Fermentation of Soybean Meal Hydrolyzates with Saccharomyces cerevisiae

and Zymomonas mobilis for Ethanol Production

Abstract: Most of the ethanol currently produced by fermentation is derived
from sugar cane, corn, or beets. However, it makes good ecological and
economic sense to use the carbohydrates contained in by-products and
coproducts of the food processing industry for ethanol production. Soybean
meal, a co-product of the production of soybean oil, has a relatively high
carbohydrate content that could be a reasonable substrate for ethanol
production after fermentable sugars are released via hydrolysis. In this
research, the capability of Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-2233 and
Zymomonas mobilis subsp. mobilis NRRL B-4286 to produce ethanol was
evaluated using soybean meal hydrolyzates as substrates for the fermentation.
These substrates were produced from the dilute-acid hydrolysis of soybean
meal at 135 C for 45 min with 0, 0.5%, 1.25%, and 2% H2SO4 and at 120 C
for 30 min with 1.25% H2SO4. Kinetic parameters of the fermentation were
estimated using the logistic model. Ethanol production using S. cerevisiae was
highest with the substrates obtained at 135 C, 45 min, and 0.5% H2SO4 and
fermented for 8 h, 8 g/L (4 g ethanol/100 g fresh SBM), while Z. mobilis reached
its maximum ethanol production, 9.2 g/L (4.6 g ethanol/100 g fresh SBM) in the
first 20 h of fermentation with the same hydrolyzate.
Introduction
Ethanol is 1 of the only 2 transportation fuels on the market that is used
primarily as part of a mixture with petroleum-based gasoline. Currently, most
ethanol is produced by fermentation of sugars derived from cereals or sugar
crops, which raises concerns about the use of food crops for the biofuel
industry. Therefore, production of bioethanol from nonhuman food sources is
becoming attractive, especially from coproducts associated with food
production (Neureiter and others 2002; Karmee and Lin 2014). A potential
source of fermentable sugars that has been overlooked is soybean meal (SBM),
a coproduct of soybean oil production.
Soybean meal, a premium protein source for animal feed, contains
approximately 42% total carbohydrates and 55% protein (Baker and Stein
2009; Da Silva and others 2009). Of the total carbohydrates, half are structural
and the other half are comprised of low-molecular weight sugars,
oligosaccharides, and starch in relatively small quantities (Karr-Lilienthal and
others 2005). Around 17% of low-molecular-weight sugars consist of a mixture
of glucose, arabinose, galactose, fructose, and sucrose (Grieshop and others
2003). An additional merit of SBM as a potential source of fermentable sugars
for ethanol production is that after sugars are selectively extracted, a highprotein meal is left behind which can be used for animal feed. Before SBM can

be used as a substrate, fermentable sugars need to be released from the solid

matrix, by hydrolysis with dilute acid or other methods.
For this research, the capability of 2 microorganisms Saccharomyces
cerevisiae and Zymomonas mobilis to ferment SBM hydrolyzates was tested.
S. cerevisiae is one of the most common organisms used in industrial ethanolic
fermentations. It is highly robust, resistant to toxic inhibitors, and highly
tolerant of low pH levels, which minimizes the risk of contamination (Weber and
others 2010). Z. mobilis, a gram-negative bacterium, is attractive for ethanol
production due to its high productivity. A downside is that Z. mobilis has low
resistance to toxic inhibitors and can ferment only glucose, fructose, and
sucrose (Rogers and others 1982; Doran 1997; Weber and other 2010). The
objective of this research was to evaluate the ability of S. cerevisiae and Z.
mobilis to produce ethanol using acid hydrolyzates of SBM as substrates. The
kinetic parameters of the fermentation were determined using the logistic
model.
Materials and Methods
Substrates for fermentation
Five hydrolyzates of commercial SBM were used as substrates for the
fermentations. The hydrolyzates were obtained by treating soybean meals with
dilute sulfuric acid under the following conditions: 135 C for 45 min at 4 acid
concentrations (0.0%, 0.5%, 1.25%, and 2.0% H2SO4) and 120 C, 1.25%
H2SO4 for 30 min. In previous research, these conditions have proven to
produce the highest concentrations of fermentable sugars (Lujan-Rhenals
2013).
Hydrolyzates were prepared by treating 50 g of SBM with 250 mL of H2SO4
solution in 500-mL PYREXR media storage bottles with screw caps (LujanRhenals 2013). To avoid pressure buildup inside the bottles during the heat
treatment, caps were not completely tightened. A Tuttnauer 2340E Steam
Autoclave (Tuttnauer U.S.A, Delran, N.J., U.S.A.) operated according to the
preset program #1 (fast exhaust without drying) was used for the hydrolysis.
Transient heating was not considered in the analysis. After the heat treatment,
the reaction was stopped by cooling the mix in an ice-water bath followed by
the modification of pH to a range between 5.0 and 5.5 with NaOH pellets.
Solids and liquid were then separated by centrifugation at 3900 g for 35 min
at 10 C in an Allegra X-22R centrifuge with an SX4250 Rotor (Beckman Coulter
Inc., Brea, Calif., U.S.A.). Afterwards, the supernatants were filtered through
Whatman #4 filter paper (Whatman Plc., Maidstone, Kent, U.K.), analyzed for
the concentration of fermentable sugars, and used as substrates for the
fermentation. From this point forward, these substrates will be referred to as
soybean meal broth (SBMB) as listed in Table 1.

