV) desafo [12]. En teora, la vacuna
antipoliomieltica inactivada por va intramuscular (IPV) se espera para inducir
sIgA poco o nada. Sin embargo, varios estudios han medido cierto grado de
inmunidad local en los vacunados IPV, aunque menos eficaz que la inmunidad
en las personas vacunadas por va oral con la OPV o infectados con el virus
salvaje [3,4,7,8,14].

Una dificultad inherente en la comparacin de los resultados de diferentes

estudios se encuentra en el hecho de que los planes de vacunacin y las dosis
no se han estandarizado entre los pases. Por lo tanto, no est claro si la
superioridad de la vacunacin de OPV ms de potencia mejorada VPI (eIPV) con
respecto a inmunidad de la mucosa se aplica al situacin en los Pases Bajos,
donde se les da un total de seis vacunas IPV a los 3, 4, 5 y 12 meses y,
posteriormente, a las 4 y 9 aos de edad. Adems, la mayora de los estudios
de inmunidad de la mucosa se han realizado con personas recin vacunadas.
Este puede no reflejar la situacin tal como se aplica a los grupos de mayor
edad El tema en cuestin es si la vacuna IPV confiere inmunidad suficiente de
la mucosa prohibir la introduccin del virus de circulacin siguiente en la
comunidad. Esto es particularmente
importante en los Pases Bajos, donde los bolsillos de las comunidades
religiosas con baja la cobertura de vacunacin existen. Las epidemias de
poliomielitis se produjo en estos grupos en 1978 y 1992 [5,16,17].
El propsito de este trabajo fue desarrollar virus de la polio-IgA especficos de
los ensayos y estudiar la cintica de la respuesta de IgA despus de la
infeccin y en una poblacin vacunada VPI.
Materiales y Mtodos
Las muestras clnicas La especificidad del poliovirus IgA especfica-ELISA fue
probada usando muestras de suero de las personas negativas para los
anticuerpos neutralizantes de virus de la polio (n = 114). Estos Las muestras se
obtuvieron de los nios no vacunados de un segmento de la
poblacin que se niega la vacunacin por motivos religiosos. Las muestras que
tenan ttulos de anticuerpos neutralizantes de <1:2 para los tres serotipos del
virus de la polio, y que fueron negativo para anticuerpos frente a otros
componentes del cctel vacuna (difteria y toxoide tetnico) utilizado en la
inmunizacin rutinaria de nios en los Pases Bajos fueron considerados como
verdaderos negativos. La sensibilidad de los ensayos se determin usando un
panel de sueros de pacientes con infeccin por poliovirus demostrada en 2,5
meses despus de la aparicin de la parlisis. Los pacientes eran del serotipo 3
1992-1993 brote en los Pases Bajos (n = 54) y desde el estallido en Pakistn
durante el ao 1991 - 1995 la participacin de los tres serotipos (n = 98). La
infeccin fue confirmada en todos los pacientes el aislamiento de poliovirus
salvaje en muestras de heces y por la deteccin de poliovirus IgM especfica en
suero por ELISA [11]. Aislados poliovirus salvajes eran discriminados de los
virus derivados de la vacuna mediante un ELISA utilizando el tipo especfico de
crossabsorbed antisueros como se describi previamente [20].
Secuenciales muestras de suero de 15 pacientes (rango de edad 1-36 aos)
desde el 1992 - 1993 el serotipo 3 epidemia en los Pases Bajos fueron
analizadas para la presencia de IgM e Anticuerpos IgA, a fin de determinar la
cintica de la respuesta de IgA despus naturales infeccin. Especficas de
poliomyelits los niveles de IgM en muestras de suero se determin que
onfirmar la infeccin primaria. Los sueros de los siguientes grupos fueron
investigados para Determinar la seroprevalencia de virus de la polio-IgA
especfica en un IPV-vacunados poblacin:
1] Los sueros de los escolares entre 4 y 12 aos de edad, recogidos poco
despus de IPV vacunacin (n = 177), o entre 13 y 15 aos de edad (n = 123).
Se trata de suero Las muestras haban sido recogidas durante el brote de 1992-

