JONATHAN OLMOS ZRATE ECOLOGA MICROBIANA NO CUENTA 1223733

Tcnicas moleculares para evaluar la estructura microbiana Comunidad , funcin y

dinmica en el Medio Ambiente
Molecular Techniques to Assess Microbial Community Structure, Function, and Dynamics in the Environment
Gurdeep Rastogi and Rajesh K. Sani

Los diferentes microorganismos son los responsables de los procesos ecologicos con
ms realse, de ellos destacan la fromacion de la estructura del suelo el reciclaje de
elementos escenciales en la microbiota, y descomposicion de materia orgnica.
El mundo microbiano para las diversas tierras es escencial, a travez de diversos ensayos
bioqumicos y moleculares se han inducido a stos organismos para reveler su
composicin y respuesta a diversos ambientes
Estos nuevos enfoques permiten la vinculacin entre los procesos ecolgicos en el medio
ambiente con las poblaciones microbianas especficas y nos ayudan a responder a las
preguntas importantes de la ecologa microbiana, tales como cules son los factores y
recursos gobiernan la enorme diversidad gentica y metablica en un entorno.
Mtodos moleculares de anlisis microbiano de la Comunidad
Cmo la mayora de las comunidades microbianas no se han cultivado en laboratorio, la
fuente primaria de informacin de organismos incultivados pero viables son sus
biomolculas.
Con base en los anlisis comparativos de firmas rRNA, la vida celular se ha clasificado en
tres dominios principales: un eucariota y dos procariotas (bacterias y arqueas).

1. Enfoques de Anlisis de la
Comunidad parcial
2. Estas
estrategias
incluyen
generalmente la reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR)
basados en mtodos donde se
utiliza ADN / ARN total extrado
de una muestra ambiental como
una
plantilla
para
la
caracterizacin
de
los
microorganismos.
3. El producto de PCR generado
refleja una mezcla de firmas de
genes microbianos a partir de
todos los organismos presentes
en una muestra, incluyendo la

fraccin VBNC. La amplificacin

por PCR de genes conservados,
tales como 16S rRNA se utilizan
ampliamente
principalmente
debido a que estos genes estan
presente en todos los procariotas,
estn
estructural
y
funcionalmente conservados y
contienen regiones variables y
altamente conservadas.
4. Mtodo Biblioteca de Clonacin
5. ste mtodo es el ms usual ara
analizar los productos de PCR
amplificados a partir de una
muestra ambiental, basndose en

JONATHAN OLMOS ZRATE ECOLOGA MICROBIANA NO CUENTA 1223733

clonar y luego secuenciar los

fragmentos de genes individuales.
6. Mientras las bibliotecas de clones
de genes 16S rRNA permiten un
estudio inicial de la diversidad y la
identificacin de nuevos taxones,
los estudios han demostrado que
las muestras ambientales como el
suelo pueden requerir ms de
40.000 clones para documentar
50% de la riqueza, una tpica
biblioteca de 16S RNA contienen
menos de 1.000 secuencias y por
lo tanto revelan slo una pequea
parte de la diversidad microbiana
presente en una muestra.
7. Tcnicas de huellas genticas
8. Producen una huella digital
comunitaria
basada
en
el
polimorfismo de secuencia o
polimorfismo
de
longitud.En
general, son rpidos y permiten el
anlisis simultneo de mltiples
muestras y se han diseado para
demostrar un efecto en las
comunidades
microbianas
o
diferencias entre las comunidades
microbianas y no proporcionar
identidades taxonmicas directos.
9. Estas
tcnicas
incluyen
DGGE/TGGE, SSCP, RAPD,
ARDRA, T-RFLP, LH-PCR, RISA:
10. DGGE/TGGE (Electroforesis en
gel de gradiente desnaturalizante o
en gradiente de temperatura)
11. En la DGGE, los productos de
PCR se obtienen a partir de ADN
ambiental utilizando cebadores
para un marcador molecular
especfico y electroforesis en un

