Anda di halaman 1dari 11

LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA ANALISIS

PEMISAHAN PARACETAMOL DENGAN COFFEIN SECARA HPLC

GOLONGAN : Q
KELOMPOK : D
ASISTEN : PAK HENRY K.S
NAMA KELOMPOK :
1.
2.
3.
4.

MICHELLE OLIVIA
ANISAH
IWANA PUTRI OKTAVIA
LOVIENA VERONICA N.

2443013035
2443013147
2443013280
2443013319

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS KATOLIK WIDYA MANDALA SURABAYA
2015

I. DASAR TEORI

HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid Cromatography, yaitu


alat yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam ( yaitu sebuah
tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan memompa
cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom. Sampel yang akan dianalisis
dijadikan dalam volume yang kecil dari fase bergerak dan diubah melalui reaksi kimia
oleh fase diam ketika sampel melalui sepanjang kolom. Tujuan penggunaan alat ini
adalah mengetahui kadar asam organik. (Synider L R dan J.J Kirkland 1979)
Alat ini digunakan untuk memisahkan komponen berdasarkan dua fase yaitu
fase gerak dan fase diam dengan metode kolom. Kromatografi cair ini menggunakan
kolom tabung gelas yang bermacam-macam diameternya. Pemisahan ini dapat digunakan
untuk proses secara kualitatif maupun kuntitatif. Pengukuran yang didasarkan secara
kualitatif yaitu dengan ditunjukkan oleh waktu retensi. Waktu retensi yaitu waktu yang
dibutuhkan komponen dari mulai diinjeksikan hingga sampel terbaca didetektor.
Sedangkan pengukuran yang didasarkan secara kuantitatif dapat dilat dengan
menggunakan luas area. Luas area yang dihasilkan berhubungan atau erat kaitannya
dengan konsentrasi komponen yang dianalisis. Semakin besar konsentrasi maka semakin
besar juga luas areanya. Atau dapat dikatakkan bahwa luas area sebanding dengan
konsentrasi. Luas puncak kromatografi yang dihasilkan pada kurva elusi menggunakan
HPLC, dapat dipengaruhi oleh tiga proses perpindahan massa, yaitu difussi eddy, difusi
longitudinal, dan transfer massa tidak seimbang. Sedangkan parameter-parameter yang
menentukan berlangsungnya proses-proses tersebut adalah laju aliran ukuran partikel,
dan laju difusi dari ketebalan stasioner. (Khopkar 2007).
Metoda HPLC (High PerformanceLiquid Chromatography) merupakan
metoda untuk menentukan konsentrasi dan pemisahan suatu senyawa dengan mudah,
cepat, dan teliti, dimana dalam sistem ini merupakan sistemkromatografi cair yang juga
merupakan gabungan sistem antara High Speed LiquidChromatography, High Eficiency
Liquid Cromatography, High Pressure Liquid Cromatography.HPLC yang merupakan
gabungan dari 3 sistem ini, memiliki beberapa keunggulan biladibandingkan dengan
kromatografi cair lainnya,diantaranya adalah kolom HPLC yang dapatdipakai berulang
tanpa perlu diregenerasi,pemisahan yang memuaskan dapat tercapai padakolom,
peralatan HPLC dapat dioperasikan secara otomatis dan kuantitatif, serta waktu
analisisyang relative singkat dan dapat dilakukan dalam skala besar (Skoog, 2004).
Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak


Wadah fase gerak harus bersih dan lembap (inert). Wadah pelarut kosong ataupun
labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya
dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak atau eluen
biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan
berperan dalam daya elusi dan resolusi. Fase gerak yang paling sering digunakan
untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol
atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase
gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon
dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol.
Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat
sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak.
Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan
batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai
5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit.
Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak
dengan kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran
fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara
tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam
HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak
yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih
umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

3. Tempat penyuntikan sampel


Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang
mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat
dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel
(sample loop) internal atau eksternal.

Posisi pada saat memuat sampel

Posisi pada saat menyuntik sampel.

4. Kolom dan Fase diam


Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya
proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama
dibanding dengan kolom konvensional, yakni:
A. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding
dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak
lebih lambat (10 -100 l/menit).
B. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal
jika digabung dengan spektrometer massa.
C. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis
kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
5. Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal
(yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat
selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan
detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif,
seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia. Idealnya, suatu
detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.