1993 en los Pases Bajos en Para comprobar la seroprevalencia de anticuerpos

neutralizantes al poliovirus y poner a prueba evidencia de infeccin por
poliovirus dentro de este grupo. Todos los nios haban sido vacunadas con la
IPV, tenan niveles protectores de anticuerpos neutralizantes contra los tres
serotipos, y fueron positivos para anticuerpos contra el toxoide de la difteria y
el ttanos (tambin incluidos en la vacuna). Los nios ms pequeos (4-12
aos) haba recibido cuatro-seis dosis de IPV y los escolares mayores de esa
edad (13-15 aos) haba completado el IPV esquema de vacunacin varios
aos antes.
2] Los sueros de vacunados totalmente IPV-donantes de sangre sanos fueron
evaluados para determinar la persistencia a largo plazo de IgA despus de la
vacunacin (n = 66). Este ltimo grupo se compar con la edad-emparejados
donantes de sangre procedentes de Blgica (n = 66) donde la VPO se utiliza en
el programa nacional de vacunacin (OPV a los 3, 4, 5 meses 12, ya las 6 y 12
aos de edad). El rango de edad de ambos grupos de donantes de sangre era
de entre 18 y 65 aos (Promedio 39 aos).
3] Los sueros de un grupo de no vacunados personas mayores de los Pases
Bajos (52-85 aos, n = 54) que haban recibido una sola dosis de la IPV fueron
examinados para detectar la presencia de anticuerpos neutralizantes y IgA
especfica del virus de la polio. Este grupo se espera que sea expuestos de
forma natural a una edad temprana, cuando el poliovirus era endmico en los
Pases Bajos.Los sueros se recogieron en el momento de la vacunacin VPI y en
1 y despus de 4 semanas. IgA-ELISA
Pocillos de placas de microtitulacin (Nunc, Maxisorb) se revistieron durante la
noche a + 4 C con
serotipo anticuerpo monoclonal especfico para el poliovirus a una
concentracin de 0,6 a 1,2 ug / ml en 0,04 M de carbonato-bicarbonato (pH
9,6). Los anticuerpos monoclonales utilizados fueron 5-18D8 para poliovirus
tipo 1, 1-10C9E6 de tipo 2, y 2-13D9 para el tipo 3 [15]. Pocillos de control
negativo fueron recubiertas con un anticuerpo monoclonal para la influenza A
virus (6-21/19-6, A/Singapore/6/86 (H1N1) cepa especfica). Despus de
bloquear durante 1 hora a 37 C con 5% Blotto (Pierce, Oud Beijerland, Pases
Bajos) en PBS que contena 0,05% de Tween 20, 40 a 70 unidades de Dantgeno (la forma que se encuentra en el virus infeccioso) de inactivado con
formaldehdo poliovirus se aadieron a cada pocillo. Se utiliz la inactivada
Mahoney cepa para el tipo 1, el MEF para el tipo 2, y Saukett para el tipo 3
ensayo, todos de la planta de produccin de la vacuna del Instituto Nacional de
Salud Pblica y Medio Ambiente (RIVM). Las cepas de poliovirus se deriva
originalmente de la American Type Culture Collection (ATCC). Las placas se
incubaron durante dos horas a 37 C. Salina tamponada con fosfato que
contiene 0,5% de Tween 20 y 2% Blotto era utiliza como un tampn de
dilucin. Los volmenes de 100l fueron utilizados, y las placas se lavaron
cuatro veces en PBS con 0,05% de Tween 20 entre cada etapa de incubacin.
En los pozos paralelos, tampn de dilucin sin virus se aadi en el control de
unin no especfica de los sueros.

