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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA


BIOLOGA
METODOLOGA CIENTFICA II

Cuantificacin de la protena BADH purificada y evaluacin del


rendimiento del mtodo de purificacin.
Determinacion de la pureza y del peso molecular de la BADH
utilizando Electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS
(SDS-page).
Grupo: 2207
Integrantes:
Aparicio Moreno Cesar Eduardo
Castaeda Martinez Vanessa Citlalli
Facio Martinez Omar Ivan
Martnez Mndez Georgina
Perez Cortes Florencia Fernanda
Sanchez Onofre Diana Laura

INTRODUCCION
Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos
mtodos se basan en: a) la propiedad intrnseca de las protenas para absorber
luz en el UV, b) para la formacin de derivados qumicos, o c) la capacidad que
tienen las protenas de unir ciertos colorantes. sensibilidades. Cada uno de estos
mtodos tiene sus ventajas e inconvenientes
Mtodos Derivados Colorimtricos:
Biuret:
Bastante especfico para protenas Muestra pocas interferencias Es barato Tiene
poca sensibilidad
Lowry:
Tiene bastante sensibilidad No todas las protenas reaccionan igual Muestra
muchas interferencias como detergentes no inicos, sulfato amnico etc.
Bradford:
Muy sensible Muestra interferencias con detergentes BCA Es el mtodo mas
sensible Es el que muestra menos interferencias (1)
Por lo cual tomando en estas caracteristicas se decidio tomar el metodo de
colorimetrico de Bradfor que se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue
G-250 (tambin Serva Blue) a las protenas. El colorante, en solucin cida, existe
en dos formas una azul y otra naranja. Las protenas se unen a la forma azul para
formar un complejo protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que
el colorante libre. Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido, barato y
pocas sustancias interfieren en su determinacin. Entre las sustancias que
interfieren estn los detergentes y las soluciones bsicas.(2)
El espectrofotmetro es un instrumento ampliamente utilizado en el anlisis
cualitativo y cuantitativo de molculas biolgicas. Esto quiere decir que este
instrumento nos ayuda a determinar cules sustancias (protenas, lpidos,
carbohidratos, cidos nucleicos, entre otras), estn presentes en una disolucin y
en qu cantidad. Los espectrofotmetros pueden emitir radiaciones de diferentes
longitudes de onda tanto en el ultravioleta como en el visible. Muchas sustancias
absorben radiacin a diferente longitud de onda (puede ser en el espectro visible o
en el ultravioleta), por tanto, cuando determinamos a qu longitud de onda
absorbe una sustancia desconocida, podemos tener idea de qu tipo de molcula
se trata. Esta misma propiedad se utiliza para cuantificar la sustancia: a mayor
cantidad de radiacin absorbida, mayor concentracin de sta. Si la sustancia no
absorbe radiacin en el ultravioleta o el visible, puede modificarse qumicamente

para producir un compuesto que s absorba en estas longitudes de onda. A este


tipo de mediciones se les conoce como indirectas.
(3)
La electroforesis es una herramienta de separacin de biomolculas, que en los
ltimos aos ha tenido gran importancia en medicina; presenta la versatilidad de
poder separar aminocidos, cidos orgnicos, iones inorgnicos, carbohidratos,
esteroides, tioles, contaminantes alimenticios, material gentico y algunos
frmacos importantes en el estudio de diferentes ramas en el rea de la salud
(diagnsticos molecular y de laboratorio clnico (Garca-canas V, Cifuentes A.,
2007)
La electroforesis en gel de agarosa es de las ms utilizadas para analizar y
caracterizar cidos nucleicos de distintas procedencias. Los geles se comportan
como un tamiz molecular y permiten separar molculas cargadas en funcin de su
tamao y forma. As, molculas de DNA de diferente tamao van a emigrar de
forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa. Adems, si en dicha
electroforesis se aplican marcadores de peso molecular (fragmentos de DNA de
tamao conocido) se puede calcular el tamao aproximado del DNA en estudio.
(Padilla-Pea C., et al, 2003)

OBJETIVOS

Cuantificar la protena presente en la fracciones Exp y ENZ. Calcular el


rendimiento del proceso de purificacin utilizado en la unidad experimental
I.

Calcular el coeficiente de absorcin molar de la BADH, presuntamente pura


en la fraccin ENZ.

Determinar la pureza de la BADH obtenida en la actividad experimental


I,por medio de electroforesis desnaturalizante.

Conocer el peso molecular de esta enzima a travs del mismo mtodo


electrofortico (SDS-PAGE).

