NOVAS METODOLOGIAS PARA A FERMENTAO ALCOLICA DO

SORO DE QUEIJO
L. DOMINGUES, N. LIMA e J.A.TEIXEIRA
Centro de Engenharia Biolgica IBQF, Universidade do Minho
4700 320 Braga Portugal.
RESUMO
Em Portugal, so diariamente lanados no meio ambiente cerca de 1 milho de litros de
soro de queijo fraco lquida resultante do fabrico de queijo. O impacte ambiental
ocasionado por tal volume de efluentes, com elevada carga orgnica, enorme.
Recorrendo tecnologia de DNA recombinante, modificou-se uma estirpe floculante de
Saccharomyces cerevisiae sendo-lhe conferida capacidade para fermentar lactose. Com
esta estirpe foram realizados ensaios de fermentao em contnuo, utilizando como
substrato soro de queijo desproteinizado, possibilitando operar a uma taxa de diluio
mxima de 0,45 h-1, correspondente a uma produtividade volumtrica em etanol de
cerca de 10 gL-1h-1, cerca de 7 vezes superior aos processos actualmente existentes. O
processo integrado de recuperao da protena e fermentao alcolica permite uma
reduo superior a 90 % de CQO do soro, o que, por si s, se traduz numa enorme
diminuio do impacte ambiental negativo, e, por outro lado, abre a porta produo de
etanol com viabilidade econmica.
PALAVRAS CHAVE: Permeado do soro de queijo; fermentao alcolica;
fermentao contnua; floculao; Saccharomyces cerevisiae.
INTRODUO
Presentemente, o desenvolvimento de processos capazes de resolver proveitosamente o
problema colocado por muitos efluentes industriais um dos principais desafios da
biotecnologia ambiental.
Entre os principais efluentes do sector de lacticnios encontra-se o soro de queijo,
tambm denominado por soro de leite, traduzindo-se no lquido obtido aps
precipitao da casena do leite. A produo de queijo , deste modo, responsvel pela
gerao de grandes quantidades de soro de queijo, que, se rejeitado como efluente,
constitui um grave problema ambiental devido sua elevada carga orgnica e difcil
biodegradabilidade. O CQO (carncia qumica de oxignio) do soro chega a atingir
60000 mgL-1, impossibilitando a sua incorporao num qualquer processo de tratamento
tradicional de efluentes. Com o avano da tecnologia, o fabrico de queijo passou de um
processo tradicional, onde as pequenas quantidades de soro produzidas eram despejadas
nos campos ou usadas como rao alimentar, para um processo industrial onde so
produzidos diariamente milhares de litros de soro, cujo escoamento tem acrescidas

dificuldades, agravadas por to elevada produo. Urge, assim, encontrar uma soluo
para a enorme quantidade de soro produzida por esta indstria agro-alimentar.
Em Portugal, a maioria das indstrias de lacticnios no contemplam ainda a fase de
valorizao de resduos, sendo no entanto, um dos sectores com o qual o Ministrio do
Ambiente celebrou Contratos de Adaptao Ambiental e cuja adeso por parte das
empresas foi voluntria. Actualmente, em virtude do referido Contrato, as empresas
aderentes tero que cumprir a legislao ambiental vigente at 31 de Dezembro de 1999
[6].
As caractersticas do efluente obtido na produo de queijo que, por um lado, possui um
elevado valor nutricional mas, por outro, um potencial poluente, constituem um ponto
de enormes presses para que a indstria de lacticnios encontre alternativas para o seu
uso [2]. O soro constitudo por gua, lactose e 20 % das protenas do leite
(reconhecidas pelo seu elevado valor nutricional) e a maior parte das vitaminas e
minerais deste. Na tabela I apresenta-se a constituio tpica do soro de queijo doce.

Tabela I Composio do soro de queijo doce.