gel de poliacrilamida que contiene

un
gradiente
lineal
de
desnaturalizante del ADN, tales
como una mezcla de urea y
formamida.
12. La TTGE se basa en el mismo
principio de DGGE excepto que
se aplica un gradiente de
temperatura
en
lugar
de
desnaturalizante qumico. La
variacin de la secuencia entre
los diferentes amplicones de PCR
determina el comportamiento de
fusin, y por lo tanto con
diferentes
secuencias
de
amplicones dejan de migrar en
diferentes posiciones en el gel.
13. Tanto DGGE y TTGE implican el
uso de un 5-GC 5
sujeta
cebador directo durante la
primera etapa de PCR, lo cual es
esencial para evitar que las dos
hebras de ADN a partir de la
disociacin completa en cadenas
sencillas durante la electroforesis.
14. SSCP(Polimorfismo de
conformacin de cadena sencilla)
15. En
SSCP,
los
productos
ambientales
de
PCR
se
desnaturalizan seguido de la
separacin electrofortica de
fragmentos de DNA de cadena
sencilla
en
un
gel
de
poliacrilamida
no
desnaturalizante.
16. La separacin se basa en las
diferencias
sutiles
en
las
secuencias desde un solo par de
bases, lo que resulta en una
estructura secundaria plegada
diferente que conducen a una

JONATHAN OLMOS ZRATE ECOLOGA MICROBIANA NO CUENTA 1223733

diferencia medible en movilidad

en el gel.
17. No requiere ningn cebadores
GC sujetos, geles de gradiente, o
aparatos
de
electroforesis
especializada; por lo tanto, es una
tcnica ms simple y sencilla.
18. *RAPD y DAF ( Amplificacin
aleatoria polimrfica de ADN y
amplificacin de huellas
dactilares de ADN)
19. Utilizan tcnicas de amplificacin
por PCR con un cebador corto
que se hibrida al azar en mltiples
sitios en el ADN genmico en
condiciones de baja temperatura
de recocido, tpicamente 35
C . Estos mtodos generan
amplicones de PCR de diferentes
longitudes en una sola reaccin
que se separ en gel de agarosa
o poliacrilamida dependiendo de
la complejidad gentica de las
comunidades microbianas.
20. Debido a la alta velocidad y
facilidad de uso, RAPD / DAF se
ha utilizado ampliamente en las
huellas digitales de la estructura
general
de
la
comunidad
microbiana
y
estrechamente
relacionado especies bacterianas
y cepas.
21. *ARDRA (Anlisis de
restriccin del ADN ribosmico
amplificado)
22. Se basa en variaciones de la
secuencia de ADN presentes en
16S rRNA amplificados por PCR
genes. El producto de PCR
amplificado a partir de ADN

ambiental
generalmente
se
digiere con endonucleasas de
restriccin
tetracutter
(por
ejemplo, AluI, HaeIII y), y los
fragmentos de restriccin se
resuelven
en
agarosa
o
poliacrilamida geles. Ofrece poca
o ninguna informacin sobre el
tipo de MO presentes en la
muestra, pero es til para la
monitorizacin rpida de las
comunidades microbianas en el
tiempo, o para comparar la
diversidad
microbiana
en
respuesta
a
condiciones
ambientales cambiantes.
23. T-RFLP (Polimorfismo de
longitud de fragmentos de
restriccin terminales)
24. El T-RFLP es similar a ARDRA
excepto por una diferencia
importante, que es el uso de un
cebador
5marcado
con
fluorescencia durante la reaccin
de PCR. Los productos de PCR
resultantes se digirieren con la
enzima de restriccin, y los
fragmentos
de
restriccin
terminales (T-FR) se separaron
en un secuenciador de ADN
automatizado.
Slo
los
fragmentos
de
restriccin
terminales
etiquetados
fluorescentes
se
detectan,
simplificando as el patrn de
bandas y permite el anlisis de
las comunidades microbianas
complejas.
25. La diversidad de la Comunidad se
estima mediante el anlisis de los
tamaos, nmeros y alturas de
los picos de resultado T-FR. Cada

