Centrifugacin de vulos de dos clulas de ratn:

Estratificacin de citoplasma y recuperacin

Resumen. El vulo de dos clulas de ratn, el cual fue centrifugado
por 1 h a 70000-90000 x g, mostr una estratificacin precisa del
citoplasma y elongacin del ncleo. Los vulos fueron arreglados a
diferentes tiempos y observados por microscopios electrnicos y de
luz usando mtodos citoqumicos y extracciones detergentes. Dentro
de 40 minutos despus de la centrifugacin la morfologa normal fue
recuperada excepto por las capas de lpido persistente a los polos
centrpetos de los blastmeros. Divisin, compactacin y blastulacin
no fueron prevenidas por la centrifugacin. Tratamientos con
colcemida o citocalasina D retardaron pero no previnieron la
recuperacin impar. Estos resultados sugieren que un resistente
estructura citoesqueltica pueda estar inmersa en esta clase de
regulacin embrinica.
Palabras clave: vulo de ratn centrifugacin regulacin
citoesqueleto.
Introduccin:
El vulo de dos clulas en ratn, observado por inmunofluorescencia,
mostr una regionalizacin de miosina (Sobel 1983a, b), fodrina
(Schatten et al, 1986) y espectrina (Sobel y Alliegro 1985, pero vea
Damjanov et al, 1986) y del estado de 4 clulas en adelante una
fostasa alcalina regionalizada y actividad de la 5 nucleotidasa
puede ser demostrada en la membrana celular (Izquierdo et al. 1980;
Izquierdo y Ebensperger, 1982). No han sido reconocidas distintas
regiones antes, ni en el oocito o en el vulo fertilizado, el cual podra
ayudar a establecer un lineaje celular que conecte blastmeros
tempranos con las clulas diferenciadas de los blastocistos. Adems,
embriones experimentalmente desordenados son capaces de regular
y desarrollar a blastocistos normales (). Estas observaciones, aun as,
descartan la existencia de una estructura espacial consistente que
pueda determinar desarrollo, a pesar de eso tal determinacin puede
ser rechazada por la regulacin embrinica. Aqu analizamos la
estructura espacial del vulo de dos clulas por medios de su
centrifugacin y subsecuente cultura in vitro. Este mtodo no ha sido
usado en mamferos, excepto por un reporte de bsqueda preliminar
por Mulnard (1970).
Materiales y mtodos:
Coleccin de los embriones. vulos de dos clulas fueron
colectados en medio Biggers () conteniendo 4 mg/ml de suero de
albmina bovina (BSA) () de ratones superovulados de los CF de 1
tensin, 36 h despus del presunto tiempo de ovulacin ().
Procedimiento de centrifugacin. Soluciones de dextrano (MW
40000
Sigma)
fueron
preparados
en medios
Biggers
a

concentraciones de 17%, 15% y 11% (w/v), bebidos separados con

CO2 en aire hasta ajustar el pH a 7.2-7.4 y luego e introduci
secuancialmente en 0.8 ml de tubos de nitrocelulosa. Los embriones
fueron colocados en la parte ms clara del gradiente discontinuo y los
tubos fueron entrifugados por 60 minutos usando un rotor basculante
SW 39 del modelo de centrfuga Beckman L. Las fuerzas centrfugas
aplicadas en el rango de 15000 a 120000 x g. La temperatura del
contenido del tubo variaba entre 13 y 18 C, excepto por
experimentos en el cual la centrifugacin fue realizada a los 4C.
Cultivo in vitro. Siguiendo la centrifugacin, los vulos fueron
enjuagados con medio Biggers y, o arreglados inmediatamente o
cultivados en diferentes tiempos antes de la fijacin. Los vulos
fueron cultivados en microgotas de medio Biggers con BSA en placas
de Petri de plstico (Falcon) en aceite mineral a 37C en una
atmsfera hmeda de CO2 en aire, pH 7.2-7.4. El nmero de clulas
fue determinado por el mtodo de Tarkowski (Tarkowski, 1966). Antes
y durante la centrifugacin los vulos fueron expuestos a temperatura
controlada y atmosfrica; los tubos control fueron tratados
similarmente.
Microscopio electrnico y de luz. Luego de la centrifugacin y el
cultivo in vitro, los vulos fueron procesados por microscopios
electrnicos y de luz as como los reportados anteriormente () sin
agregar cido tnico. La microscopa fue realizada en grandes
cantidades de glicerol. En algunas series experimentales,
inmediatamente luego de la centrifugacin los vulos fueron lavados
en buffer de estabilizacin (), permeabilizados con 0.5% de Triton X100 en buffer de estabilizacin por 1 minuto a 37C y lavados en el
mismo buffer por 30 s antes de la fijacin.
Tcnicas citoqumicas. La demostracin no especficade lpidos fue
lograda por Red Oil, Sudan Negro () y su primera osmofilia. La
fosfatasa cida fue demostrada en grandes vulos de acuerdo al
mtodo Gomori modificado por Weissenfels (). El ADN fue demostrado
por un test de Feulgen modificado en vulos que haban sido
arreglados en alcohol formaldehdo actico ().
Inhibidores del citoesqueletos. En estas series de inhibidores fueron
agregados al medio de cultivo y al gradiente de dextrano. Algunos
experimentos fueron empezados con una mezcla de 0.5 ug/ml de
colcemida (Sigma) y 0.5 ug/ml de citocalasina D (Sigma), otros fueron
empezados con colcemida (2 ug/ml) o con citocalasina (0.5 ug/ml);
finalmente, algunos experimentos fueron completados a 4C. Los
vulos fueron cultivados en medios que contenan inhibidores por 1 h
antes, durante y despus de la centrifugacin. Los inhibidores fueron
preparados en dimetilsulfoxido (DMSO) ()
no se observaron
diferencias entre controles con o sin DMSO.
Resultados

Estratificacin: observaciones de microscopio de luz

Luego de la centrifugacin, los vulos fueron hallados en capas
correspondiendo de 13% a 15% de dextrano. Las fuerzas centrfugas
mayores que 30000 x g inducidas a estratificacin visible y
reproducible del citoplasma (). Algunos vulos empezaron a romperse
a 120 000 x g.
Los 71 vulos arreglados despus de la centrifugacin a 70
000 x g o 90 000 x g mostraron, mediante un microscopio de luz, una
ligera elongacin de sus blastmeros en el sentido de las fuerzas de
centrifugacin y algunas veces una cintura. Los vulos usualmente se
orientan a s mismos en tal forma que el estrato estaba en un ngulo
de 90 en un plano separando ambos blastmeros. El cuerpo polar ha
sido observado mas frecuentemente que en el polo centrfugo.
Una capa de material lpido, fuertemente manchados con
Sudan Negro o Aceite Rojo o Tetraxido de Osmio, se hallaron al polo
centrpeto de cada blastmero (). Bajo la capa del lpido, fue hallada
una cubierta de hialina, la cual en su margen centrpeto fue marcado
ligeramente con actividad de fosfatasa cida. Bajo la cubierta de
hialina, una capa granulada extendida en la parte baja en el polo
centrpeto. En esta capa, el ncleo pudo ser visto abarcando desde el
centro del blastmero hasta el polo centrpeto, como si fuera jalado
en esa direccin por el denso ncleo (). El test de Feulgen revel que
no haba presencia de cromatina fuera del ncleo elongado.