METODOLOGA

Actividad de la enzima BADH

Para realizar el ensayo de la actividad de la enzima BADH en el extracto celular


(ExP) y ENZ, se preincubaron las cubetas con medio de reaccin (MR) por 10 min
a una temperatura de 30 C. Posteriormente se calibr el espectrofotmetro a cero
colocando dos cubetas en los compartimentos de referencia y muestra, midiendo
durante 1 min la absorbancia a una =340 nm para asegurarnos que no existe
actividad reductora de la coenzima NADP+.
Utilizamos la otra cubeta en incubacin para medir la actividad enzimtica en el
extracto celular (ExP). Para ello, se agregaron 1 L del extracto al medio de
reaccin, agitando rpidamente y midiendo de inmediato el cambio de absorbancia
durante 1 min. La cubeta restante se utiliz para medir de la misma forma la
actividad de ENZ.
*El cambio de absorbancia/min se registr.

Cuantificacin de protena por el mtodo de Bradford.

Se descongelaron las muestras ExP y ENZ obtenidas en la prctica I.


Posteriormente se prepar una curva patrn constituida por 12 tubos (de acuerdo
al siguiente cuadro), en donde a los tubos 11 y 12 les fueron aadidas
respectivamente las muestras ExP y ENZ.
La curva se realiz en el orden en que se muestra la tabla:

Tras adicionar el reactivo de Bradford, se agitaron los tubos, dejando reposar 10


min a temperatura ambiente. Ms tarde fueron llevados a una lectura en el
espectrofotmetro a una de 595 nm. Realizando el registro de datos en la tabla
anexada a la prctica, en donde se registraron la cantidad de BSA (g) y la lectura.

Al obtener los datos fueron graficados en el papel milimtrico proporcionado en la


prctica. Con ayuda de una calculadora se ajustaron los datos por mnimos
cuadrados. Al mismo tiempo se obtuvo el valor del coeficiente de correlacin (r) de
los datos, e interpolaron las absorbancias de las muestras problema y calcul la
concentracin de protena de cada una de ellas. Tras ellos de calcul la cantidad
de protena por mL de muestra.

Clculo terico del coeficiente de absorcin molar de la BADH

Considerando en los clculos que la protena activa es un tetrmero se calcul el


coeficiente de extincin de la BADH utilizando la siguiente ecuacin:

de una protena = (nTrp x Trp) + (nTyr x Tyr) + (nCys-Cys x Cys-Cys)

Dnde:

de Trp, Tyr y Cys-Cys son 5500, 1490 y 125 respectivamente, a 280 nm y se

expresa en M-1 cm-1 (2, 7).

Obteniendo

de la BADH.

Electroforesis
Se ensamblo en mdulo de electroforesis retirando el peine del gel y
enjuagando las pozas con agua destilada, se coloc el cassette del
gel en el bastidor de sujecin una vez hecho esto se agreg el
amortiguador. Posteriormente se prepararon las muestras y se
mezclaron en tubos eppendorf
de 5 ml los volmenes que se
obtuvieron en la quinta columna del cuadro; despus de esto se
aplic la muestra sobre el gen aplicando con cuidado las muestras
estndares y de PM desde el carril 2 hasta el 4 utilizando una micro
pipeta. Posteriormente se colocaron los geles en el interior del
tanque, se tap la cmara y se colocaron los electrodos de acuerdo a
su color, se conectaron los cables y se inici la corrida aplicando 200
V de manera constante.
Una vez terminada la corrida se apag la fuente de poder y se
desconectaron los cables, se retir la tapa y se recuper el
amortiguador, se retir del bastidor de sujecin el cassette con el gel
y se separ con cuidado las dos placas de vidrio, se despegue el gel
desde la placa de vidrio a la que est adherido.
Se retir el agua del recipiente y se fijaron las protenas cubriendo el
gel durante 15 min con Solucin fijadora. Se midi la distancia
recorrida por las protenas estndares y la enzima purificada;
despus se grafic el log del peso molecular de las protenas
estndares, que se proporcionaron en el cuadro, versus su distancia
de migracin; posteriormente se
calcul el PM de la protena
purificada interpolando su migracin relativa en la lnea patrn
obtenida con los estndares.

Resultados y anlisis
Concentracin

Absorbancia

0.078

10

0.132

20

0.147

40

0.182

60

0.306

80

0.312

120

0.528

160

0.639

200

0.649

(Exp)154.87

0.576

(ENZ) 66.15

0.285

tabla 1.- Resultados obtenidos de la curva patrn en trminos de


concentracin (g)/absorbancia.En el caso de Exp y ENZ se hicieron los
clculos correspondientes para interpolar la concentracin basndonos en
la absorbancia obtenida.