JONATHAN OLMOS ZRATE ECOLOGA MICROBIANA NO CUENTA 1223733

T-RF se supone para representar

un solo OTU o ribotipos..
26. LH-PCR (Longitud
heterogeneidad PCR anlisis)
27. Similar al mtodo de T-RFLP
excepto que este detecta las
variaciones de longitud de
ampliacin que se producen
despus de la digestin de
restriccin, mientras que en LHPCR diferentes microorganismos
son discriminados sobre la base
de polimorfismos de longitud
naturales que se producen debido
a mutacin en los genes. El
Amplicon de LH-PCR interroga a
las
regiones
hipervariables
presentes en los genes 16S rRNA
y produce un perfil caracterstico.
28. Utiliza un cebador marcado con
colorante
fluorescente
hacia
adelante, y un estndar de
tamao interno fluorescente se
ejecuta con cada muestra para
medir las longitudes de amplicn
en pares de bases. La intensidad
(altura) o el rea bajo el pico en el
electroferograma es proporcional
a la abundancia relativa de que
amplicn particular.
29. RISA (anlisis ribosomal
espaciadoras intergnicas)
30. Implica
amplificacin PCR de
una porcin de la regin
espaciadora intergnica (ISR)
presente entre los pequeos
(16S)
y
grandes
(23S)
subunidades ribosomales. El ISR
contiene una heterogeneidad
significativa en ambos secuencia
de longitud y nucletidos.

31. Mediante el uso de cebadores de

recocimiento
a
regiones
conservadas en los genes 16S y
23S rRNA, perfiles RISA pueden
ser generados a partir de la
mayora
de
las
bacterias
dominantes existentes en una
muestra ambiental. Ofrece un
perfil especfico en la comunidad,
con cada banda correspondiente
a al menos un organismo en la
comunidad original.
32. Microarreglos de ADN
33. Se han utilizado principalmente
para
proporcionar
un
alto
rendimiento y visin integral de
las comunidades microbianas en
muestras
ambientales.
Los
productos de PCR amplificados a
partir de ADN ambiental total se
hibrida directamente a sondas
moleculares conocidos, que se
adjuntan en los microarrays.
Despus de que los amplicones
de la PCR marcados con
fluorescencia se hibridan con las
sondas, las seales positivas se
obtienen mediante el uso de
microscopa confocal de barrido
lser.
34. Permite que las muestras se
evaluen con la replicacin, lo que
es una ventaja significativa en los
anlisis
de
la
comunidad
microbiana. En general, la
intensidad de seal de hibridacin
en microarrays es directamente
proporcional a la abundancia del
organismo objetivo.
35. Microarreglos de genes 16S
ARN (PhyloChip)

JONATHAN OLMOS ZRATE ECOLOGA MICROBIANA NO CUENTA 1223733

36. El microarreglo de 16S de alta

densidad universal contiene cerca
de 30.000 sondas de genes 16S
rRNA dirigidos a varias especies
microbianas
cultivadas
y
"divisiones
candidatos".
Las
sondas marca todos las 121
rdenes procariotas demarcadas
y
permiten
la
deteccin
simultnea de 8.741 taxones de
bacterias y arqueas. PhyloChip es
una tecnologa que se ha utilizado
para una rpida de perfiles de las
comunidades microbianas del
medio ambiente durante la
vigilancia
del
bioterrorismo,
biorremediacin,
el
cambio
climtico, y el seguimiento de la
fuente de contaminacin por
patgenos. PhyloChips se han
utilizado para investigar las
comunidades bacterianas del
suelo indgena.
37. Microarreglos de genes
funcionales (FGA).
38. A diferencia de PhyloChips que
son tiles en la deteccin de
composicin de la comunidad
microbiana y contienen genes de
ARNr 16S como sondas, FGA
estn diseados principalmente
para detectar grupos metablicas
especficas de bacterias. No slo
revela la estructura de la
comunidad, sino tambin a arrojar
luz sobre el potencial metablico
de la comunidad in situ.
39. Contiene sondas de genes con
funciones biolgicas conocidas;
por lo tanto, tambin son tiles en
la vinculacin de composicin de

