Objetivos:
El objetivo de la práctica consiste en aislar una proteína de un grupo de ellas e
identificarla. Para alcanzar el fin del experimento se debe concluir una serie de
pasos, estos siguen una temporalidad a lo largo de cinco días.
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Separación de Proteínas Mediante Electroforesis (SDS-
PAGE)
Es una técnica que se utiliza para separar proteínas de acuerdo con su movilidad
electroforética. Gracias al SDS la mayoría de proteínas adquieren una relación
carga/masa idéntica, por lo que se obtiene un fraccionamiento que obedece
únicamente a la longitud de la cadena.
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Bisacrilamida(C7H10N2O2). Su estructura está compuesta por dos moléculas de
poliacrilamida enlazadas por sus grupos amino, no reactivos de cara a la
polimerización. Por ello, la bisacrilamida polimeriza conjuntamente con la
acrilamida pero establece puentes entre las cadenas lineales de poliacrilamida, y
así evita el deslizamiento de éstas y conduce a la formación del gel.
Glicerol (C3H8O3). Contribuye a que la muestra baje por los pocillos que se
encuentran en la parte superior (gel empaquetamiento) debido a su densidad. Va
en el tampón de carga.
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insignificante cuando se compara con las cargas negativas aportadas por SDS.
Sin SDS, proteínas con pesos moleculares similares que migran de manera
diferente debido a las diferencias en la proporción de carga en masa, ya que cada
proteína tiene un punto isoeléctrico y peso molecular particular a su estructura
primaria. Añadir SDS resuelve este problema, ya que se une a la proteína y la
rodea, dando una cierta carga negativa uniforme a lo largo de la longitud del
polipéptido.
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Digestión con tripsina de las proteínas separadas mediante
electroforesis SDS-PAGE.
Lo primero que se hace es recoger el gel y cortar la banda que queremos e
introducirlo en tubo con una disolución de bicarbonato amónico que sirve para ir
retirando el tinte y esto se hace combinado con temperatura y agitación.
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Representación esquemática de la tripsina
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Con acetonitrilo se lava la Zip-Tip, también se la añade TFA que aparte de para
el lavado sirve también para equilibrar. Una vez equilibrado el Zip-Tip se añade
la muestra que se carga y descarga varias veces con el fin de impregnar la fase
estacionaria con la tripsina. Posteriormente se lava varias veces, para que salga
toda la cantidad de péptidos posible, esto se hace acetonitrilo y TFA.
Los solventes se vaporizan, dejando sólo la matriz recristalizada, pero ahora con
las moléculas de la muestra extendido por todo el cristal.
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evento. La energía del láser expulsa iones de la matriz electrónicamente
excitados, cationes y macromoléculas neutrales, que crean una densa nube de gas
por encima de la superficie de la muestra. La macromolécula es ionizada por las
colisiones. La transferencia de energía es suficiente para promover la transición
de las moléculas de la matriz y los péptidos del estado sólido al estado gaseoso.
Entonces, las moléculas se aceleran en el campo eléctrico de un espectrómetro de
masas y vuelan hacia un detector de iones, donde su llegada se detecta como una
señal eléctrica. Su masa es proporcional a su tiempo de vuelo (TOF) y se puede
calcular en consecuencia.
Para calibra el aparato se utiliza una serie de péptidos (cuya masa se conoce)
provenientes de proteínas como ACT, angiotensina e insulina bovina.