Grfico 1.- Resultados obtenidos y la recta de la ecuacin de prediccin.


Stoscheck (1990) mencion que el criterio para seleccionar un mtodo de
cuantificacin de protenas est basado usualmente en la conveniencia, el rango
de sensibilidad, la cantidad de muestra necesaria para hacer las pruebas y los
detalles del procedimiento. En nuestro caso empleamos el mtodo colorimtrico
de Bradford por ser sensible, rpido y econmico, con cuya reaccin colorida
resulta bastante estable. Dada la cantidad de protena en una muestra que nos fue
proporcionada aleatoriamente, dicha cantidad result proporcional a la cantidad de
colorante y ajustable en rango, empleando albmina como referencia.

Clculo terico del coeficiente de absorcin molar de la BADH


e de la BADH= 214440.
Cuantificacin de la BADH por su absorbancia a 280nm
c= A/ eL
c= 226 mg/ml
Azaero M., et al, en 2000 lleva a cabo una pureza de la enzima proteoltica
obtenida luego de los dos pasos cromatogrficos determinada en condiciones
reductoras y no reductoras, encontrando en ambos casos una sola banda
homognea de protena. Sus resultados indicaron que la diferencia encontrada en
el peso molecular se deba a que la enzima tiene por lo menos un enlace disulfuro
intracatenaria, de modo que cuando el enlace no es reducido, la protena no es
plegada por completo y por tanto, su movilidad se ve incrementada en
considerable medida.

En el caso de la actividad enzimtica obtenida por el equipo, esta fue casi nula,
esperando un registro mucho mayor, y en dicho caso se compar el contenido de
Trp y Tyr.
En relacin a la comparacin de diferentes mtodos (Cerna E., et al) opta que el
mejor es el mtodo de Brogdon, debido a que registr lecturas ms altas de
protena en las muestras en un estudio que abarca Evaluacin de mtodos de
cuantificacin de protenas en Tetranychus urticae para su uso potencial en la
deteccin de resistencia a plaguicidas.
Electroforesis

Imagen 1 y 2.- Resultados de la electroforesis, se observa a la izquierda


marcador de pesos moleculares. Las pequeas lneas indican a la protena
purificada.
La electroforesis es un mtodo analtico. Su ventaja es que las protenas pueden
visualizarse adems de separarse, lo que permite al investigador hacer una

estimacin rpida del numero de protenas de una mezcla o del grado de pureza
de una preparacin proteca determinada. La electroforesis tambin permite la
determinacin de propiedades cruciales de una protena tales como su punto
isoelectrico y su masa molecular aproximada(Lehninger,2009).
Despues de analizar los resultados, se observa un bandeo muy tenue aparte de la
protena analizada, por lo que se dice que esta no esta 100% purificada.
Con base al marcador de peso molecular, se ve que estara entre 50 y 75 Kda.
El gel de poliacrilamida actua como tamiz molecular. Despues de la electroforesis
se utilizo el colorante azul de Coomasie, que se fija a las protenas pero al gel no.

Conclusin
La cuantificacin de la BADH por medio del mtodo de Bradford y por la
absorbancia de la BADH a 280 nm dieron resultados distintos, siendo 154.87
mg/ml y 226 mg/ml respectivamente, esto debido a que la reaccin del reactivo de
Bradford reacciona directamente con aminocidos especficos y las estructuras
terciarias de la protena a 595 nm , a diferencia del mtodo por absorbancia a
280nm, cuya lectura se da por medio de las tirosinas y los triptfanos.
Se determino que la pureza fue casi del 100% y el peso molecular fue de 50 y 75
Kda.
Cuestionario
1. Por qu cuando se cuantifica la protena con el reactivo de Bradford se
debe medir la absorbancia a 595 nm?
R= La unin del colorante con las protenas provoca un cambio en el mximo
de absorcin del colorante desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este mtodo se
basa en la propiedad del Azul Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en
dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en
azul cuando el colorante se une a la protena. Experimentalmente se mide la
diferencia de Absorbancias entre 595 nm.
2. Describa lo que es el coeficiente de absorcin molar de una molcula y la
relacin que existe entre ste y el contenido de Trp y Tyr de la protena
que aqu se purifica.
R= El coeficiente de absorcin molar es una medida de la fuerza con un tipo de
especie qumica que absorbe luz a una longitud de onda determinada; cabe
mencionar que ninguno de los 20 aminocidos hallados en las protenas absorbe
luz en la zona del espectro visible, tres de ellos la tirosina, el triptfano y la
fenilalanina, absorben luz en el espectro significativamente.