la comunidad microbiana de las

funciones del ecosistema.
40. Q-PCR (PCR cuantitativa) o
PCR en tiempo real
41. Se ha utilizado para medir la
abundancia y la expresin de
marcadores
de
genes
taxonmicos y funcionales. A
diferencia de PCR tradicional, que
se basa en la deteccin del punto
final de los genes amplificados,
Q-PCR utiliza o bien intercalando
colorantes fluorescentes tales
como SYBR Green o sondas
fluorescentes
(TaqMan)
para
medir
la
acumulacin
de
amplicones en tiempo real
durante cada ciclo de la PCR. El
software registra el aumento en la
concentracin de amplificacin
durante la fase exponencial
temprana de amplificacin que
permite la cuantificacin de genes
(o transcripciones) cuando son
proporcionales a la concentracin
de molde de partida.
42. Cuando Q-PCR se acopla con un
precedente
de
reaccin
transcripcin inversa (RT), puede
ser utilizado para cuantificar la
expresin gnica (RT-Q-PCR).
43. FISH (Hibridacion de
fluorescencia in situ)
44. Permite
la
identificacin
filogentica in situ y enumeracin
de
clulas
microbianas
individuales por hibridacin con
sondas de oligonucleotidos de
clulas enteras. Las sondas FISH
son generalmente de 18-30
nucletidos de largo y contienen

JONATHAN OLMOS ZRATE ECOLOGA MICROBIANA NO CUENTA 1223733

un tinte fluorescente en el
extremo
5que
permite
la
deteccin de sonda unida a rRNA
celular por microscopa de
epifluorescencia. Adems,
la
intensidad
de
las
seales
fluorescentes se correlaciona con
el contenido de rRNA celular y las
tasas
de
crecimiento,
que
proporcionan informacin sobre el
estado metablico de las clulas.
FISH se puede combinar con la
citometra de flujo para un anlisis
automatizado de alta resolucion
de las poblaciones microbianas
mixtas.
45. Analisis de lpidos microbianos
46. Los lpidos estn presentes en
una proporcin relativamente
constante de la biomasa celular, y
existen cidos grasos firma en
clulas microbianas que pueden
diferenciar principales grupos
taxonmicos dentro de una
comunidad.
47. Son extrados por saponificacin
seguida por derivatizacin para
dar los respectivos FAMEs, que
luego
son
analizadas
por
cromatografa de gases. El patrn
emergente se compara entonces
con una base de datos FAME
referencia para identificar los
cidos
grasos
y
sus
correspondientes
firmas
por
microbianas por los anlisis
multivariados estadsticos.
48. Enfoque de anlisis de toda la
comunidad
49. Anlisis de secuencias de genes
16S rRNA se utiliza comnmente

en la mayora de los estudios

ecolgicos
microbianos.
Sin
embargo, al ser una molcula
altamente conservada, el gen 16S
rRNA no proporciona suficiente
resolucin en especies y nivel de
cepa.
50. Las tcnicas moleculares de todo
el genoma ofrecen una visin
ms completa de la diversidad
gentica en comparacin con los
enfoques moleculares basados
en PCR que se dirigen a un solo
o unos pocos genes. Estas
tcnicas intentan analizar toda la
informacin gentica presente en
el ADN total extrado de una
muestra ambiental o cultivo puro.
51. Cintica de hibridacin DNADNA
52. Todo el genoma de hibridacin
ADN-ADN (DDH) ofrece una
verdadera comparacin de todo el
genoma entre organismos.Las
tcnicas de DDH se emplean
para comparaciones de cultivo
puro, que han sido modificados
para su uso en anlisis de la
comunidad microbiana conjunto;
el ADN total de la comunidad
extrada
de
una
muestra
ambiental es desnaturalizada y
luego se incuba en condiciones
que les permitan hibridan o
vuelven a asociar. La tasa de
reasociacin
de
ADN
se
correlaciona con la complejidad
genmica (diversidad) presente
en la muestra.
53. Fraccionamiento contenido de
G+C