Componente
gua
Lactose
Protenas
Minerais
Gordura

Concentrao (%)
93-94
4,5-5,0
0,8-1,0
0,5-0,7
0,1-0,5

Desde a Antiguidade (460 A.C.), o soro de queijo tem sido valorizado pelo Homem,
sendo mesmo utilizado como rao animal ou suplemento de consumo humano. Ainda
hoje o soro seco largamente utilizado. No entanto, a quantidade produzida
geralmente superior s necessidades do mercado. Alm de apresentar desvantagens
deste ser muito flutuante, os custos de produo so elevados devido aos gastos
energticos do equipamento utilizado na secagem. A secagem um processo cmodo
que permite resolver o problema ambiental da descarga do soro sem criar resduos
adicionais derivados deste tratamento, no sendo, no entanto, economicamente
atractivo.
Por cada litro de soro so desperdiados cerca de 50 g de lactose e 10 g de protena com
elevado valor nutricional e funcional, criando condies para poder pensar-se num
processo de valorizao do soro com simultnea reduo da carga poluente. Hoje em
dia, o concentrado de protenas de soro a maior produo obtida a partir do soro de
queijo, apenas ultrapassada pelas do soro em p e do soro em p desmineralizado [8]. O
valor comercial deste produto est directamente relacionado com o seu teor proteico,
podendo servir de aditivo na indstria de panificao (concentrados de 35 % de
protena) ou de ingrediente na confeco de alimentos infantis (concentrados com 92 %
de protena), este ltimo com um preo dez vezes superior ao primeiro. O concentrado

proteico obtido tipicamente por ultrafiltrao, originando uma fraco rica em lactose,
o permeado do soro de queijo. A obteno do concentrado proteico, por si s, no se
apresenta economicamente vivel uma vez que apenas 1/6 do volume de soro serve para
a produo de protena, restando ainda um considervel volume de permeado de soro de
queijo a manusear [1]. O permeado do soro pode ser utilizado para diversos fins, como
alimentao de animais, produo de lactose, galactose, glucose, lcool, cido lctico ou
como constituinte em diversos produtos farmacuticos e mesmo cosmticos. O factor
determinante ser, novamente, o aspecto econmico. Alguns processos que utilizam o
permeado do soro como substrato para fermentao alcolica j se encontram
implementados, nomeadamente na New Zealand Cooperative Dairy Co. na Nova
Zelndia, na Barbery Milk Products Lda., na Irlanda e em Wisconsin, nos E.U.A. O
lcool obtido neste processo essencialmente de dois tipos: lcool industrial e potvel.
O primeiro encontra aplicabilidade como combustvel e o segundo como rectificador de
bebidas alcolicas. O processo de valorizao do soro de queijo em causa encontra-se
esquematizado na figura 1.

Soro de queijo
Ultrafiltrao

Permeado

Concentrado

Fermentador

Secagem

Mosto Fermentado
Destilador

Efluente

Concentrado proteico em p

Destilado (Etanol)

Fig. 1 Esquema da valorizao integral do soro de queijo [1].

Apesar dos processos de fermentao alcolica do permeado de soro de queijo j
estarem bem estabelecidos, existem ainda alguns aspectos passveis de melhoramento.
A utilizao de fermentao em contnuo (os processos existentes utilizam fermentao
por partidas) num sistema de alta densidade celular, uma das alternativas a considerar.
Estes sistemas baseiam-se na reteno de microrganismos no interior do fermentador,

utilizando para esse efeito diferentes tcnicas. A imobilizao de microrganismos e a

incorporao de membranas no bioreactor, so algumas das tcnicas utilizadas, sendo a
floculao uma das mais atraentes.
A floculao (formao de agregados celulares) verifica-se espontnea e
frequentemente em bactrias, leveduras, fungos filamentosos, algas, clulas animais e
vegetais. O seu aproveitamento em aplicaes industriais remonta a vrias dcadas no
sector cervejeiro e no tratamento de guas residuais com lamas activadas. Os
bioreactores de alta densidade celular, quando operados continuamente, servem-se das
propriedades de sedimentao rpida de clulas floculadas para reterem a biomassa no
seu interior. Ao permitirem manter concentraes celulares elevadas, atingem
produtividades e concentraes de produto muito superiores s dos sistemas
convencionais. Outra vantagem destes sistemas o melhoramento significativo dos
processos de separao, tornando-os menos agressivos e com menores custos de
produo j que a quantidade de clulas a separar por centrifugao ou filtrao
reduzida fortemente. Refira-se ainda, a maior estabilidade destes sistemas de alta
densidade celular a longo termo (comparativamente aos sistemas convencionais) e
proteco que apresentam contra contaminaes.
Outro aspecto em que os processos de fermentao da lactose so passveis de
melhoramento no se prende com o processo em si, mas com o microrganismo utilizado
na fermentao alcolica da lactose. O microrganismo mais utilizado a levedura do
gnero Kluyveromyces, que fermenta naturalmente este acar apresentando, no entanto,
problemas de inibio por etanol. As leveduras do gnero Saccharomyces so
largamente utilizados na produo de alimentos e bebidas alcolicas, representando os
microrganismos de eleio para fermentao alcolica.
Apesar de a levedura Saccharomyces cerevisiae fermentar uma grande variedade de
acares, no capaz de metabolizar a lactose, devido ausncia da enzima galactosidase (que hidrolisa este acar em glucose e galactose) e da permease da
lactose, que permite a entrada da lactose para o interior das clulas. Tm surgido nos
ltimos anos, vrias abordagens para a fermentao da lactose por S. cerevisiae. Uma
das primeiras a surgir, utiliza a tcnica de fuso de protoplastos, construindo hbridos de
estirpes de Saccharomyces cerevisiae e Kluyveromyces lactis utilizadores de lactose [5].
No entanto, neste caso especfico, a clonagem e transformao em S. cerevisiae uma
abordagem prefervel e mais precisa.
No presente trabalho, construiu-se uma estirpe floculante de Saccharomyces cerevisiae
capaz de metabolizar e fermentar a lactose, recorrendo tecnologia do DNA
recombinante. Assim, alm de se poder utilizar o microrganismo de eleio para
fermentao alcolica na fermentao da lactose presente no permeado do soro, foi
tambm possvel operar em sistema de alta densidade celular com elevada
produtividade em etanol.