Microbial strains
Strains of S. cerevisiae NRRL Y-2233 and Z. mobilis subsp. mobilis NRRL B-4286
were provided as lyophilized powders from the culture collection of the United
States Dept. of Agriculture (USDA), Agriculture Research Service (Peoria, Ill.,
U.S.A.).
Fermentable sugar analysis
Fermentable sugars in the hydrolyzates were analyzed with High-Performance
Size Exclusion hromatography and Refractive Index (HPSEC-RI) detection. The
chromatograph was aWaters, (Milford, Mass., U.S.A.) with a 5 15 HPLC pump, a
manual injector with a 50-L sample loop, and a 2410 refractive index detector
set at 40 C. Columns used for the separation of sugars were a Shodex OH Pack
SB-804 HQ (300 8 mm) followed by Shodex OH Pack SB-802 HQ (300 8
mm) (Showa Denko America, Inc., New York, N.Y., U.S.A.) connected in series.
Columns were preceded by a Shodex OH pack SB-G (50 6 mm) guard
column. Columns and guard column were maintained at 55 C in a column
heater. A solution of 0.1 M NaNO3 with 0.2% NaN3 run isocratically at a flow
rate of 0.4 mL/min was used as the mobile phase. Sugars were quantified using
6-point calibration curves with fructose and glucose as standards. Cells
reactivation and preparation of preinoculum and inoculum Both S. cerevisiae
and Z. mobilis were reactivated in 5 mL of yeast malt (YM) broth (Dickinson and
Company, Sparks, Md., U.S.A.) and incubated at 30 C for 24 h in an orbital
shaker (Thermo Scientific Max Q 4450, Dubuque, Iowa, U.S.A.) set at 150 rpm.
The preinoculum consisted of 5 mL of sterileYMbroth at 30 C where both S.
cerevisiae and Z. mobilis were inoculated separately and grown overnight in
the orbital shaker. For each respective strain, 0.2 mL of the culture was plated
out with a loop over the surface of 2 petri dishes containing YM agar (20 g/L of
glucose, 3 g/L of yeast extract, 5 g/L of peptone, and 3 g/L of malt extract) and
grown overnight at 30 C before adding to the final inoculum. The inoculum
was prepared by adding all the colonies formed in both dishes to 80 mL of
SBMB and allowing the cells to adapt by incubating overnight at 30 C in the
orbital shaker.
Fermentation
Fermentations were conducted at 30 C for 36 h with an initial pH of 5 to 5.5,
dissolved oxygen (%DO) less than 1% after stabilization, and an initial biomass
concentration between 7106 and 1107 cells/mL (Mullins and Nesmith 1987;
Siqueira and others 2008; Laopaiboon and others 2009). The fermentor was a
1.3-LBioflo/CellinGen 115 Benchtop Fermentor & Bioreactor (New Brunswick
Scientific, Edison,N.J.,U.S.A.) with control systems for temperature, pH, %DO,
agitation, and foam level. During fermentation, samples were taken every 4 h
to estimate fermentation kinetic parameters maximum specific growth rate

(max), biomass yield from sugar (Yx/s), and ethanol yield from sugar (Yp/s)
along with volumetric ethanol productivity, rp (g/L/h). Cell density (nr. of cells/L)
was determined with a hemacytometer (Double Neubauer Counting Chamber,
3110, Hausser Scientific, Horsham, Pa., U.S.A.) and a phase contrast
microscope (Nikon Eclipse E400, Nikon Corporation, Tokyo, Japan). The cell
density was correlated with a calibration curve of cell dry weight obtained by
drying aqueous solutions of known concentrations of cells at 80 C for 20 to 24
h (Alfenore and others 2002; Buhner and Agblevor 2004). All kinetic
parameters were calculated using the following equations:
Growth kinetics and model development for the ethanol fermentation
The kinetic parameters of biomass production were determined with the
logistic model (Eq (6)) (Wang and others 2004).
(6)
where dx/dt is the rate of biomass during the time of fermentation (g cell/ h),
max is the maximum specific growth rate (h-1), x is the biomass
concentration (g/L), and xmax is the maximum biomass concentration (g/L).
Considering the following boundary conditions: t = 0, x = xo, S = So, and P = 0,
Eq (6) was integrated and Eq (7) was obtained as a result, which relates
biomass production (X) and fermentation time (t) and was used to fit the
experimental data.
(7)
For the calculation of the kinetics parameters, only glucose and fructose were
considered as growth-limiting-substrates because these sugars were consumed
in the highest and most consistent quantities by the microorganisms according
to the HPLC analysis.
Experimental design
For the fermentation, the experimental design was a complete randomized
block design with microorganism type and broth as factors (Table 1). At each
level, experiments were run twice.
Statistical analysis
Data was analyzed with SAS Version 9.2 software (SAS Inst. Inc., Cary, N.C.,
U.S.A.) and the kinetic parameters max, xmax, and xo determined. Analysis of
covariance (ANCOVA) was used to fit the data to the logistic model using the
Gauss-Newton nonlinear regression method and comparisons of each
regression coefficient across the treatments. For the minimum inhibitor
concentrations and kinetics parameters, data were analyzed with JMPR version

9.0.0 (SAS Inst. Inc.). To analyze the kinetic parameters (Yp/s, Yx/s, ms, and
qp), an analysis of variance (ANOVA) was used and differences in the mean of
the kinetic parameters were analyzed using the TukeyKramer test ( = 0.05).
Results and Discussion
Ethanol fermentation with S. cerevisiae and Z. mobilis S. cerevisiae exhibited
optimal responses for the production of ethanol, sugars consumption, and cell
growth in all the SBM broths used in this study (Figure 1). However, in most
fermentation broths, Z. mobilis was not as efficient (Figure 2). This bacterium
exhibited no growth with the hydrolyzate SBMB3 (135 C, 2% H2SO4, 45 min),
but with the SBMB1 (135 C, 0.5% H2SO4, 45 min) displayed its maximum
ethanol production. S. cerevisiae, on the other hand, demonstrated rapid sugar
consumption, likely because it is a robust microorganism that was not critically
affected by the inhibitors present in most of the hydrolyzate SBMB (LujanRhenals and others 2014). Zymomonas mobilis was affected by inhibitory
compounds of the SBMB ((Lujan-Rhenals and others 2014) and also by the
presence of salts coming from the hydrolyzate, such as sodium acetate
(CH3COONa) which is the sodium salt of acetic acid formed during the reaction
and sodium sulfate (Na2SO4) formed during the neutralization of the sulfuric
acid with sodium hydroxide. (Yang and others 2010) demonstrated that the
combination of elevated Na+ and acetate ions led to a synergistic inhibitory
effect on strain ZM4.
Kinetics of substrate consumption during fermentation
S. cerevisiae exhibited its most rapid sugar consumption of 15.6 g/L during the
initial 12 h of fermentation with the SBMB4 (120 C, 1.25% H2SO4, 30 min) and
15.1 g/L during the 1st 12 h of fermentation with the SBMB1 (135 C, 0.5%
H2SO4, 45 min) (Figure 1e). On the other hand, the SBM broths from the most
severe hydrolysis treatments appeared to result in a low rate of sugar use from
the fermentation broth by S. cerevisiae (Figure 1e). This low rate of sugar
consumption occurred due to toxic compounds formed during the hydrolysis
process that reduces the yeast growth (Lujan-Rhenals and others 2014). Z.
mobilis also expressed its most rapid sugar uptake of 15.0 g/L per 16 h of
fermentation with the SBMB1 (135 C, 0.5% H2SO4, 45 min) (Figure 2b). Similar
to S. cerevisiae, Z. mobilis had low rates of apparent sugar consumption during
growth in the broths (Figure 2c and 2d) resulting from the most severe
pretreatments, particularly SBMB2 (135 C, 1.25% H2SO4, 45 min), which is
probably due to the inhibitory effect of acetic acid and salts as previously
discussed.
Overall, the maintenance coefficient ms (g sugar consumed/ g cell h) for both
microorganisms did not yield statistically significant differences except for S.
cerevisiae with SBMB2 and SBMB3, which gave higher values (2.7 and 2.8 g