JONATHAN OLMOS ZRATE ECOLOGA MICROBIANA NO CUENTA 1223733

54. El ADN total de la comunidad se

separa fsicamente en fracciones
altamente purificadas, cada uno
representando
un
contenido
diferente de G + C que puede ser
analizada
por
tcnicas
moleculares adicionales como
DGGE / ARDRA para evaluar
mejor la diversidad total de la
comunidad. Sin embargo, la
tcnica proporciona un nivel
grueso
de
la
resolucin
filogentica
como
diferentes
grupos filogenticos pueden tener
el mismo rango de G + C.
Adems, se requiere una gran
cantidad
de
ADN
(aproximadamente 50 mg) y un
tiempo total de aproximadamente
4 das para su finalizacin.
55. Secuenciacin del genoma
microbiano completo
56. Se
secuencian
genomas
microbianos completos usando
clonacin escopeta; primero se
extrae el ADN, se fragmenta
obteniendo pequeos fragmentos
de ~ 2 kb, se ligan y clonan los
fragmentos
y
se
realiza
secuenciacin bidireccional. Se
utilizan programas informaticos
epecializados como MEGAN para
obtener las secuencias, se anotan
en marcos de lectura abierta
(ORFs)
para
predecir
las
protenas codificadas y su
funcin,
su
secuenciacin
proporciona informacin de los
procesos microbianos a nivel
molecular
57. La enorme cantidad de datos
obtenida de los programas de

secuenciacin del genoma se

deposita en las bases de datos de
bsqueda que podran ser
extrados con varios potentes
herramientas
bioinformticas
disponibles en el servidor Web
integrado genomas microbianos
58.
59. La metagenmica
60. La
metagenmica
es
la
investigacin de los genomas
microbianos
colectivos
recuperados directamente de
muestras ambientales y no se
basa en el cultivo o el
conocimiento previo de las
comunidades microbianas. En
esencia, la metagenmica no
incluye mtodos que busquen
genes
seleccionados
slo
amplificados por PCR (por
ejemplo, tcnicas de toma de
huellas dactilares genticas), ya
que no proporcionan informacin
sobre la diversidad gentica ms
all de los genes que estn
siendo amplificadas
61. La metagenmica es crucial para
la comprensin de las funciones
bioqumicas
de
los
microorganismos sin cultura y su
interaccin con otros factores
biticos y abiticos.
62. Construccin de la biblioteca
Metagenomica
implica
los
siguientes pasos:
1.

aislamiento del ADN total de una

muestra ambiental,

JONATHAN OLMOS ZRATE ECOLOGA MICROBIANA NO CUENTA 1223733

la
clonacin
escopeta
de
fragmentos de ADN al azar en un
vector adecuado,
3. la transformacin de los clones en
una bacteria husped y la
deteccin de clones positivos
2.

63. Prxima generacin de

tcnicas de secuenciacin de
ADN, transformando la
Ecologia microbiana
64. La capacidad de las tcnicas de
secuenciacin a gran escala para
generar miles de millones de
copias a bajo costo con alta
velocidad es til en muchas
aplicaciones, tales como la
secuenciacin de todo el genoma,
la
metagenmica,
metatranscriptomics,
y
proteogenmica.
65. La ventaja de utilizar la tcnica de
secuenciacin es que mltiples
muestras ambientales se pueden
combinar en una sola carrera, y
despus de la secuenciacin, las
lecturas se puede analizar a
travs de su cdigo de barras
asignado de nucletidos, que se
aade en las plantillas durante la
PCR.
66. Ecologa Microbiana Funcional:
Vinculacin de Estructura y
Funcin de la Comunidad
67. ARN extrado de muestras
ambientales
proporciona
informacin ms valiosa que el
ADN en la revelacin de las
comunidades microbianas activas
frente
a
las
comunidades
microbianas latentes