CONDIES EXPERIMENTAIS
Descrio da Instalao Experimental
O bioreactor utilizado est representado na figura 2.

Fig. 2 - Esquema representativo do bioreactor airlift.

Trata-se de um airlift de circulao interna, do tipo tubo ascensor concntrico, com um
volume de 5,5 L. O ar injectado imediatamente abaixo do tubo ascensor, atravs de
um injector de 1 mm de dimetro, promovendo assim a mistura no interior do
bioreactor. No topo, o alargamento cnico invertido permite uma rea de
desgaseificao e uma zona de desacelerao dos flocos. Parte do lquido fermentado
transborda naturalmente para a zona de sada, e o restante reciclado juntamente com a
biomassa para a zona descensora (downcomer) e novamente para o tubo ascensor
(riser). Um anteparo semicilndrico vertical na zona de sada, evita que um maior
nmero de partculas sejam arrastadas pelo efluente. O sistema de regulao permite:
controlo de temperatura 301C; controlo de pH por adio automtica de amnia, para
um set-point fixo de 40,1; controlo de espuma por adio de um anti-espuma (Sigma
A-5551). O sistema foi arejado com ar esterilizado a um caudal entre 0,08 e 1 vvm. A
taxa de diluio variou entre 0,1 e 0,55 h-1.

Microrganismo utilizado
A construo detalhada da estirpe floculante de Saccharomyces cerevisiae capaz de
metabolizar a lactose encontra-se j descrita [3]. Resumidamente, desenvolveu-se um
sistema de transformao que utilizou como estirpe hospedeira a levedura S. cerevisiae
NCYC869-A3 (Mat=Flo1 ura3) e co-transformao dos vectores pKR1B-Lac4-1
(contm os genes LAC4 e LAC12 de Kluyveromyces lactis) e pYAC4 (contm a marca
URA3). O gene LAC12 de Kluyveromyces lactis codifica para uma permease da lactose
permitindo assim, a entrada da lactose atravs da parede celular. O gene LAC4 de
Kluyveromyces lactis codifica para a protena intracelular -galactosidase que hidrolisa
a lactose nos monossacridos, -D-glucose e -D-galactose, acares metabolizveis
pela levedura Saccharomyces cerevisiae. A marca auxotrfica URA permite a seleco
dos transformantes na ausncia de uracilo no meio de cultura. Com este sistema, obtevese o transformante denominado T1 que se utilizou na fermentao alcolica do
permeado do soro de queijo.
RESULTADOS E DISCUSSO
Caractersticas do permeado do soro de queijo
Na tabela II apresenta-se a composio do permeado do soro de queijo, obtido aps
ultrafiltrao do soro.

Tabela II Composio do soro de queijo, permeado e concentrado [7].