Antes de la prueba, los sueros fueron agotados de IgG con Quik-septiembre

(Isolab, Malinas, Blgica) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para
evitar interisotype posible competencia. Diluciones de suero de 1/50 se
aadieron a las placas y se incubaron durante la noche a + 4 C. Despus del
lavado, una dilucin ptima (1/8000) de cabra anti-humano IgA marcado con
fosfatasa alcalina (alfa-cadena especfica, Sigma, Zwijndrecht, Pases Bajos) y
se incub durante 1,5 horas a 37 C. Las placas se lavaron y 100 l por pocillo
de la P-nitrofenilfosfato se aadi a una concentracin de 1 mg / ml en tampn
0,1 M glicina (pH 10,4). Despus de la incubacin a temperatura ambiente
durante 30 minutos las placas se leyeron a 405 nm por utilizacin de una
microplaca Organon Teknika sistema 510 espectrofotmetro. Una muestra de
suero se consider positiva si la ptica densidad (OD) era superior al nivel de
corte, que se define como el promedio de OD + 3 norma desviaciones de los
resultados obtenidos con los sueros de control negativo de personas no
vacunadas (N = 114). Al menos uno de IgA positivo (derivado de un sujeto
VPO-vacunados) y un IgA srica control negativo se incluy en cada plato.
Diluciones ptimas de anticuerpos monoclonales, antgenos virales, sueros, y
anticuerpos detectores se establecieron por las titulaciones de tablero de
ajedrez. Las diluciones de reactivos seleccionados para esta prueba siempre y
cuando el ms altos OD diferencias entre la seal y los niveles de fondo.
Especificidad de los positivos seales se confirm mediante el bloqueo de
experimentos en los que las muestras de suero fueron preincubadas con
poliovirus homlogos ( 120 D-antgeno unidades) durante 2 horas a 37 C, y
se centrifug durante 3 minutos a 10,000 rpm para eliminar complejos
inmunes antes probando en ELISA. Una reduccin de la seal de> 50% se
considera confirmatoria. La IgA secretora ELISA de captura Un ELISA de captura
se utiliz para investigar el suero de la poblacin de edad para determinar si se
detecta IgA despus de la vacunacin IPV tambin estuvo presente en su forma
secretora.
El ensayo fue una modificacin de la prueba ELISA IgM que se ha descrito
anteriormente [11]. Brevemente, placas de microtitulacin se recubrieron con
anticuerpo monoclonal contra secretora
componente (Sigma, Zwijndrecht, Holanda) durante la noche a 4 C en
carbonato tampn. Las placas fueron bloqueadas con normal de 5% de suero
de cabra, suero diluciones (1:50) fueron aadido, y las placas se incubaron
durante 1,5 horas a 37 C. El formaldehdo inactivado poliovirus tipo 1, 2 o 3
se aadi como se ha descrito, y el antgeno unido se detect con peroxidasa
de rbano marcado con serotipo anticuerpo monoclonal especfico (1 hora, 37
C). Tetrametilbencidina (TMB) se utiliz como sustrato (0,1 mg / ml) en 0,11 M
tampn acetato sdico, y la reaccin se detuvo despus de 30 minutos con 2 M
de H2SO4.
Las muestras de suero fueron considerados positivos si las respuestas estaban
por encima del nivel de corte, definidos como la densidad media ptica (OD) +
3 desviaciones estndar de los resultados obtenidos con los sueros de control
negativo de las personas no vacunados (n = 114). Al menos uno de sIgA y un
suero de sIgA control negativo se incluy en cada placa. Poliovirus de tipo IgM
especfica de anticuerpos ELISA de captura La IgM-ELISA se realiz como se
describi previamente [11]. En los pozos breve, de microplacas se revistieron
durante la noche a 4 C con 100l de--cadena especfica anticuerpo

monoclonal para IgM humana (Sanbio BV, Uden, Holanda) a una dilucin de
1:100 en PBS, suplementado con 0,5 20% de Tween, y 5% de suero fetal de
ternero. Suero diluciones (1:50) se aadieron y se incubaron durante la noche a
4 C. Inactivada poliovirus suspensin que contiene entre 40 y 70 unidades de
D-antgeno y se aadi incubaron durante 2 horas a 37 C. Antgeno unido se
detect por horseradishperoxidase- etiquetados serotipo anticuerpos
monoclonales especficos (1 hora, 37 C). TMB Se utiliz como sustrato, y el
desarrollo de color se detuvo despus de 12 minutos por el Adems de 2M de
H2SO4. Un resultado positivo y un suero control negativo y un control positivo /
negativo de corte suero fueron examinadas en cada ensayo. La positiva /
negativa de corte suero fue preparado sobre la base de la comparacin con el
distribucin de la DO450 valores obtenidos con los sueros de los pacientes y
saludables controles. Una relacin de> 1 entre la muestra y la DO450 DO450
de corte en suero fue considerado para indicar la presencia de poliovirus IgM
especfica en la muestra.
La neutralizacin de ensayo Los ttulos de anticuerpos neutralizantes de
poliovirus (NT) de los sueros se determinaron en la norma prueba de
microneutralizacin segn lo recomendado por la OMS [21], utilizando
Mahoney (serotipo 1), MEF (serotipo 2) y Saukett (serotipo 3) las cepas de virus
como el virus de desafo.
Mtodos Estadsticos
Un anlisis de Chi-cuadrado se realiz para determinar la significacin de la
diferencia en la seroprevalencia entre los dos grupos. Los valores de p <0,05
fueron considerados significativos.