Laporan Praktikum

Hari/Tanggal

: Rabu/3 Juni 2014

Teknologi Fermentasi

PJ Dosen

: C.C Nurwitri, DAA

Asisten

: Novini Nur., A.md

PENGAWETAN DAN UJI VIABILITAS KULTUR KHAMIR

Kelompok 2/B-P1
Ayu Melinda

J3E112045

Ega Nindya P

J3E212129

Kiki Radiansyah J3E112063

Nety Agustin

J3E112022

Yen Aprilia

J3E112004

SUPERVISOR JAMINAN MUTU PANGAN

PROGRAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2014

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Khamir adalah mikroorganisme eukariot yang diklasifikasikan dalam
kingdom Fungi, dengan 1.500 species yang telah dapat dideskripsikan,
(diperkirakan 1% dari seluruh spesies fungi). Khamir merupakan mikroorganisme
uniseluler, meskipun beberapa spesies dapat menjadi multiseluler melalui
pembentukan benang dari sel-sel budding tersambung yang dikenal sebagai hifa
semu (pseudohyphae), seperti yang terlihat pada sebagian besar kapang. Ukuran
kapang bervariasi tergantung spesies, umumnya memiliki diameter 34 m,
namun beberapa jenis khamir dapat mencapai ukuran lebih 40 m. Sebagian besar
khamir bereproduksi secara aseksual dengan mitosis, dan dengan pembelahan sel
asimetris yang disebut budding.
Kisaran suhu untuk pertumbuhan kebanyakan khamir pada umumnya
hampir sama dengan kapang yaitu dengan suhu optimum 25-30C dan suhu
maksimum 35-47C. Beberapa khamir dapat tumbuh pada suhu 0C atau kurang.
Pertumbuhannya yang lambat dan kesanggupannya untuk bersaing kurang,
khamir sering tumbuh pada lingkungan yang kurang baik untuk pertumbuhan
bakteri, lingkungan tersebut antara lain pH rendah, kelembaban rendah, kadar gula
dan garam yang tinggi, suhu penyimpanan rendah, radiasi pada makanan dan
adanya antibiotika. Secara umum gula merupakan sumber energi yang paling
baik, hanya untuk jenis khamir oksidatif dapat menggunakan asam-asam organik
dan alkohol. Khamir mampu menggunakan berbagai macam sumber nitrogen.
Sebagai sumber nitrogen untuk sintesis protein, kebanyakan khamir dapat
menggunakan ion nitrat dan nitrit (Buckle, 2007).
Kultur khamir yang digunakan dalam proses fermentasi memegang
peranan penting dalam keberhasilan proses fermentasi ataupun produksi metabolit
mikroba. Adanya penyimpangan kultur seringkali berakibat pada kegagalan proses
fermentasinya. Oleh karena itu harus dilakukan penanganan kultur secara tepat
agar diperoleh hasil fermentasi sesuai dengan standar yang diinginkan. Salah satu

penanganan kultur yaitu dengan melakukan teknik pengawetan atau penyimpanan

kultur.
Penentuan teknik penyimpanan atau pengawetan kultur memerlukan
penelitian yang rumit, jangka waktu lama, dan pemantauan, serta dana yang besar.
Hal ini berkaitan dengan tujuan utama preservasi, yaitu (1) mereduksi atau
mengurangi laju metabolisme dari mikroorganisme hingga sekecil mungkin
dengan tetap mempertahankan viabilitas (daya hidupnya) dan (2) memelihara
sebaik mungkin biakan, sehingga diperoleh angka perolehan (recovery) dan
kehidupan (survival) yang tinggi dengan perubahan ciri-ciri yang minimum.
1.2 Tujuan
Tujuan dari praktikum ini yaitu untuk mengetahui viabilitas kultur khamir
melalui penyimpanan pendinginan dan pembekuan. Selain itu mengetahui
aktivitas khamir pada media PDB dan SB dengan perlakuan alginat, gliserol dan
imobilisasi manik-manik.