Componente (%)
Protena
Azoto no proteico
Lactose
Cinza
Gordura
Slidos Totais

Soro
0,60
0,20
4,80
0,55
0,05
6,2

Concentrado
3,27
0,30
5,46
0,77
0,28
10,1

Permeado
0,02
0,18
4,66
0,50
0
5,4

Da leitura da tabela II, pode-se verificar que o permeado de soro constitudo por cerca
de 50 gL-1 de lactose e traos de outros nutrientes, tais como protena, azoto e algumas
vitaminas.
Fermentao descontnua do permeado do soro
Numa primeira fase, tornou-se necessrio verificar em cultura descontnua, se o
transformante T1 era capaz de fermentar a lactose presente no permeado sem adio de
qualquer outro nutriente. A necessidade de adio de outros nutrientes seria
desvantajosa do ponto de vista econmico. Como se pode observar na figura 3, em
apenas 30 horas o transformante T1 metabolizou a totalidade de acar presente no
permeado, produzindo etanol, com valores prximos do valor teoricamente esperado.

Alm disso, estes valores so muito semelhantes aos previamente obtidos para meio
sinttico [4].

60

4,5

[Biom assa] gL-1

3,5

40

3
2,5

30

2
20

1,5
1

[Lactose]; [Etanol] gL-1

50

10

0,5
0

0
0

10

20

30

40

50

Tem po (horas)

Fig.3 - Perfis de concentrao celular ( ), lactose (), e etanol ( ) relativos ao

transformante T1 em cultura agitada em matraz, utilizando como substrato o
permeado de soro de queijo.

Fermentao contnua do permeado do soro

Uma vez confirmada a viabilidade de utilizao do permeado de soro como substrato
para fermentao alcolica, procedeu-se fermentao em contnuo. Na figura 4
apresentam-se os diferentes parmetros de fermentao medidos durante operao em
estado pseudo-estacionrio do bioreactor contnuo a taxas de diluio crescentes. A
operao com permeado iniciou-se taxa de diluio de 0,1 h-1 aps atingir estado
pseudo-estacionrio com meio sinttico. Aps atingir concentraes de lactose residuais
(< 1gL-1) a taxa de diluio foi sendo aumentada at o valor de 0,55 h-1.
A concentrao celular no interior do bioreactor aumentou at taxa de diluio (D) de
0,36 h-1, atingindo o valor mximo de 42 gL-1 (peso seco). Para D acima de 0,45 h-1 a
concentrao celular no interior do bioreactor diminuiu e aumentou na corrente de
sada. Ao aumentar a taxa de diluio de 0,45 h-1 para 0,5 h-1, a concentrao de lactose
residual aumentou para 16 gL-1. Durante o perodo de operao com permeado de soro
de queijo, a viabilidade celular manteve-se acima de 90%.

[Biomassa]; [Lactose]; [Etanol] gL-1

45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0,10

0,20

0,36

0,45

0,50

0,55

-1

Taxa de Diluio (h )

Fig.4 - Variao da concentrao celular (), lactose () e etanol ( ) em estado pseudoestacionrio com a taxa de diluio, para o bioreactor alimentado com permeado
de soro de queijo.
Analisando dois parmetros de grande importncia, que so o rendimento de converso
em etanol (), expresso por

(%) =

P
(S f S )0.538 100

(Eq.1)

e a produtividade em etanol, definida por

Q p = DP

(Eq.2)

pode constatar-se que o estado metablico das clulas nos flocos se manteve constante
nas taxas de diluio e condies de operao estudadas. Na figura 5, a produtividade
em etanol, e o factor de converso em etanol esto representados. Como se pode
observar a produtividade em etanol aumenta at 0,45h-1 de taxa de diluio, decrescendo
posteriormente, enquanto que o factor de converso em etanol se mantm constante at
essa taxa de diluio decrescendo posteriormente.
Uma das principais vantagens dos sistemas de alta densidade celular a sua resistncia
a contaminaes. Para comprovar esse aspecto e uma vez que o permeado de soro no
foi esterilizado, procedeu-se a um rastreio de contaminaes ao bioreactor alimentado
com permeado de soro. Uma vez que as bactrias so facilmente detectadas sob
observao microscpica quando comparadas com S. cerevisiae, optou-se por um

rastreio selectivo para detectar leveduras contaminantes que so difceis de descriminar

opticamente. Este rastreio foi efectuado regularmente atravs de espalhamento em
placas de meio de lisina (Oxoid CM191) e nenhuma levedura contaminante foi
encontrada, comprovando-se desta forma a resistncia destes sistemas a contaminaes.

