Materiais e mtodos

1- Obteno da reta de calibrao:

Materiais:

6 tubos de ensaio
Soluo padro de glicose 0,01 M
gua
Reagente R (corrosivo)
Banho Maria

Metodologia:
Primeiramente pipetou-se a soluo de glicose para preparar os 6 tubos,
cada um contendo uma quantidade diferente. No tubo branco no
adicionado a glicose, enquanto no primeiro, segundo, terceiro, quarto e
quinto tubo so adicionados 0,2 mL, 0,4 mL, 0,6 mL, 0,8 mL e 1,0 mL,
respectivamente.
Em seguida adicionou-se gua, sendo a quantidade de 1,0 mL no tubo
branco, 0,8 mL no primeiro tubo, 0,6 mL no segundo tubo, 0,4 mL no
terceiro tubo, 0,2 mL no quarto tubo e no primeiro tubo no foi adicionado
gua.
O reagente R j preparado foi adicionado em seguida sendo 1,0 mL em cada
tubo.
Aps a adio do reagente R, os tubos foram colocados em banho maria por
5 minutos. Em seguida, os tubos foram resfriados e completados com gua
destilada at a marca dos 10 mL.
Os resultados de absorbncia foram analisados e anotados para calcular a
velocidade inicial e obter a reta de calibrao.

2- Anlise da concentrao de enzima:

Materiais:

5 tubos de ensaio
Soluo de sacarose (substrato) 0,3 M em tampo acetato 0,05 M, pH
4,7
Soluo de invertase (enzima), em tampo acetato 0,05 M, pH 4,7
Tampo acetato 0,05 M, pH 4,7
Reagente R
Banho maria

Metodologia:

Inicialmente foram preparados os 5 tubos com enzimas na seguinte

quantidade:
Tubo Branco: 0,0 mL, tubo 1: 0,2 mL, tubo 2: 0,3 mL, tubo 3: 0,4 mL, tubo 4:
0,5 mL.
A soluo tampo foi adicionada em seguida, sendo 0,5 mL, 0,3 mL, 0,2
mL,0,1 mL, nos tubos branco, tubo 1, tubo 2 e tubo 3. O tubo 4 no recebeu
adio de soluo tampo.
Aps a adio da soluo tampo, foram adicionados 0,5 mL de substrato
em cada tubo. Sendo que, a fim de analisar a formao de produto no
espao de tempo de 5 minutos, ento o tubo branco foi o primeiro a ser
colocado e, aps 1 minuto, adicionou-se essa quantidade de substrato no
tubo 1. Aps mais 1 minuto, o substrato foi adicionado no tubo 2 e assim
sucessivamente. Ao final, todos os tubos tiveram 5 minutos de reao e
foram incubados por 5 minutos.
Em seguida o reagente R foi adicionado ( 0,1 mL por tubo) e os tubos foram
colocados em banho maria por 5 minutos e novamente foram completados
com gua destilada at atingir 10 mL por tubo.
Os resultados de absorbncia obtidos foram analisados na plotagem do
grfico.

3- Velocidade enzimtica versus temperatura:

Materiais:

5 tubos de ensaio
Soluo de sacarose (substrato) 0,3 M em tampo acetato 0,05 M, pH
4,7
Soluo de invertase (enzima), em tampo acetato 0,05 M, pH 4,7
Tampo acetato 0,05 M, pH 4,7
Reagente R
Banho maria

Metodologia:
Novamente foram utilizados 5 tubos, onde apenas um tubo (o branco)
continha soluo tampo, sendo uma quantidade de 0,5 mL.
Nos demais tubos ( 1, 2, 3 e 4) foi adicionado, em cada um, 0,5 mL de
enzima. Enquanto que no tubo branco no foi adicionado a enzima.
Repetiu-se o procedimento anterior, onde a cada 1 minuto era adicionado
0,5 mL de substrato em cada tubo. Totalizando 5 minutos de reao em
cada tubo.

Logo aps a adio de cada substrato em cada tubo, o mesmo foi incubado
por 5 minutos nas temperaturas determinadas. Sendo elas: ambiente para
os tubos branco e tubo 2, 0o C para o tubo 1, 60oC e 96oC para os tubos

3 e 4, respectivamente.
A reao foi contida ao adicionar, passado os 5 minutos de incubao, 1 mL
de reagente R em cada tubo. Aps a adio, os tubos foram mantidos em
banho maria por 5 minutos.
Em seguida, completou-se os tubos com gua destilada at atingir 10 mL e
os levou para anlise de absorbncia
4- Determinao de Velocidade mxima e Km da invertase:
Materiais:

10 tubos de ensaio
Soluo de sacarose (substrato) 0,3 M em tampo acetato 0,05 M, pH
4,7
Soluo de invertase (enzima), em tampo acetato 0,05 M, pH 4,7
Tampo acetato 0,05 M, pH 4,7
Reagente R
Banho maria

Metodologia:
Primeiramente os tubos foram numerados e 1,0 mL da enzima foi
adicionada em 9 tubos, ficando apenas o tubo branco sem a adio da
mesma. Em seguida a soluo tampo foi adicionada nos tubos, com
exceo do tubo branco e do tubo 9. A quantidade de soluo tampo
adicionada foi: 0,9 mL no tubo 1, 0,8 mL no tubo 2, 0,7 mL no tubo 3, 0,6
mL no tubo 4, 0,5 mL no tubo 5, 0,4 mL no tubo 6, 0,3 mL no tubo 7 e 0,2
mL no tubo 8.
Repetindo o processo anterior, o substrato foi adicionado em cada tubo a
cada 1 minuto. Sendo 1,0 mL no tubo branco, 0,1 mL no tubo 1, 0,2 mL no
tubo 2, 0,3 mL no tubo 3, 0,4 mL no tubo 4, 0,5 mL no tubo 5, 0,6 mL no
tubo 6, 0,7 mL no tubo 7, 0,8 mL no tubo 8, 1,0 mL no tubo 9.
Ao final do procedimento, todos os tubos foram incubados por 5 minutos
cada e em seguida adicionou-se 1,0 mL de reagente R em cada tubo. Aps a
adio do reagente, os tubos foram colocados em banho maria por mais 5
minutos. Decorridos os 5 minutos, gua destilada foi adicionada em cada
tubo, em uma quantidade suficiente para completar 10 mL.
Todos os valores obtidos a partir da medio de absorbncia foram usados
nos clculos e plotagem dos grficos.