BAB II
METODOLOGI
2.1 Alat dan Bahan
2.1.1 Alat

Tabung reaksi berulir 10 ml

Manik-manik

Tabung reaksi 9 ml

Erlenmeyer 250 ml

Tabung Durham

Syringe

Rak tabung

Pipet

2.1.2 Bahan

CaCl2

Gliserol

NaCl

Air Steril

Na-Alginat

Media SB (Sukrose Broth)

Larutan fisiologi

Media PDB (Potato

Dextrose Broth)

2.2 Prosedur Kerja

2.2.1 Penyimpanan Kultur dalam Gliserol

@ 2ml ke dalam Gliserol

Suspensi kultur

Dikocok

Simpan refri 1-2 bulan

Simpan freezer 1-2 bulan

2-3 ml ke dalam Gliserol steril

Suspensi kultur
Uji viabilitas dengan Broth

2.2.2

Dikocok
Penyimpanan Secara Imobilisasi Manik-Manik

@2ml Dimasukan manik-mani steril

Diamankan terendam selama 1 jam

Lebihnya dibuang
Sisa kultur dipipet aseptis

Simpan refri 1-2Simpan

bulan freezer 1-2 bulan

Uji viabilitas dengan Broth

2- 2,5 ml ke dalam Na-Alginat

Suspensi kultur

7,5 ml Na-Alginat (6ml)

Masukan kedalam syringe

Diteteskan
pada larutan Cacl2 steril (terbentuk butiran-butiran alginat)

2.2.3 Penyimpanan Secara Imobilisasi Na-Alginat

Dibiarkan selama 1 jam

Sisa Cacl2 dibuang

Butiran dipindahkan ke-2 tabung

Simpan refri 1-2Simpan

bulan freezer 1-2 bulan

Uji viabilitas dengan Broth

BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil

Tabel 1. Pengamatan Uji Viabilitas Khamir Hari ke-2

Alginat

Gliserol

Manik-manik

Tabel 2. Pengamatan Uji Viabilitas Khamir Hari ke-7

Manik-manik

PD

Alginat

Gliserol

Keterangan :

: tidak terdapat gelembung

: agak terdapat gelembung

++

: sedikit terdapat gelembung

+++

: banyak terdapat gelembung

++++ : banyak sekali terdapat gelembung

+++++ : amat sangat banyak terdapat gelembung

SB

PDB

:tidak keruh

: agak keruh

++

: sedikit keruh

+++

:keruh

++++ : sangat keruh

+++++ : amat sangat keruh

3.2 Pembahasan

3.2.1 Penyimpanan Kultur Pada Gliserol

Pengawetan kultur merupakan suatu cara untuk mempertahankan

kultur mikroba atau kultur murni dari suatu mikroba dalam waktu tertentu. Lama
mikroba bertahan tergantung oleh jenis media dan teknik pengawetan yang
digunakan. Pengawetan mikroba dibagi menjadi dua yaitu pengawetan jangka
panjang dan pengawetan jangka pendek. Pengawetan jangka pendek biasanya

menggunakan media agar yaitu agar miring, agar cawan, agar tusuk atau dalam
media semi padat (tabung reaksi), pengawetan ini dilakukan dengan pendinginan.
Penyimpanan jangka pendek mikroba dilakukan dengan memindahkan secara
berkala jangka pendek misalnya sebulan sekali dari media lama ke media baru.
Teknik ini memerlukan waktu dan tenaga yang banyak (Machmud, 2001).
Sedangkan pengawetan jangka apanjang salh satu cara yang dapat digunkan
adalah dengan penyimpanan pada manik-manik.

Salah satu pengawetan kultur dapat dilakukan denggan cara

penyimpanan pada media gliserol. Bahan baku untuk memproduksi Gliserol

adalah CPO (Crude Palm Oil) dan air (Anonim, 2010). Gliserol pada umumnya
digunakan sebagai media dalam pengawetan atau penyimpanan jangka pendek,
jangka panjang atau sekedar sebagai media untuk memindahkan mikroorganisme.
Sebagai contoh dalam metode pembekuan menggunakan nitrogen, media yang
digunakan adalah 10 % (vol/vol) gliserol atau 5% (vol/vol) DMSO.