100
14

90
80
70

10

60
8

50

(%)

Qp (gL -1h -1)

12

40
30

20
2
0
0,10

10
0,20

0,30

0,40

0
0,60

0,50

Taxa de diluio (h -1)

Fig. 5 - Variao da produtividade em etanol (), e factor de converso em etanol ()

com a taxa de diluio para o bioreactor alimentado com permeado de soro de
queijo.
Ao contrrio dos concentrados proteicos que apresentam um alargado leque de
utilizaes e so economicamente atractivos, o permeado de soro considerado como
tendo pouco ou mesmo nenhum valor econmico [9]. No entanto, os volumes
produzidos so muito elevados, sendo pelo menos necessrio algum tratamento antes da
sua descarga como efluente. Atravs da incorporao da recuperao da protena
juntamente com a fermentao alcolica uma reduo superior a 90 % do CQO obtida
juntamente com a produo de etanol (ver tabela III). Alm disso, o procedimento de
fermentao aqui apresentado permite atingir estes objectivos a um baixo custo.
Tabela III Caracterizao fsico-qumica do soro de queijo e do efluente final (obtido
aps fermentao e destilao do permeado do soro).
Parmetro
pH
CQO (mgO2L-1)
CBO5(mgO2L-1)
SST(mgL-1)
Azoto Total (mgL-1)

Soro
5,5-6,5
76 076
67 067
11 440
1 329

Efluente final
3,8-4,3
7 221
2 133
262
705

Reduo (%)
91
97
98
47

CONCLUSO

Construiu-se uma estirpe floculante de Saccharomyces cerevisiae capaz de utilizar o

permeado do soro de queijo como nica fonte de carbono e energia, fermentando cerca
de 50 gL-1 de lactose presente no permeado sem adio suplementar de qualquer outro
nutriente. Com esta estirpe procedeu-se a ensaios em contnuo, num reactor airlift em
cultura de alta densidade celular. A operao em contnuo permitiu eliminar a lactose do
permeado, produzindo simultaneamente etanol. Para este sistema, obteve-se uma
produtividade em etanol de cerca de 10 gL-1h-1 com um factor de converso de 80 % do
valor terico e consumo total de lactose. A produtividade em etanol largamente
superior obtida nos sistemas convencionais. Desta forma, abrem-se perspectivas
atraentes utilizao do permeado de soro para fermentao alcolica.
NOMENCLATURA
P Concentrao de etanol
S Concentrao de lactose
X Concentrao celular
Subscritos
f Concentrao na alimentao

Agradecimentos: Os autores agradecem o apoio financeiro concedido pelo Instituto de

Biotecnologia e Qumica Fina (IBQF), PROLAC e Agncia de Inovao. Luclia
Domingues financiada por uma bolsa do programa PRAXIS XXI (BD/11305/97) da Fundao
para a Cincia e Tecnologia.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
[1] BARRY, J.A. 1982. Alcohol production from cheese whey. Dairy Industry International 47,
19-22.
[2] DOMINGUES, L. 1996. Construo e caracterizao de estirpes floculantes de
Saccharomyces cerevisiae capazes de utilizarem a lactose. Tese de Mestrado, Universidade do
Minho, Braga. 133 pp.
[3] DOMINGUES, L., TEIXEIRA J.A. e LIMA N. 1999. Construction of a flocculent
Saccharomyces cerevisiae fermenting lactose. Applied Microbiology and Biotechnology 51,
621-626.
[4] DOMINGUES, L., DANTAS M.M., LIMA N. e TEIXEIRA J.A. 1999. Continuous ethanol
fermentation of lactose by a recombinant flocculating Saccharomyces cerevisiae strain.
Biotechnology and Bioengineering (no prelo).
[5] FARAHNAK, F., SEKI, T., RYU, D.Y. e OGRYDZIAK, D. 1986. Construction of lactoseassimilating and high ethanol producing yeasts by protoplast fusion. Applied Environmental
Microbiology 51, 362-367.
[6] FERRAZ, A. 1999. Adaptao ambiental no sector dos lacticnios. AIP Ambiente 22, 23-29.
[7] KUMAR, V. 1988. Cloning and expression of the Aspergillus niger -galactosidase gene in
Saccharomyces cerevisiae. Ph. D. Thesis, University of London.
[8] HORTON, B. 1996. Wheys of recovery. Whey processing 5, 39-40.
[9] MOULIN, G. e GALZY P. 1984. Whey, a potential substrate for biotechnology.
Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 1, 347-373.

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