sugar/g cell h, respectively) than the other coefficients (Table 2). However,
numerically, all ms coefficients for Z. mobilis were lower than the ms
coefficients calculated for S. cerevisiae which means that the bacteria
apparently required less carbon substrate per cell than the yeast. This result
has also been previously reported by (Dien and others 2003). Therefore, Z.
mobilis utilizes less substrate per gram of cells produced than S. cerevisiae and
has more carbon available for the production of ethanol (Dien and others
2003).
Kinetics of ethanol production
S. cerevisiae exhibited its maximum ethanol production of 8 g/L during the 1st
8 h of fermentation of the SBMB1 (135 C, 0.5% H2SO4, 45 min) and SBMB4
(120 C, 1.25% H2SO4, 30 min). In contrast, the lowest ethanol production
(5.67 g/L ethanol) occurred with the SBMB3 (135 C, 2% H2SO4, 45 min) after
28 h of fermentation, where possibly some inhibitor compounds (salts, acetate
from acetic acid, and other unidentified toxic substances) could have reduced
the ethanol productivity. Ethanol production by Z. mobilis peaked at 9.2 g/L
ethanol after 20 h of fermentation with the SBMB1 (135 C, 0.5% H2SO4, 45
min). The SBMB0 (135 C, 0% H2SO4, 45 min) allowed a maximum ethanol rate
of 3.9 g/L ethanol after 20 h of fermentation. However, the lowest ethanol
production levels1 g/L at 20 hwere attained with the SBMB2 (135 C, 1.25%
H2SO4, 45 min) and SBMB4 (120 C, 1.25% H2SO4, 30 min), which is likely
caused by inhibitors (acetate from acetic acid, other salts, and unknown
compounds). There have been previous reports that ethanol production with Z.
mobilis and its growth can be reduced substantially even with low
concentrations (2 to 8 g/L) of acetic acid (Wang 2008).
The ethanol yield (Yp/s, g ethanol/g of sugars) reported in Table 2 did not show
significant statistical differences between the 2 microorganisms and the
respective SBM broths used. However, numerically both microorganisms
showed similar ethanol yields to the theoretical values, which is 100% for 0.51
g ethanol/g of sugars (Doran 1997). Fermentations in the SBM0 and SBMB1
gave the highest ethanol yields, 96% of the theoretical yield for both
microorganisms, which are comparable or even higher than values reported in
previous research (Siqueira and others 2008; Zhang and Feng 2010; Da CunhaPereira and others 2011; Letti and others 2012; Romao and others 2012).
Additionally, the highest ethanol volumetric productivity (rp) for S. cerevisiae
was achieved with the SBM1 (1.01g ethanol/L h) and SBMB4 (1.00 g ethanol/L
h), with no significant difference between the 2, but differed with respect to the
other broths used in this research (Table 2). These values for S. cerevisiae are
comparable to, and some higher than those reported by other researchers (Da
Cunha-Pereira and others 2011). However, Z. mobilis reached a maximum
ethanol volumetric productivity (rp) of 0.61 g ethanol/Lh only with the SBM1,
which is lower than the values, 1.4 to 1.8 g ethanol/Lhwith Z. mobilis during the

production of ethanol using SBM molasses (Letti and others 2012). Also, it is
lower than 2.8 g ethanol/Lh obtained for the production of ethanol with Z.
mobilis from sweet potato (Zhang and Feng 2010); however, it is higher than
0.59 g/Lh using lignocellulosic material as substrate (Mohagheghi and others
2002). These results demonstrate that the application of Z. mobilis for ethanol
fermentation is not feasible when the substrate is SBM broth obtained under
the conditions applied in these experiments. This is probably due to the high
concentration of acetic acid, salts, and other toxic unknown compounds formed
during the acid hydrolysis in the broths obtained under severe treatments.
Kinetics of biomass growth and model development for the fermentation
Data reported in Figure 1a indicate that S. cerevisiae yielded its maximum
biomass concentration (2.3 g/L) after 12 h of anaerobic fermentation when
exposed to the SBM0 (135 C, 0% H2SO4, 45 min) followed by enzymatic
treatment with cellulase. Likewise, this maximum concentration of biomass (2.3
g/L) was also reached with SBMB4 (120 C, 1.25% H2SO4, 30 min) at 24 h.
However, SBMB3 (135 C, 2% H2SO4, 45 min) exhibited a major inhibition of
yeast growth since the biomass yielded no more than 0.5 g/L after 32 h of
fermentation. Overall, production of biomass by S. cerevisiae appeared to be
directly associated with ethanol production.
Z. mobilis exhibited its highest biomass concentration, 3.9 g/L, after 20 h of
fermentation (Figure 7.2a) with the SBMB0 (135 C, 0%, H2SO4, 45 min),
followed by enzymatic treatment with cellulase.
Likewise, the biomass produced (3.3 g/L) when fermenting the SBMB1 (135 C,
0.5% H2SO4, 45 min) was very close to the former but required 24 h to reach
this level. In contrast, SBM2 (135 C, 2% H2SO4, 45 min) exhibited the primary
inhibitory effects on Z. mobilis growth due to higher concentrations of salts,
acetic acid, and other inhibitors in the broth that restricted its growth (Doran
1997; Yang and others 2010). In general, Z. mobilis also showed growthassociated ethanol production with the exception of those broths where the
bacteria were considerably inhibited.
Data of cell growth responses fitted to a logistic model during the 1st 24 h of
fermentation are shown in Table 3. The maximum specific growth rates (max)
shows that in the SBM0 and SBMB4, max for S. cerevisiae (0.63 and 0.60 h-1,
respectively) were higher but not significantly different than max for Z.
mobilis, 0.55 h-1, in the substrate T3C0t3. Wang and others (2004), also using
the logistic model, reported a max of 0.1 h-1 for the ethanolic fermentation of
apple juice with S. cerevisiae ( Huang andWang 2010) obtained a max of 5.2
h1 using Saccharomyces diastaticus with mixed sugars as a substrate.
Mohagheghi and others (2002) reported for Z. mobilis a max of 0.34 h-1 for
ethanolic fermentation of hydrolyzed lignocellulosic biomass. In general, max