3. Explique por qu para el clculo del coeficiente de absorcin molar de


esta protena se le pide que considere que la molcula es un tetrmero.
R= Que al calcular la absorcin molar, como se da el nmero de los aminocidos
esto se debe multiplicar por 4 ya que la protena es un tetrmero.
4. Podra determinar la concentracin de protenas que tiene un extracto
celular midiendo su absorbancia en una longitud de onda de 280 nm?
Fundamente su respuesta.
R= S, ya que la longitud de onda correspondiente a un pico de absorcin
mxima es de 280 nm en aminocidos aromticos como los presentes en
BADH
los
cuales
son
Trp
y
Tyr.

5. En esta prctica la protena de la muestra ENZ se cuantifica de dos


maneras: a travs del mtodo de Bradford y midiendo su absorbancia a
280 nm. Cul de estos mtodos podra ser ms exacto y por qu?
R= Es ms el mtodo de Bradford ya que es un mtodo rpido y una ventaja que
tiene es que el complejo colorante-protena tiene un alto coeficiente de extincin
lo cual es imprescindible para aumentar la sensibilidad en la medicin de
protenas.

6. Refirindonos a la tabla de purificacin de esta prctica, por qu el


valor de la actividad especfica se incrementa conforme se avanza en el
proceso de purificacin?
R= Porque al ir purificando la protena est cada vez queda menos disuelta en el
medio en el que se encontraba por lo tanto se va haciendo ms pura y tendr una
mayor actividad.
7. Suponiendo que durante este proceso encontrara una disminucin en la
Actividad especfica, cules podran ser las razones de estos
resultados?
R= Que no se hizo bien la purificacin y por lo tanto la protena seguira disuelta
en el medio en el que se encontraba sin mostrar actividad.

1. Explique el principio de la determinacin de la masa


molecular de una protena a travs de la utilizacin de
electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE). Haga
hincapi en la forma en que acta el SDS y en el fenmeno de
tamiz molecular.
La tcnica permite separar molculas cargadas y explota diferencias en movilidad
cuando se les somete a la accin de un campo elctrico. En la electroforesis
desnaturalizante (SDS-PAGE) como su nombre lo dice utilizan agentes
desnaturalizantes de protenas, como pueden ser: detergentes (p.e. SDS), catropos
(p.e. urea) y agentes reductores (2- mercaptoetanol, DTT). En la SDS-PAGE, la
separacin es funcin del tamao (masa molecular), lo que permite determinar el peso
molecular de las protenas. Para ello se compara la movilidad electrofortica (Rf) de la
protena de peso molecular desconocido con el de protenas de referencia de peso
molecular conocido. (Hames BD y Ricwood D 2002)

2. Suponga que Ud. ha aislado una protena X utilizando las


cromatografas de
intercambio inico y de exclusin molecular, y este ltimo
anlisis indica que el
peso molecular de la protena es de 205 KDa. Un estudio
posterior de la protena
utilizando SDS-PAGE, en ausencia de mercaptoetanol, revela dos
bandas con un
peso molecular de 135 y 70 KDa; sin embargo, en presencia del
reductor los geles
de la SDS-PAGE muestran 1 banda de 70 KDa y otra de 45 KDa.

3. Describa a partir de estos datos el nmero de subunidades


que componen a la
protena X, el peso molecular de cada una de ellas, la
estequiometra de las
subunidades y el tipo de interacciones covalentes que las
mantienen juntas.

A partir de las unidades que interfieren entre las primera banda y la segunda
es su residuo de 70KDa que es parcialmente el mismo en ambas bandas, las
subunidades que se revelan son de uno de 70 KDa y tres de 45 KDa. Es un
tetrmero.

Bibliografia
(1)Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal
Biochem. 72: 248-254.
(2)lson BJ, Klenk DC (1985): Measurement of protein using bicinchoninic acid. An
al Biochem 150: 7685. Suelter CH (1985): A Practical guide to enzymology, Editori
al, John Wiley & Sons, New York
(3) Gentica General. Manual de prcticas de laboratorio. Regulacin gentica en
el opernlac. Facultad de Qumica, UNAM. Ciudad Universitaria. Mxico, 2002
Lehninger, A., Nelson, D., Cox, M., Principios de bioquimica.Quinta edicion.
Editorial Omega. Espaa. Pp. 88-89Klug SW, Cummings RM. Conceptos de gentica. Ed. Prentice Hall. Madrid 1999.
Pp. 5171. Lodish H, Molecular Cell Biology, 2003, Ed. Freeman and company, pp.
115-125. Localizacin QH581.2 M 65
Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed.Revert, pp.868-873.