68. Esto es debido al hecho de que

rRNA y mRNA se consideran
como
indicadores
de
las
poblaciones
microbianas
funcionalmente
activas.
La
cantidad de rRNA en una clula
se correlaciona aproximadamente
con la actividad de crecimiento de
las bacterias, y el ARNm de
genes funcionales permite la
deteccin e identificacin de
bacterias que expresan realmente
actividades enzimticas clave
bajo condiciones especficas, La
diversidad microbiana catablico
tambin podra ser estudiado por
los genes de la enzima de
codificacin implicados en la
utilizacin
de
sustratos
especficos de carbono, tales
como quitina, celulosa, y lpidos
69. Isotopo de sondeo estable
70. sta tecnica consiste en ofrecer
un istopo estable de sustrato
marcado con las comunidades
microbianas cuya utilizacin sea
de inters para descifrar un
proceso biogeoqumico clave
71. Comunidades
microbianas
activas que utilizan el sustrato
marcado durante el crecimiento
incorporan los istopos dentro de
su biomasa. Las biomolculas
marcadas, se separan entonces
de la biomasa por distintos
mtodos bioqumicos, y la
identidad
filogentica
de
microorganismos
que
metabolizan el sustrato se
establece
utilizando
tcnicas
moleculares. SIP depender de
biomarcadores de ADN implica el

JONATHAN OLMOS ZRATE ECOLOGA MICROBIANA NO CUENTA 1223733

etiquetado de ADN con 13C que

podra ser separada de 12C por
CsCl equilibrio densidad de
gradiente de centrifugacin. El
ADN marcado con 13C, podra
ser analizado por la huella
gentica o tcnicas de biblioteca
de clones, que conduce a la
identificacin
de
microorganismos.

75. Cuando se utiliza en combinacin

con MAR FISH (MAR-FISH),
permite simultnea identificacin
filogentica de clulas activas que
consumen el sustrato radiactivo

72. En los ltimos aos, con los

avances en las tcnicas de
imagen y espectroscpicas, SIP
se ha combinado con otras
tcnicas tales como FISH y
microscopa
Raman
para
investigar simultneamente las
identidades taxonmicas y la
actividad de las comunidades
microbianas en la resolucin de
una sola clula

77. Matrices isotpicos permiten el

cribado funcional y filogentica de
las comunidades microbianas que
actan en una forma de alto
rendimiento. La tcnica utiliza una
combinacin de SIP para el
seguimiento de los perfiles de
captacin de sustrato y la
tecnologa de microarrays para
descifrar
las
identidades
taxonmicas de las comunidades
microbianas activas

73. Microautoradiografia
74. (MAR) se basa en el hecho de
que las clulas metablicamente
activas que utilizan sustrato
radiomarcado
pueden
ser
visualizados por la exposicin a la
emulsin de haluro de plata
sensible a la radiacin. La
emulsin se coloca en la parte
superior de las clulas que estn
montados sobre un portaobjetos
de microscopio. Despus de la
exposicin, los iones de plata
excitados precipitan como granos
negros de plata metlica dentro o
adyacente a las clulas que se
pueden observar por microscopa
electrnica
de
transmisin.
Sustratos radiomarcados usados
comnmente incluyen glucosa,
acetato, y aminocidos, que

proporcionan una vista general de

la diversidad metablica global

76. Istopos Matriz

78. En principio, las muestras se

incuban con un sustrato marcado
con 14C, que durante el curso del
crecimiento se incorpora en la
biomasa microbiana. El rRNA
marcado con 14C se separa de
etiqueta rRNA y luego marc con
fluorocromos.
Marcado
fluorescente rRNA se hibrida con
una
micromatriz
filogentico
seguido por la exploracin de las
seales
radiactivas
y
fluorescentes.
79. La tcnica permite por lo tanto
estudio paralelo de composicin
de la comunidad microbiana y el
consumo de sustrato especfico
por
microorganismos
metablicamente activas de las
comunidades
microbianas
complejas. Los principales puntos