for S. cerevisiae was higher for substrates obtained with pretreatments of less
severity; Z. mobilis max did not show the same pattern due to the effect of
inhibitors present in some of the SBM broths.
The initial concentration of biomass (x0) was not significantly different among
all the broths for both microorganisms, which is an indication that the inoculum
was homogeneously prepared and introduced to each SBM broth. The other
kinetic parameter derived by fitting the logistic model to the 1st 24 h of
fermentation was the maximumconcentration of biomass (xmax). For S.
cerevisiae, xmax was 2.28 and 2.23 g/L for SBMB0 and SBMB4, respectively,
while the maximum xmax for Z. mobilis was 3.79 g/L and 5.1 g/L for the SBMB0
and SBMB1, respectively. The biomass yield from substrate (Yx/s) listed in Table
2 was significantly higher (P = 0.05) for S. cerevisiae (0.1 g cell/g sugar
consumed) than Z. mobilis (0.08 g cell/ g sugar consumed) when fermenting
the SBMB1. Higher values with S. cerevisiae than Z. mobilis have also been
reported by other researchers (Dien and others 2003, Aitabdelkader and Baratti
1993). This is a function of the better resistance of the yeast to the inhibitors
present in these substrates (Weber and others 2010). However, with SBM2 the
effect was the opposite, the value for Z. mobilis was 0.15 g cell/g sugar and for
S. cerevisiae was 0.04 g cell/g sugar. Nonetheless, most of the values for S.
cerevisiae were higher than the previous reports (Siqueira and others 2008) for
the production of bioethanol from soybean molasses and similar to values (0.14
g/g) reported in other work (Ahmad and others 2011).
Conclusions
S. cerevisiae exhibited good qualities in the production of ethanol, sugars
consumption, and cell growth for all acidhydrolyzed soybean meal broths
tested without any additional nutrients, while Z. mobilis had a lower
performance for most broths. The highest ethanol production of S. cerevisiae, 8
g ethanol/L, (4 g ethanol/100 g fresh SBM) was reached during the 1st 8 h of
fermentation with the broth obtained at 135 C, 0.5% H2SO4, 45 min and the
one at 120 C, 1.25% H2SO4, and 30 min. However, Z. mobilis yielded
maximum ethanol production, 9.2 g/L ethanol, (4.6 g ethanol/100 g fresh SBM)
only after the 1st 20 h with the hydrolyzate obtained at 135 C, 0.5%H2SO4, 45
min.

La fermentacin del hidrolizado harina de soja con Saccharomyces cerevisiae y

Zymomonas mobilis para produccin de etanol
Resumen: La mayor parte del etanol producido actualmente por la
fermentacin se deriva de la caa de azcar, maz o remolacha. Sin embargo,
es de sentido comn ecolgica y econmica de utilizar los carbohidratos
contenidos en los subproductos y coproductos de la industria de procesamiento

de alimentos para la produccin de etanol. La harina de soja, un co-producto

de la produccin de aceite de soja, tiene un contenido relativamente alto de
hidratos de carbono que podra ser un sustrato razonable para la produccin de
etanol despus de azcares fermentables son liberados a travs de la
hidrlisis. En esta investigacin, la capacidad de Saccharomyces cerevisiae
NRRL Y-2233 y Zymomonas mobilis subsp. mobilis NRRL B-4286 para producir
etanol se evalu utilizando harina de soja hidrolizado como sustratos para la
fermentacin. Estos sustratos se producen a partir de la hidrlisis de cido
diluido de la harina de soja a 135 C durante 45 min con 0, 0,5%, 1,25%, y 2%
de H2SO4 y a 120 C durante 30 min con 1,25% de H2SO4. Los parmetros
cinticos de la fermentacin se calcula utilizando el modelo logstico. La
produccin de etanol usando S. cerevisiae fue ms alta con los sustratos
obtenidos a 135 C, 45 min, y 0.5% de H2SO4 y fermentados durante 8 h, 8 g /
L (4 g de etanol / 100 g SBM fresca), mientras Z. mobilis alcanz su produccin
de etanol mximo, 9,2 g / L (4,6 g de etanol / 100 g SBM fresco) en la primera
20 h de fermentacin con la misma hidrolizado.
Introduccin
El etanol es 1 de los 2 nicos combustibles para el transporte en el mercado
que se utiliza principalmente como parte de una mezcla con la gasolina a base
de petrleo. Actualmente, la mayor parte del etanol se produce por
fermentacin de azcares derivados de cereales o cultivos de azcar, lo que
plantea preocupaciones sobre el uso de cultivos alimenticios para la industria
de los biocombustibles. Por lo tanto, la produccin de bioetanol a partir de
fuentes de alimentos no humanos es cada vez atractiva, especialmente de coproductos asociados a la produccin de alimentos (Neureiter y otros 2002;
Karmee y Lin 2014). Una posible fuente de azcares fermentables que se ha
pasado por alto es la harina de soja (SBM), un co-producto de la produccin de
aceite de soja.
La harina de soja, una fuente de protena de alta calidad para la alimentacin
animal, contiene aproximadamente el 42% de carbohidratos totales y protena
de 55% (Baker y Stein 2009; Da Silva y otros 2009). De los carbohidratos
totales, la mitad son estructural y la otra mitad est compuesta por azcares
de bajo peso molecular, oligosacridos y almidn en cantidades relativamente
pequeas (Karr-Lilienthal y otros 2005). Alrededor de 17% de azcares de bajo
peso molecular consisten en una mezcla de glucosa, arabinosa, galactosa,
fructosa, y sacarosa (Grieshop y otros 2003). Un mrito adicional de SBM como
una fuente potencial de azcares fermentables para la produccin de etanol es
que despus de azcares se extraen selectivamente, una comida alta en
protenas se deja detrs de la cual puede ser utilizada para la alimentacin
animal. Antes de SBM se puede utilizar como un sustrato, azcares
fermentables necesitan para ser liberado de la matriz slida, por hidrlisis con
cido diluido u otros mtodos.