2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar
yang sangat kecil.
3. Stabil dalam pengopersiannya.
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran
yang luas (kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Berikut merupakan kelebihan dari alat HPLC antara lain:

Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran dengan daya


memisah yang tinggi.

Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan analisis.

Dapat digunakan bermacan-macam detektor dengan kepekaan yang tinggi.

Kolom dapat digunakan kembali.

Waktu analisa cukup singkat.

HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang
tidak stabil.

Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya.

Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.

Kelemahan dari alat HPLC antara lain:


o Harga sebuah alat HPLC cukup mahal.
o Sering ada larutan standar yang tertinggal diinjektor.
o Pada kolom dengan diameter rata-rata partikel fase diam dengan ukuran 5 dan 3
mikrometer sela-sela partikel lebih mudah tertutup oleh kotoran, jadi harus
seringkali dicuci dan kemurnian larutan harus dijaga.

PROSEDUR KERJA

Alat:
-

Alat-alat gelas
Timbangan analitis
Ultrasonik
Membran filter 0,45 um
HPLC dengan kolom RP 18 dan detektor UV
Spektrofotometer UV

Bahan:
-

Paracetamol
Coffein
Metanol for HPLC
Metanol pa
Aqua pro injection

Prosedur:
1. Pembuatan fase gerak
Buat campuran metanol : air (45:55) saring dengan membran filter dan degassing
selama 15 menit
2. Pembuatan larutan uji
Buat larutan standart paracetamol dalam metanol dengan konsentrasi 30 ppm, saring
dengan membran filter dan degassing selama 5 menit.
Buat larutan standart coffein dalam metanol dengan konsentrasi 30 ppm, saring
dengan membran filter dan degassing selama 5 menit.
Buat larutan campuran paracetamol dan coffein dalam metanol dengan konsentrasi 30
ppm, saring dengan membran filter dan degassing selama 5 menit.
3. Penentuan panjang gelombang terpilih
Amati spectrum paracetamol tunggal dan coffein tunggal dengan spektrofotometer
UV, kemudian tentukan panjang gelombang terpilih yang akan digunakan untuk
pengamatan pada HPLC
4. Pemisahan paracetamol dengan coffein dengan HPLC
- Setting HPLC dengan panjang gelombang detektor UV sesuai yang sudah dipilih
-

sebelumnya, atur flow rate 1 ml/min


Flushing kolom dengan metanol for HPLC yang sudah disaring dan di degass

sampai baseline
Ganti metanol dengan fase gerak metanol air (55:45) dan tunggu kolom sampai

stabil dan siap untuk inject sampel


Injectkan larutan standart paracetamol, coffein dan campuran paracetamol coffein

lalu amati kromatogram yang terjadi


Ubah komposisi fase gerak untuk mendapatkan hasil pemisahan yang baik

DATA HASIL PRAKTIKUM

Gambar 1: Spektrum Parasetamol (fase gerak methanol:air 55:45)

Gambar 2: Spektrum Coffein (fase gerak methanol:air 55:45)

Gambar 3: Spektrum Parasetamol dan Coffein (fase gerak methanol:air 55:45)

Gambar 4: Spektrum Parasetamol dan Coffein (fase gerak methanol:air 45:55)


k fase gerak methanol: air 65:35
parasetamol

Coffein

trtm 2.601.10

=
=1.36
k
tm
1.10
k

Parasetamol+Coffein k
k

3.661.53
1.53

1.39

2.601.20
=1.16
1.20
3.631.20
=2.025
1.20

k fase gerak methanol: air 55:45


paracetamol+Coffein k

2.491.36
=0.83
1.36

3.321.36
=1.44
1.36

Rs(Resolusi) Parasetamol dan Coffein

Rs

2 tr
W 1+W 2

=tr 2tr 1
Ket:
Tr = waktu retensi
W = lebar puncak
Rs fase gerak methanol: air 65:35

2 ( 3.632.60 )
=0.876
1.15+ 1.2

Rs fase gerak methanol: air 55:45

2(3.322.49)
=0.69
1.2+1.2

Index Kepolaran Fase Gerak(Methanol:Air)