Penyimpanan kultur pada gliserol dilakukan dengan cara

pemindahan 2 ml substansi kultur (ragi) kedalam dua tabug reaksi
yang didalamya telah berisi gliserol. 2 tabung reaksi yang telah
berisi

gliserol

dan

substansi

kultur

tersebut

mengalami

penyimpanan yang berbeda. Satu tabung disimpan pada suhu refri

dan satu tabung lagi disimpan pada suhu freezer. Perbedaan
penyimpanan tersebut untuk mengetahui perbedaan terhdap hasil
akhir yang diberikan, setelah substansi kultur mengalami
penyimpanan selama 1-2 bulan.

Gliserol dapat digunakan sebagai media karena gliserol

dapat melindungi aktivitas antimikroba dengan cara meningkatkan
stabilitas struktur protein asli dari mikroba sehingga dapat
mencegah protein dari proses termal dan agregasi. Selain itu
gliserol dapat meningkatkan energi bebas dari kompleks yang
diaktifkan dan mengeser kesetimbangan energi tersebut. Gliserol
ini dapat menyerap air pada permukaan protein yang dapat
mengakibatkan hidrasi yang dapat melindungi protein dari

kerusakan. Oleh karena itu giserol dapat memperpanjang

penyimpanan suatu mikroorganisme.

Setelah mengalami penyimpanan selama 2 bulan substansi kultur

tersebut dipindahkan kedalam media PDB dan SB yang berisi tabung durham.
Masing-masing perlakuan penyimpanan dipindahkan sebanyak satu tabung reaksi
reaksi pada media PDB (potato dextrose broth) dan SB (sucrose broth).

Berdasarkan hasil pengamatan kultur yang yang disimpan pada

media gliserol dengan suhu penyimpanan pada freezer dan refri yang dipindahkan
dalam media SB, hasil positif ditunjukkan pada tabung reaksi yang disimpan pada
freezer. Berdasarkan hasil pengamatan pada hari ketujuh substansi kultur yang
dimasukkan ke dalam media SB (perlakuan peyimpanan pada freezer)
menunjukkan hasil positif semua, hasil positif tersebut ditandai dengan adanya
gelembung. Sedangkan berdasarkan hasil pengamatan pada hari ketujuh substansi
kultur yang dimasukkan kedalam media SB (perlakuan penyimpanan pada refri)
menunjukkan hasil negatif pada setiap kelompok, hasil negatif tersebut dapat
dilihat karena pada tabung reaksi media SB tidak terjadi pembentukan gelembung
gas.

Berdasarkan hasil pengamatan pada hari ketujuh substansi kultur

yang dimasukkan kedalam media PDB (perlakuan peyimpanan pada freezer)

menunjukkan hasil positif semua, hasil positif tersebut ditandai dengan perubahan
media PDB menjadi keruh. Sedangkan berdasarkan hasil pengamatan pada hari
ketujuh substansi kultur yang dimasukkan ke dalam media PDB (perlakuan
penyimpanan pada refri) menunjukkan hasil yang berbeda setiap kelompoknya.
Kelompok 1 dan 2 mndapatkan hasil positif, sedangkan pada kelompok 3,4,5, dan
6 mendapatkan hasil yang negatif. Hasil negatif ditandai dengan tidak berubahnya
media PDB menjadi keruh.

Hal yang harus diperhatikan dalam penyimpanan substansi kultur

adalah tiap isolat biakan paling sedikit dibuat lima duplikat, tetapi semakin
banyak semakin baik, sehingga pengujian viabilitas dapat dilakukan lebih leluasa.
Pemberian label yang jelas, tidak mudah hilang, untuk memudahkan pelacakan
data. Pengecekan rutin tidak hanya untuk menguji viabilitas, tetapi juga stabilitas
genetik, terutama virulensinya. Faktor yang dapat mempengaruhi aktivitas kultur

saat penyimpanan adalah Pengaruh temperature ruangan, pengaruh temperatur

pembekuan, pengaruh pH, pengaruh kadar air dan aw (water activity) dan
pengaruh kadar garam

3.2.2 Penyimpanan Secara Imobilisasi Manik-Manik

Pengawetan kultur juga dapat dilkukan dengan cara penyimpanan

pada media manik-manik. Manik-manik pada umumnya digunakan sebagai media

dalam pengawetan atau penyimpanan jangka pendek. Menurut Leben dan
Sleesman (1982) Penyimpanan kultur secara imobilisasi manik-manik porselin
dapat diganti dengan butiran gel silika.