Para esta investigacin, la capacidad de 2 microorganismos -Saccharomyces

cerevisiae y Zymomonas mobilis- fermentar hidrolizados SBM se puso a
prueba. S. cerevisiae es uno de los organismos ms comunes utilizados en las
fermentaciones industriales etanlicos. Es muy robusto, resistente a los
inhibidores txicos, y altamente tolerante de los niveles de pH bajos, lo que
minimiza el riesgo de contaminacin (Weber y otros 2010). Z. mobilis, una
bacteria gram-negativa, es atractivo para la produccin de etanol debido a su
alta productividad. Un inconveniente es que Z. mobilis tiene una baja
resistencia a los inhibidores txicos y puede fermentar solamente glucosa,
fructosa, y sacarosa (Rogers y otros 1982; Doran 1997; Weber y otros 2010). El
objetivo de esta investigacin fue evaluar la capacidad de S. cerevisiae y Z.
mobilis para producir etanol utilizando hidrolizados cidos de SBM como
sustratos. Los parmetros cinticos de la fermentacin se determinaron
utilizando el modelo logstico.
Materiales y METODOS
Los sustratos para la fermentacin
Cinco hidrolizados de SBM comercial se utilizaron como sustratos para las
fermentaciones. Los hidrolizados se obtuvieron mediante el tratamiento de
harinas de soja con cido sulfrico diluido en las siguientes condiciones: 135
C durante 45 min a 4 concentraciones de cido (0,0%, 0,5%, 1,25%, y 2,0% de
H2SO4) y 120 C, 1,25% de H2SO4 durante 30 min. En investigaciones
anteriores, estas condiciones han demostrado producir las ms altas
concentraciones de azcares fermentables (Luj'an-Rhenals 2013).
Los hidrolizados se prepararon por tratamiento de 50 g de SBM con 250 ml de
H2SO4 solucin en botellas de 500 ml PYREXR de almacenamiento de medios
de comunicacin con tapones de rosca (Luj'an-Rhenals 2013). Para evitar la
acumulacin de presin dentro de las botellas durante el tratamiento trmico,
tapones no fueron completamente apretados. Un Autoclave de vapor Tuttnauer
2340E (Tuttnauer EE.UU., Delran, NJ, EE.UU.) operado de acuerdo con el
programa preestablecido # 1 (de escape rpido sin secado) se utiliz para la
hidrlisis. Calefaccin transitoria no fue considerado en el anlisis. Despus del
tratamiento trmico, la reaccin se detuvo por enfriamiento de la mezcla en un
bao de hielo-agua seguido por la modificacin del pH a un rango entre 5,0 y
5,5 con grnulos de NaOH. Los slidos y lquidos fueron separados por
centrifugacin a 3900 xg durante 35 min a 10 C en una centrfuga Allegra X22R con un rotor SX4250 (Beckman Coulter Inc., Brea, Calif., EE.UU.). Despus,
los sobrenadantes se filtraron a travs de papel de filtro Whatman # 4
(Whatman Plc., Maidstone, Kent, Reino Unido), se analizaron para la
concentracin de azcares fermentables, y se utiliza como sustratos para la
fermentacin. Desde este punto en adelante, estos sustratos se denominarn
como caldo de harina de soja (SBMB) como se indica en la Tabla 1.

Cepas microbianas
Las cepas de S. cerevisiae NRRL Y-2233 y Z. mobilis subsp. mobilis NRRL B4286 se ofrece como polvos liofilizados de la coleccin de cultivos del
Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA), Servicio de
Investigacin Agrcola (Peoria, Ill., EE.UU.).
Anlisis azcar fermentable
Azcares fermentables en los hidrolizados fueron analizados con de alto
rendimiento hromatography Tamao exclusin y deteccin de ndice de
refraccin (HPSEC-RI). El cromatgrafo fue aWaters, (Milford, Mass., EE.UU.) con
una bomba de 5 15 HPLC, un inyector manual con un bucle de muestra de 50 l,
y un detector de ndice de refraccin 2410 fijado en 40 C. Columnas utilizadas
para la separacin de azcares eran un Pack OH HQ SB-804 Shodex (300 8
mm), seguido de Shodex OH Paquete HQ SB-802 (300 8 mm) (Showa Denko
America, Inc., Nueva York, NY, EE.UU.) conectado en serie. Las columnas fueron
precedidos por una manada Shodex OH SB-G (50 6 mm) columna de
seguridad. Columnas y columna de seguridad se mantuvieron a 55 C en un
calentador de columna. Una solucin de 0,1 M NaNO3 con 0,2% NaN3 funcionar
isocrticamente a un caudal de 0,4 ml / min fue utilizado como la fase mvil.
Los azcares se cuantificaron utilizando curvas de calibracin de 6 puntos con
fructosa y glucosa como estndares. Las clulas reactivacin y preparacin de
preinculo y inculo Tanto S. cerevisiae y Z. mobilis se reactivaron en 5 ml de
malta levadura (YM) caldo (Dickinson and Company, Sparks, Md., EE.UU.) y se
incubaron a 30 C durante 24 h en un agitador orbital (Thermo Scientific Max
Q 4450, Dubuque, Iowa, EE.UU.) fij en 150 rpm. El preinculo consista en 5 ml
de sterileYMbroth a 30 C, donde tanto S. cerevisiae y Z. mobilis se inocularon
por separado y se cultivaron durante la noche en el agitador orbital. Para cada
cepa respectiva, 0,2 ml del cultivo se sembr a cabo con un bucle sobre la
superficie de 2 platos de petri que contienen agar YM (20 g / L de glucosa, 3 g /
L de extracto de levadura, 5 g / L de peptona, y 3 g / L de extracto de malta) y
se cultivaron durante la noche a 30 C antes de aadir al inculo final. El
inculo se prepar aadiendo todas las colonias formadas en ambos platos a
80 ml de SBMB y permitiendo que las clulas se adaptan mediante la
incubacin durante la noche a 30 C en el agitador orbital.
Fermentacin
Las fermentaciones se llevaron a cabo a 30 C durante 36 h con un pH inicial
de 5 a 5,5, oxgeno disuelto (DO%) de menos de 1% despus de la
estabilizacin, y una concentracin de biomasa inicial entre 7 106 y 1 x 107
clulas / ml (Mullins y Nesmith 1987; Siqueira y otros 2008; Laopaiboon y otros
2009). El fermentador fue un sobremesa fermentador y biorreactor (New
Brunswick Scientific, Edison, NJ, EE.UU.) con sistemas de control de