JONATHAN OLMOS ZRATE ECOLOGA MICROBIANA NO CUENTA 1223733

fuertes de la tcnica radican en el

hecho de que no se trate de
cualquier etapa de amplificacin y
es, por tanto, libre de sesgos
asociados con la PCR. Las
limitaciones de la tcnica incluyen
las dificultades en la obtencin de
rRNA de alta calidad y la
deteccin de baja abundancia
pero las poblaciones microbianas
activas a partir de muestras
ambientales
80.
81. Enfoques posgenmicos
82. Las recientes aplicaciones de las
tcnicas moleculares basadas en
el ADN como la metagenmica
han
revelado
nuevos
conocimientos sobre la diversidad
filogentica y funcional de las
comunidades
83. Con la disponibilidad de las bases
de
datos
metagenomicas
integrales, que tambin incluye
secuencias genmicas a partir de
microorganismos no cultivados,
ahora es posible aplicar enfoques
posgenmicos
tales
como
metaproteomica
y
metatranscriptomica para revelar
la relacin entre el potencial
gentico y funcionalidad en las
comunidades microbianas
84. Metaproteomica
85. Tambin conocido comnmente
como la protemica ambientales,
se ocupa del estudio a gran
escala
de
las
protenas
expresadas por las comunidades
microbianas del medio ambiente

en un punto dado en el tiempo.

En comparacin con otras
molculas celulares como lpidos
y
cidos
nucleicos,
biomarcadores de protenas son
ms fiables y proporcionan una
imagen ms clara de las
funciones metablicas que los
genes funcionales o incluso las
transcripciones
de
ARNm
correspondientes
de
las
comunidades
86. En comparacin con mtodos
como SIP / MAR-FISH, la
protemica ofrece un enfoque
integral
para
investigar
la
fisiologa de las comunidades
microbianas
tanto
cualitativa
como
cuantitativamente.
Por
ejemplo, el perfil protemico de
las comunidades microbianas
proporciona informacin crtica
sobre
las
abundancias
de
protenas y las interacciones
protena-protena, que no podra
lograrse por el ADN / ARN
tcnicas moleculares tales como
metatranscriptomica
y
metagenmica
87. Metodolgicamente,
metaproteome anlisis implica la
extraccin de protenas totales de
una muestra ambiental
88. En algunos casos, las clulas
microbianas se separan de la
primera matriz ambiental por
ultracentrifugacin
y
luego
lisadas, que permite obtener una
calidad mucho mayor y la
cantidad
de
protenas
bacterianas. Una vez que se
obtiene la protena total, se

JONATHAN OLMOS ZRATE ECOLOGA MICROBIANA NO CUENTA 1223733

separaron
por
electroforesis
unidimensional y bidimensional
para generar un huella digital de
protenas en una comunidad.
Despus de la separacin,
manchas de protenas se digieren
y se identifican mediante una
variedad de mtodos de anlisis
de gran alcance. Espectrometra
de masas de alta eficiencia
integrado
con
cromatografa
lquida permite una identificacin
muy sensible y rpida de las
protenas
89. Proteogenmica
90. En
metaproteomica
las
secuencias de protenas podran
ser identificadas con confianza
slo si tienen una homologa
significativa
con
protenas
existentes en las bases de datos
disponibles. Sin embargo, en la
mayora
de
las
encuestas
protemicas ambientales, las
protenas slo son parientes
lejanos a las secuencias de bases
de datos conocidos. Por lo tanto,
parece que la mayora de la
protena
corta
secuencias
recuperadas de metaproteomas
por lo cual seguirn siendo no
identificado y no puede ser
asignado a sus caractersticas
funcionales y filogenticos. Sin
embargo, estas limitaciones se
han superado mediante la
combinacin
de
la
metaproteomica y metagenmica
enfoques juntos bajo el nombre
de "proteogenmica"
91. En
proteogenmica
de
la
comunidad, el total de ADN y las