Pada penyimpanan kultur manik manik dilakukan dengan cara

menambahkan 2 ml substansi kultur (ragi) kedalam dua tabung reaksi yang di

dalamya telah berisi gliserol, kemudian dikocok. Dua tabung reaksi yang telah
berisi manik-manik, gliserol dan substansi kultur tersebut mengalami perlakuan
penyimpanan yang berbeda. Satu tabung disimpan pada suhu refri dan satu tabung
lagi disimpan pada suhu freezer. Perbedaan penyimpanan tersebut untuk
mengetahui perbedaan terhdap hasil akhir yang diberikan, setelah substansi kultur
mengalami pnyimpanan selama 1-2 bulan.

Setelah manik-manik mengalami penyimpanan selama 2 bulan

pada suhu yang berbeda yaitu

refri dan freezer, setelah 2 bulan kemudian

dipindahkan kedalam media PDB dan SB yang berisi tabung durham.

Dimasukkan sebanyak 5 manik-manik pada setiap media. Lalu disimpan di suhu
ruang.

Berdasarkan hasil pengamatan kultur yang yang disimpan pada

media manik-manik dengan suhu penyimpanan yaitu freezer dan refri, pada media
SB hari pertama tidak ada pertumbuhan. Sedangkan pengamatan pada media SB
(perlakuan penyimpanan pada freezer) menunjukkan hasil yang berbeda. Pada
kelompok 1, 2 , 4, 5, dan 6 mendapatkan hasil yang negatif sedangkan kelompok
3 mendapatkan hasil yang positif. Berdasarkan hasil pengamatan pada hari
pertama substansi kultur yang dimasukkan kedalam media PDB (perlakuan
peyimpanan pada freezer) ternyata substansi kultur menunjukkan hasil positif
semua, hasil positif tersebut ditandai dengan perubahan media PDB menjadi keruh

dan terdapat endapan. Sama seperti hasil pengamatan pada hari ketujuh substansi
kultur yang dimasukkan kedalam media PDB (perlakuan peyimpanan pada refri)
menunjukkan hasil yang positif semua dari setiap kelompok.

3.2.3 Penyimpanan Secara Imobilisasi Na-Alginat

Alginat membentuk garam yang larut dalam air dengan kation

monovalen, serta amin dengan berat molekul rendah, dan ion magnesium. Oleh
karena itu alginat merupakan molekul linear dengan berat molekul tinggi, maka
mudah sekali menyerap air. Hal tersebut yang menyebabkan alginat baik sekali
fungsinya sebagai bahan penyalut. Alginat melindungi imobilisasi sel kultur lebih
baik dengan meningkatnya ketahanan bakteri (Indriati, 2009).

Penyimpanan kultur dengan Na-alginat diawali dengan

menambahkan supensi kultur ke dalam tabung yang berisi Naalginat steril, kemudian suspensi dihomogenkan dan dipindahkan
secara aseptik ke dalam syringe. Kultur dalam syiringe tersebut
secara perlahan diteteskan ke dalam larutan CaCl2 steril hingga
terbentuk butiran-butiran alginat, lalu dibiarkan selama 1 jam. Hal
ini berfungsi untuk mengeraskan butiran alginat yang terdapat
kultur menjadi lebih kompak dan stabil (Indriati, 2009). Larutan
CaCl2 tersebut dibuang dan butiran alginat dicuci beberapa kali
dengan larutan fisiologis steril. Butiran alginat dipindahkan ke
dalam 2 tabung reaksi kosong steril, lalu direndam dengan larutan
fisiologis. Satu tabung tersebut disimpan di refrigerator dan satu
tabung lagi disimpan di freezer

selama 1-2 bulan. Setelah

mencapai waktu 1-2 bulan kultur dilakukan uji viabilitas dengan

menumbuhkan pada media cair PDB (potato dextrose broth) dan
SB (sucrose broth). Dalam tabung media SB terdapat tabung
durham yang bertujuan untuk mengetahui terbentuknya gelembung
menandakan

bahwa

terdapat

aktivitas

khamir.