temperatura, pH, DO%, agitacin, y el nivel de espuma de 1,3 LBioflo /

CellinGen 115. Durante la fermentacin, se tomaron muestras cada 4 h para
estimar los parmetros cinticos de fermentacin tasa mxima de crecimiento
especfico (max), produccin de biomasa a partir de azcar (Yx / s), y el
rendimiento de etanol a partir de azcar (Yp / s) -junto con productividad
volumtrica etanol, rp (g / l / h). La densidad celular (nr. De las clulas L /) se
determin con un hemocitmetro (Doble Neubauer Contando Cmara, 3110,
Hausser Cientfico, Horsham, Pa., EE.UU.) y un microscopio de contraste de
fase (Nikon Eclipse E400, Nikon Corporation, Tokio, Japn) . La densidad celular
se correlaciona con una curva de calibracin de peso seco celular obtenido
mediante el secado de soluciones acuosas de concentraciones conocidas de
clulas a 80 C durante 20 a 24 h (Alfenore y otros 2002; Bhner y Agblevor
2004). Todos los parmetros cinticos se calcularon utilizando las siguientes
ecuaciones:
Cintica de crecimiento y desarrollo de modelos para la fermentacin de etanol
Los parmetros cinticos de la produccin de biomasa se determinaron con el
modelo logstico (ecuacin (6)) (Wang y otros, 2004).
(6)
donde dx / dt es la tasa de biomasa durante el tiempo de fermentacin (g
clula / h), max es la tasa de crecimiento especfica mxima (h-1), x es la
concentracin de biomasa (g / L), y xmax es el mximo concentracin de
biomasa (g / L).
Teniendo en cuenta las siguientes condiciones de contorno: t = 0, x = xo, S =
Por lo tanto, y P = 0, la ecuacin (6) se integr y la ecuacin (7) se obtuvo
como un resultado, que se refiere produccin de biomasa (X) y tiempo de
fermentacin (t) y se utiliz para ajustar los datos experimentales. (7)
Para el clculo de los parmetros cinticos, solamente glucosa y fructosa
fueron considerados como limitantes del crecimiento-sustratos debido a que
estos azcares se consumen en las cantidades ms altas y ms consistentes
por los microorganismos de acuerdo con el anlisis HPLC.
Diseo experimental
Para la fermentacin, el diseo experimental fue un diseo de bloques
completos al azar con el tipo de microorganismo y el caldo como factores
(Tabla 1). En cada nivel, los experimentos se llevaron a cabo dos veces.
El anlisis estadstico
Los datos fueron analizados con el software SAS versin 9.2 (SAS Inst. Inc.,
Cary, NC, EE.UU.) y los parmetros cinticos max, xmax, y xo determinados.

Anlisis de covarianza (ANCOVA) se utiliz para ajustar los datos al modelo

logstico usando el mtodo de regresin no lineal de Gauss-Newton y
comparaciones de cada coeficiente de regresin a travs de los tratamientos.
Para el mnimo concentraciones de inhibidor y los parmetros cinticos, los
datos se analizaron con JMPR versin 9.0.0 (SAS Inst. Inc.). Para analizar los
parmetros cinticos (Yp / s, Yx / s, ms, y QP), un anlisis de la varianza
(ANOVA) fue utilizado y las diferencias en la media de los parmetros cinticos
se analizaron mediante la prueba de Tukey-Kramer ( = 0,05 ).
Resultados y discusin
La fermentacin del etanol con S. cerevisiae y Z. mobilis S. cerevisiae exhibi
respuestas ptimas para la produccin de etanol, el consumo de azcares, y el
crecimiento celular en todos los caldos de preformas utilizadas en este estudio
(Figura 1). Sin embargo, en la mayora de caldos de fermentacin, Z. mobilis no
era tan eficiente (Figura 2). Esta bacteria no exhibi crecimiento con la SBMB3
hidrolizado (135 C, 2% de H2SO4, 45 min), pero con la SBMB1 (135 C, 0,5%
de H2SO4, 45 min) muestra su mxima produccin de etanol. S. cerevisiae, por
otra parte, demostr consumo rpido de azcar, probablemente porque es un
microorganismo robusto que no fue afectada crticamente por los inhibidores
presentes en la mayor parte de la SBMB hidrolizado (Luj'an-Rhenals y otros
2014). Zymomonas mobilis se vio afectada por los compuestos inhibidores de
la SBMB ((Luj'an-Rhenals y otros 2014) y tambin por la presencia de sales
procedentes del hidrolizado, tales como acetato de sodio (CH3COONa) que es
la sal de sodio del cido actico formado durante el sulfato de reaccin y de
sodio (Na2SO4) formado durante la neutralizacin del cido sulfrico con
hidrxido de sodio. (Yang y otros 2010) demostr que la combinacin de iones
Na + y elevadas de acetato condujo a un efecto inhibidor sinrgico sobre la
cepa ZM4.
Cintica de consumo de sustrato durante la fermentacin
S. cerevisiae exhibi su ms rpido consumo de azcar de 15,6 g / L durante
las primeras 12 h de fermentacin con la SBMB4 (120 C, 1,25% de H2SO4, 30
min) y 15,1 g / L durante la primera 12 h de fermentacin con el SBMB1 (135
C, 0,5% de H2SO4, 45 min) (Figura 1e). Por otro lado, los caldos de preformas
de los tratamientos de hidrlisis ms graves parecan dar lugar a una baja tasa
de uso de azcar a partir del caldo de fermentacin por S. cerevisiae (Figura
1e). Esta baja tasa de consumo de azcar se produjo debido a compuestos
txicos formados durante el proceso de hidrlisis que reduce el crecimiento de
la levadura (Luj'an-Rhenals y otros 2014). Z. mobilis tambin expres su ms
rpida absorcin de azcar de 15,0 g / L por 16 h de fermentacin con la
SBMB1 (135 C, 0,5% de H2SO4, 45 min) (Figura 2b). Similar a S. cerevisiae, Z.
mobilis tena bajas tasas de consumo de azcar aparente durante el
crecimiento en los caldos (Figura 2C y 2D) como resultado de los