protenas se extraen de la misma

muestra, lo que permite la
vinculacin de las funciones
biolgicas
a
la
identidad
filogentica con mayor confianza.
La metagenmica parte del
enfoque proteogenomica juega un
papel muy importante y aumenta
la identificacin de secuencias de
protenas
por
anlisis
de
metagenomica
92. Metatranscriptomica
93. Metatranscriptomica
(transcriptmica o ambientales)
permite el seguimiento de los
perfiles de expresin de genes
microbianos
en
ambientes
naturales mediante el estudio de
la transcripcin de genes globales
por secuenciacin aleatoria de
transcripciones de ARNm
94. Metatranscriptomica
es
particularmente adecuado para
medir los cambios en la expresin
gnica y su regulacin con
respecto a las condiciones
ambientales
cambiantes.
El
principal
desafo
en
metatranscriptomica es el hecho
de que los transcritos de ARNm
de cola microbianos no son
polyA, por lo que la obtencin de
ADN complementario (ADNc) no
es fcil
95. Un mtodo para enriquecer
selectivamente
mRNA
por
hibridacin sustractiva de rRNA
se ha desarrollado y evaluado
para el anlisis transcrito de gen
de las comunidades marinas y
bacterioplancton de agua dulce,
que revel la presencia de

JONATHAN OLMOS ZRATE ECOLOGA MICROBIANA NO CUENTA 1223733

muchas
transcripciones
que
estaban
vinculados
a
los
procesos biogeoqumicos tales
como la oxidacin de azufre
(Soxa), la asimilacin de los
compuestos y la adquisicin de
nitrgeno a travs de la
degradacin
de
poliamina
(APHA). Ms recientemente, un
mtodo de "doble-ARN" se ha
diseado
para
analizar
el
conjunto total de ARN de una
comunidad,
ya
que
es
naturalmente rico en no slo
funcionalmente
sino
tambin
molculas
taxonmicamente
relevantes, es decir, el mRNA y el
rRNA
96. Sesgos Moleculares en
mtodos de anlisis
comunitarios
97. Los sesgos asociados con la
extraccin de ADN, tales como la
lisis incompleta o preferencial de
ciertas
clulas
microbianas
pueden
distorsionar
la
composicin de la comunidad, la
riqueza, y la estructura de la
comunidad microbiana. Se sugiri
el uso de varios mtodos de
extraccin de ADN validados y
extractos de ADN que se agrupan
en mtodos moleculares basados
en PCR para reducir al mnimo
cualquier riesgo de sesgo.
98. Sesgos asociados con PCR
podran incluir la inhibicin por
compuestos tales como cidos
hmicos, que generalmente son
extrados simultneamente con el
ADN extrado de suelo.

99. Varias etapas de purificacin de

ADN se han ideado; sin embargo,
conducen a la prdida de ADN
durante la purificacin, que
tambin causa sesgo en la PCR
subsiguiente. La dilucin de las
plantillas de ADN o la dilisis se
puede aplicar, pero influye en la
eficiencia de la PCR
100.

Comentarios

101.
Con las diferentes tcnicas
que se han desaroollado gracias
al uso de los organismos en
diferentes mbitos y aplicaciones
podemos constatar que el mundo
de los MO, resulta demasiado
grande y que incluso resulta poco
describir sus tcnicas en un
resmen como tal, ya que aun se
conoce poco sobre orgnismos
micro.
102.
Todos
los
enfoques
moleculares que se le han dado a
estos organismos son de gran
relevancia, ms allegados al rea
biotecnolgica ya que al conocer
sus adaptacines propias de
estos microorganismos, as como
sus tcnicas para dilucidarlos, o
sus rutas metablicas, son de
ende auge para la investigacin,
gracias a ello puede tenerse una
manipulacin de ellos.
103.
Se pretende la mejora de
diversos pricesos biolgicos, y
por que no con ayuda de su
material gentico y/o expresin
de protenas lograr transgnicos
que ayuden a una estabilicad
ecolgica global, en sus diversos
mbitos y asi poder resolver
muchos de los problemas que

JONATHAN OLMOS ZRATE ECOLOGA MICROBIANA NO CUENTA 1223733

hoy en da son presentes, y que

la ciencia como tal es encargada
de resolver aquellos dilemas.

104.