Kemudian

diinkubasi pada suhu kamar selama 1-2 hari.

Pertumbuhan mikroba ditandai dengan adanya kekeruhan

atau endapan pada medium cair tersebut. Penggunaan medium

dalam bentuk cair bertujuan untuk memudahkan dalam inokulasi

kultur. Media PDB dan SB digunakan karena mengandung nutrisi
yang mendukung pertumbuhan kultur khamir. salah sarunya
adanya sukrosa pada media SB.

Berdasarkan hasil pengamatan pada tabel 1, uji viabilitas

khamir pada hari ke 2 menunjukkan bahwa kultur yang disimpan di
freezer dalam media SB tidak terbentuk gelembung. Hal ini
menandakan bahwa belum terdapat aktivitas kultur khamir pada
media tersebut. Sedangkan kultur yang disimpan di refrigerator
hanya kelompok 6 (ulangan 6) yang menunjukkan sedikit
gelembung. Hal ini dikarenakan kondisi lingkungan refrigerator
memiliki suhu yang lebih tinggi dibanding di freezer, sehingga
aktivitas kultur tidak terhambat, meskupun aktivitas yang
ditunjukkan lemah. Pada hari ke 2, kultur dalam media PDB yang
disimpan di freezer menunjukkan bahwa terbentuk kekeruhan baik
itu yang disimpan di refrigerator maupun di freezer. Akan tetapi
kekeruhan yang terbentuk pada refrigerator lebih banyak
dibandingkan dengan di freezer. Hal ini dikarenakan suhu freezer
lebih rendah dibanding suhu di refrigerator sehingga aktivitasnya
menjadi lebih lambat.

Uji viabilitas khamir juga dilakukan pada hari ke 7, dari hasil tabel

menunjukkan bahwa kultur yang disimpan di freezer dalam media SB ulangan

atau kelompok 2 (+++), 3 (+++++), 5 (+++), dan 6 (+) menunjukkan hasil positif
terbentuk gelembung. Sedangkan kultur yang disimpan di refrigerator tidak
terbentuk adanya gelembung. Terbentuknya gelembung tidak dialami pada semua
ulangan. Hal ini dapat dikarenakan pengaruh dari lingkungan yang dapat
mengakibatkan aktivitas kultur menjadi terhambat bahkan dapat mengakibatkan
kultur mati. Kultur yang disimpan dalam media PDB menunjukkan hasil positif
(terbentuk kekerukan) baik itu yang disimpan di freezer maupun di refrigerator.
Akan tetapi, terlihat adanya penurunan dan peningkatan aktivitas pada
penyimpanan di refrigerator dan di freezer selama 7 hari.

Pengaruh hasil yang tidak sesuai berupa tidak adanya aktivitas

ataupun adanya aktivitas yang lemah pada kultur khamir. Hal ini dipengaruhi oleh
beberapa faktor yaitu suhu, pH, medium dan adanya kontaminasi yang terjadi
ketika melakukan pengawetan kultur sehingga aktivitasnya menjadi terhambat.
Selain itu penyimpanan dengan metode ini merupakan penyimpanan jangka
pendek kultur sehingga harus dilakukan dengan memindahkan secara berkala
jangka pendek misalnya sebulan sekali dari media lama ke media baru. Teknik ini
memerlukan waktu dan tenaga yang banyak. Beberapa teknik penyimpanan
sederhana yang efektif untuk penyimpanan isolat jangka pendek atau menengah
dan biasanya tidak sesuai untuk penyimpanan jangka panjang (Sugiawan, 2000).
Beberapa persyaratan yang harus dipenuhi agar kultur bermutu bagus yaitu kultur
harus seragam, tidak terkontaminasi, jumlah dan viabilitas sel relatif tinggi.

Sejumlah faktor lain yang mempengaruhi keberhasilan pengawetan

kultur dengan metode pendinginan dan pembekuan adalah kecepatan pembekuan,

suhu akhir pembekuan, dan tipe serta keadaan fisiologis bahan yang akan
disimpan. Jika pembekuan terlalu lambat maka sel terlalu terdehidrasi sehingga
konsentrasi zat elektrolit dalam sel menjadi tinggi. Jika pembekuan terlalu cepat
maka sel kurang mengalami dehidrasi sehingga terjadi formasi es intraseluler
yang bersifat letal.