pretratamientos ms severas, en particular SBMB2 (135 C, 1,25% de H2SO4,

45 min), que es probablemente debido al efecto inhibidor del cido actico y
sales como se discuti previamente.
En general, el coeficiente de mantenimiento ms (g de azcar consumidos / g de
clulas h) para ambos microorganismos no di diferencias estadsticamente
significativas a excepcin de S. cerevisiae con SBMB2 y SBMB3, que dio valores
ms altos (2,7 y 2,8 g de azcar / g de clulas h, respectivamente ) que los
otros coeficientes (Tabla 2). Sin embargo, numricamente, todos los
coeficientes para ms de Z. mobilis eran ms bajos que los coeficientes EM
calculado para S. cerevisiae que significa que las bacterias aparentemente
requiere menos sustrato de carbono por clula de la levadura. Este resultado
tambin se ha informado anteriormente por (Dien y otros, 2003). Por lo tanto,
Z. mobilis utiliza menos de sustrato por gramo de clulas producidas de S.
cerevisiae y tiene ms de carbono disponible para la produccin de etanol
(Dien y otros, 2003).
Cintica de la produccin de etanol
S. cerevisiae exhibi su produccin mxima de etanol de 8 g / L durante la
primera 8 h de fermentacin de la SBMB1 (135 C, 0,5% de H2SO4, 45 min) y
SBMB4 (120 C, 1,25% de H2SO4, 30 min). En contraste, la produccin de
etanol ms baja (5,67 g / L de etanol) se produjo con la SBMB3 (135 C, 2% de
H2SO4, 45 min) despus de 28 h de fermentacin, donde, posiblemente,
algunos compuestos inhibidores de (sales de acetato, a partir de cido actico,
y otras sustancias txicas no identificados) podran haber reducido la
productividad de etanol. La produccin de etanol por Z. mobilis alcanz un
mximo de 9,2 g / l de etanol despus de 20 h de fermentacin con la SBMB1
(135 C, 0,5% de H2SO4, 45 min). El SBMB0 (135 C, 0% de H2SO4, 45 min)
permite una tasa mxima de etanol de 3,9 g / L de etanol despus de 20 h de
fermentacin. Sin embargo, los niveles ms bajos de produccin de etanol-1 g /
L a 20 h-se han cumplido con la SBMB2 (135 C, 1,25% de H2SO4, 45 min) y
SBMB4 (120 C, 1,25% de H2SO4, 30 min), que es probablemente causado por
los inhibidores (acetato a partir de cido actico, otras sales, y compuestos
desconocidos). Ha habido informes anteriores de que la produccin de etanol
con Z. mobilis y su crecimiento se puede reducir sustancialmente incluso con
bajas concentraciones (2-8 g / L) de cido actico (Wang 2008).
El rendimiento de etanol (Yp / s, g etanol / g de azcares) en la Tabla 2 no
mostr diferencias estadsticas significativas entre los 2 y los microorganismos
respectivos caldos de preformas utilizadas. Sin embargo, numricamente
ambos microorganismos mostraron rendimientos de etanol similares a los
valores tericos, que es 100% para 0,51 g de etanol / g de azcares (Doran
1997). Las fermentaciones en el SBM0 y SBMB1 dieron a los ms altos
rendimientos de etanol, 96% del rendimiento terico para ambos