Pmetanol = 5.1
Pair = 10.2
Pmetanol-air 55:45 = (0.55x5.1)+(0.45x10.2)
= 7.395
Pmetanol-air 45:55 = (0.45x5.1)+(0.55x10.2)
= 5.61
PEMBAHASAN
Pada praktikum ini, dilakukan pemisahan parasetamol dengan coffein menggunakan
metode kromatografi cair tingkat tinggi (KCKT/HPLC) jenis reverse phase. Fase diam yang
digunakan adalah C-18 yang bersifat nonpolar, dengan menggunakan 2 fase gerak yang sama
namun perbandingannya berbeda untuk mengetahui mana pemisahan yang paling baik. Fase
gerak pertama digunakan metanol : air dengan perbandingan 55 : 45 dan kedua dengan
perbandingan 45 : 55. Paracetamol merupakan senyawa nonpolar namun bersifat lebih polar
dari coffein.

Pada proses pengerjaan, dibutuhkan ketelitian tinggi untuk mengurangi kesalahan


yang dapat terjadi. Sampel yang diuji sebelumnya telah disaring dengan membran filter
sehingga tidak ada partikel yang mengganggu yang dapat menyumbat kolom. Pada proses
injeksi diharuskan bebas dari gas atau gelembung, sebab jika ada gas, gas tersebut dapat
menyumbat kolom dan menaikkan tekanan pada HPLC.
Setelah penginjectkan, komponen komponen yang ada dalam sampel akan terpisah
pada kolom. Pemisahan ini berdasarkan perbedaan kekuatan interaksi solute terhadap fase
diamnya. Solute yang berinteraksi kurang kuat (bersifat lebih polar) dengan fase diam akan
keluar lebih dulu sedangkan yang berinteraksi kuat (lebih nonpolar) dengan fase diam akan
keluar lebih akhir. Pada pemisahan ini, paracetamol bersifat lebih polar jika dibandingkan
dengan coffein sehingga paracetamol akan keluar terlebih dahulu setelah itu baru coffein.
Dari hasil yang didapatkan pada kromatogram menunjukkan hubungan antara
komponen yang dibawa oleh fase gerak terhadap waktu retensi. Waktu retensi tersebut
merupakan jangka waktu yang terukur saat sampel melewati kolom HPLC. Banyaknya
puncak menunjukkan jumlah komponen sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi. Dan
dari hasil tersebut didapat Harga Rs yang didapat dalam pemisahan dengan fase gerak
metanol : air (55 : 45) adalah 0,876 dan dengan fase gerak metanol : air (45 : 55) adalah 0,69.
Dari data yang dihasilkan tersebut dapat dilihat bahwa harga Rs yang lebih besar adalah
harga Rs dengan fase gerak metanol : air (55:45) sehingga yang lebih baik keterpisahannya
adalah dengan fase gerak metanol : air (55:45). Dari data kromtogram sampel didapatkan dua
puncak yaitu puncak untuk paracetamol dan coffein. Puncak dari coffein lebih kecil daripada
puncak paracetamol, karena kadar dari coffein dalam sampel lebih sedikit. Kurva yang bagus
adalah kurva yang lancip (lebarnya kecil) dengan kaki yang simetris.
KESIMPULAN
Dari praktikum ini dapat disimpulkan bahwa pemisahan paracetamol dan
coffein yang baik adalah dengan fase gerak metanol : air (55 : 45) karena memiliki harga Rs
yang lebih besar dibandingkan dengan fase gerak perbandingan 45 : 55. Paracetamol bersifat
lebih polar dari coffein sehingga peak paracetamol keluar terlebih dahulu dan diikuti dengan
peak coffein. Karena coffein bersifat lebih nonpolar maka akan terikat lebih kuat pada fase
diam sehingga coffein keluar lebih akhir.

DAFTAR PUSTAKA
Khopkar SM.2007. Konsep Dasar Kimia Analitik. Saptorahardjo.penerjemah. Jakarta: Ui
Press. Terjemahan dari Basic Concepts of Analytical Chemistry.
Synider L R dan J.J Kirkland.1979. Introduction to Modern Liquid Chromatography.
New York : John Wiley & Sons, INC.
Skoog, D.C., D.M. West, F.J. Holler, & S.R. Crouch. 2004. Fundamentals of
Analytical Chemistry 8th ed. Thomson Learning, Inc