BAB IV
PENUTUP

4.1 Kesimpulan
Penyimpanan kultur dalam gliserol (media SB) yang disimpan di

refrigerator selama 7 hari menunjukkan aktivitas kultur tinggi. Tetapi tidak dengan
kultur di refrigerator. Penyimpanan dalam media PDB di freezer terbentuk
kekeruhan terbanyak dibanding refrigerator. Begitu pula dengan penyimpanan
dalam alginat (media SB) yang disimpan di refrigerator terdapat aktivitas yang
tinggi. Kultur yang disimpan di refrigerator tidak menunjukkan aktivitas. Kultur
dalam media PDB dengan perlakuan alginat yang disimpan di freezer
menunjukkan hasil positif paling banyak dibanding disimpan di refrigerator.

Penyimpanan kultur (manik-manik) media SB yang disimpan di

refrigerator terdapat aktivitas kultur hanya kelompok 3. Sedangkan kultur yang

disimpan di refrigerator tidak terdapat aktivitas kultur. Media PDB di freezer
maupun refrigerator terbentuk kekeruhan paling banyak dibanding perlakuan
gliserol dan alginat. Dari hasil pengamatan imobilisasi gliserol, manik-manik, dan
alginat. Perlakuan dengan manik-manik lebih baik viabilitasnya, karena manikmanik mampu melindungi kultur yang terdapat pada rongga manik-manik.

Faktor yang mempengaruhi pengawetan kultur dengan metode

pendinginan dan pembekuan adalah kecepatan pembekuan, suhu akhir

pembekuan, dan tipe serta keadaan fisiologis bahan yang akan disimpan. Jika
pembekuan terlalu lambat maka sel kultur terlalu terdehidrasi sehingga
konsentrasi zat elektrolit dalam sel tinggi. Jika pembekuan terlalu cepat maka sel
kurang mengalami dehidrasi sehingga terjadi formasi es intraseluler yang bersifat
letal. Hal yang harus diperhatikan agar kultur bermutu bagus yaitu kultur harus
seragam, tidak terkontaminasi, jumlah dan viabilitas sel relatif tinggi.

4.2 Saran
Sebaiknya dalam melakukan pengawetan kultur, analis harus

menguji secara aseptis sehingga tidak menghambat pertumbuhan kultur. Selain itu

seharusnya dilakukan uji secara kuantitatif untuk mengetahui seberapa banyak

kultur yang aktif pada medium.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2010. Pabrik Gliserol dari CPO dengan Proses Continuous Fat
Splitting. Tugas Akhir. ITS.

Buckle, K.A., R.A. Edwards, G.H. Fleet dan M. Wooton.2007. Ilmu

Pangan. Penerjemah Hari Purnomo dan Adiono. Penerbit Universitas
Indonesia Press. Jakarta.

Leben, C. and J. P. Sleesman. 1982. Preservation of plant pathogen

bacteria on silica gel. Plant Disease 66:327 AgroBio 4(1):24-32. Balai
Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan, Bogor.

Machmud M.2001. Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba.

Buletin AgroBio 4(1):24-32. Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman
Pangan, Bogor.

Indriati, M. 2009. Karakteristik Mikrobiologis Kultur Starter Bakteri

Indigenous Dadih Susu Kerbau Dengan Sinbiotik Terenkapsulasi dalam
Bentuk Granul. Skripsi. Fakultas Peternakan IPB. Bogor.

LAMPIRAN

Lampiran 1. Gambar Uji Viabilitas

Gambar 1. Kultur dalam

media SB siap disimpan
di freezer dan
refrigerator

Gambar 3. Hasil
Pengamatan kultur
dalam media SB yang
disimpan di freezer dan
refrigerator

Gambar 2. Kultur dalam

media PDB siap
disimpan di freezer dan
refrigerator

Gambar 4. Hasil
Pengamatan kultur
dalam media PDB yang
disimpan di freezer dan
refrigerator