microorganismos, que son comparables o incluso superiores a los valores

reportados en la investigacin anterior (Siqueira y otros 2008; Zhang y Feng
2010; Da Cunha-Pereira y otros 2011; Letti y otros 2012; Romao y otros 2012).
Adems, la productividad volumtrica ms alta etanol (rp) para S. cerevisiae se
logr con la SBM1 (1,01 g de etanol / L h) y SBMB4 (1,00 g de etanol / L h), sin
diferencia significativa entre el 2, pero difieren con respecto a los otros caldos
utilizados en esta investigacin (Tabla 2). Estos valores de S. cerevisiae son
comparables a, y algunos ms altos que los reportados por otros
investigadores (Da Cunha-Pereira y otros 2011). Sin embargo, Z. mobilis
alcanz una productividad volumtrica mxima etanol (rp) de 0,61 g de
etanol / Lh slo con el SBM1, que es inferior a los valores, 1.4 a 1.8 g de
etanol / Lhwith Z. mobilis durante la produccin de etanol a partir de melaza de
preformas (Letti y otros 2012). Adems, es menor que 2,8 g de etanol / Lh
obtuvo para la produccin de etanol con Z. mobilis de patata dulce (Zhang y
Feng 2010); sin embargo, es mayor que 0,59 g / Lh usando material
lignocelulsico como sustrato (Mohagheghi y otros 2002). Estos resultados
demuestran que la aplicacin de Z. mobilis para la fermentacin de etanol no
es factible cuando el sustrato es caldo de SBM obtenida bajo las condiciones
aplicadas en estos experimentos. Esto es probablemente debido a la alta
concentracin de cido actico, sales y otros compuestos desconocidos txicos
formados durante la hidrlisis cida en los caldos obtenidos bajo tratamientos
severos.
Cintica de crecimiento de la biomasa y el desarrollo de modelos para la
fermentacin
Los datos reportados en la Figura 1a indican que S. cerevisiae cedi su
concentracin mxima de biomasa (2,3 g / L) despus de 12 h de fermentacin
anaerbica cuando se expone a la SBM0 (135 C, 0% de H2SO4, 45 min),
seguido por tratamiento enzimtico con celulasa . Del mismo modo, tambin se
lleg a esta concentracin mxima de biomasa (2,3 g / L) con SBMB4 (120 C,
1,25% de H2SO4, 30 min) a 24 h.
Sin embargo, SBMB3 (135 C, 2% de H2SO4, 45 min) mostr una importante
inhibicin de crecimiento de la levadura ya que la biomasa dio no ms de 0,5
g / L despus de 32 h de fermentacin. En general, la produccin de biomasa
de S. cerevisiae parece estar asociado directamente con la produccin de
etanol.
Z. mobilis exhibi su ms alta concentracin de biomasa, 3,9 g / L, despus de
20 h de fermentacin (Figura 7.2a) con el SBMB0 (135 C, 0%, H2SO4, 45
min), seguido por tratamiento enzimtico con celulasa.
Del mismo modo, la biomasa producida (3,3 g / L), cuando la fermentacin del
SBMB1 (135 C, 0,5% de H2SO4, 45 min) estaba muy cerca de la primera, pero

requiere 24 horas para llegar a este nivel. En contraste, SBM2 (135 C, 2% de

H2SO4, 45 min) mostr los efectos inhibitorios sobre el crecimiento primario de
Z. mobilis debido a mayores concentraciones de sales, cido actico y otros
inhibidores en el caldo que restringe su crecimiento (Doran 1997; Yang y otros
2010). En general, Z. mobilis tambin mostr la produccin de etanol de
crecimiento asociado con la excepcin de los caldos donde las bacterias se
inhibieron considerablemente.
Los datos de las respuestas de crecimiento de clulas ajustaron a un modelo
logstico durante la primera 24 h de fermentacin se muestran en la Tabla 3.
Las tasas de crecimiento especficas mximas (max) muestra que en el SBM0
y SBMB4, max para S. cerevisiae (0,63 y 0,60 h- 1, respectivamente) fueron
mayores pero no significativamente diferente de max para Z. mobilis, 0,55 h1, en el T3C0t3 sustrato. Wang y otros (2004), tambin utilizando el modelo
logstico, reportaron una max de 0,1 h-1 para la fermentacin etanlica de
jugo de manzana con S. cerevisiae (Huang andWang 2010) obtuvo una max
de 5,2 h-1 utilizando Saccharomyces diastaticus con mixta azcares como
sustrato. Mohagheghi y otros (2002) informaron de Z. mobilis un max de 0,34
h-1 para la fermentacin etanlica de biomasa lignocelulsica hidrolizada. En
general, max para S. cerevisiae fue mayor para los sustratos obtenidos con
tratamientos previos de menor gravedad; Z. mobilis max no mostraron el
mismo patrn, debido al efecto de los inhibidores presentes en algunos de los
caldos de preformas.
La concentracin inicial de biomasa (x0) no fue significativamente diferente
entre todos los caldos para ambos microorganismos, lo cual es una indicacin
de que el inculo se prepar de forma homognea y se introduce en cada caldo
de SBM. El otro parmetro cintica derivada ajustando el modelo logstico a las
primera 24 h de fermentacin era la concentracin mxima de biomasa
(xmax). Para S. cerevisiae, xmax fue de 2,28 y 2,23 g / L para SBMB0 y SBMB4,
respectivamente, mientras que el xmax mximo para Z. mobilis era 3,79 g / L y
5,1 g / L para la SBMB0 y SBMB1, respectivamente. El rendimiento de biomasa
a partir de sustrato (Yx / s) enumerados en la Tabla 2 fue significativamente
mayor (P = 0,05) para S. cerevisiae (0,1 g de clulas / g de azcar consumido)
de Z. mobilis (0,08 g de clulas / g de azcar consumida) cuando se fermenta
el SBMB1. Los valores ms altos con S. cerevisiae que mobilis Z. Tambin se
han reportado por otros investigadores (Dien y otros 2003, Aitabdelkader y
Baratti 1993). Esta es una funcin de la mejor resistencia de la levadura a los
inhibidores presentes en estos sustratos (Weber y otros 2010). Sin embargo,
con SBM2 el efecto era el contrario, el valor de Z. mobilis fue de 0,15 g de
clulas / g de azcar y para S. cerevisiae fue de 0,04 g de clulas / g de azcar.
No obstante, la mayora de los valores de S. cerevisiae fueron ms altos que los
informes anteriores (Siqueira y otros 2008) para la produccin de bioetanol a
partir de melazas de soja y similares a los valores (0,14 g / g) inform en otro
trabajo (Ahmad y otros 2011) .

Conclusiones
S. cerevisiae mostraba buenas cualidades en la produccin de etanol, el
consumo de azcares, y el crecimiento celular para todos los caldos de la
harina de soja acidhydrolyzed probados sin ningn tipo de nutrientes
adicionales, mientras Z. mobilis tena un rendimiento inferior para la mayora
de caldos. Se alcanz la mayor produccin de etanol de S. cerevisiae, 8 g de
etanol / L, (4 g de etanol / 100 g SBM fresco) durante la primera 8 h de
fermentacin con el caldo obtenido a 135 C, 0,5% de H2SO4, 45 min y el de
120 C, 1,25% de H2SO4, y 30 min. Sin embargo, Z. mobilis produjo la mxima
produccin de etanol, 9,2 g / L de etanol, (4,6 g de etanol / 100 g SBM fresco)
slo despus de la primera 20 h con el hidrolizado obtenido a 135 C, 0,5% de
H2SO4, 45 min.