Flix Osorio Sandra Astrid

18 de Diciembre del 2014

Biologa Molecular

CROMATOGRAFA LQUIDA DESNATURALIZANTE DE ALTO RENDIMIENTO

Introduccin

La cromatografa lquida es un mtodo fsico de separacin basado en la distribucin de una

mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija y otra mvil. Esta ltima, en dicha tcnica, es
un lquido que fluye a travs de una columna que contiene la fase fija, la cual es un slido
inerte.
Con el fin de aumentar la eficacia en dichas separaciones, se han llevado a cabo
diversas modificaciones al mtodo original. De esta manera surge la tcnica de
cromatografa lquida desnaturalizante de alto rendimiento, la cual trabaja con el
incremento en la presin requeridas para la optima separacin de las molculas, utiliza la
variante de fase reversa de la cromatografa lquida de alta eficiencia y, como su nombre lo
indica, la desnaturalizacin de la muestra a analizar mediante temperatura.

Desarrollo

Obtencin de ADN y amplificacin por PCR

Antes de llevar a cabo la cromatografa lquida desnaturalizante de alto rendimiento se debe
tratar la muestra para la obtencin del DNA de la clula de inters.
Posteriormente, para obtener la secuencia de DNA de inters, se realiza un PCR para
amplificar dicha secuencia de DNA.
Desnaturalizacin y Renaturalizacin
Una vez obtenida la secuencia de DNA de inters, se lleva a cabo la exposicin de los
fragmentos mutados de dicha secuencia, esto a travs de la desnaturalizacin y
renaturalizacin del material gentico.
Para este proceso se utiliza la variacin de temperatura, sabiendo que las hebras de DNA a
altas temperaturas (95C por 5 minutos) se separan. Para la renaturalizacin, la muestra se
enfra en hielo (10 minutos).
Cromatografa lquida desnaturalizante de alto rendimiento
Est detectar las mutaciones dependiendo de los fragmentos de los genes obtenidos en el
PCR y posterior a la desnaturalizacin y renaturalizacin, esto a partir de los tipos de
reaparamientos que se hayan llevado a cabo por las hebras de DNA.
Las molculas quedarn atrapadas en la fases solida fija, y posteriormente sern extradas.
Este proceso depender de la temperatura que posea la molcula.

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Biologa Molecular

Posteriormente, se realiza un cromatograma, en el cual se pueden leer los correspondientes

resultados.

Anlisis

La sensibilidad y especificidad de DHPLC superan el 96%. Estas caractersticas y su bajo

costo hacen DHPLC una de las herramientas ms poderosas para la resecuenciacin de los
genomas humanos y de otras especies. Aparte de su aplicacin al anlisis mutacional de
genes candidatos, DHPLC ha demostrado un papel decisivo en la aclaracin de la evolucin
humana y en el mapeo de genes. Empleando condiciones completamente desnaturalizantes,
la utilidad de DHPLC ha sido extendida a la determinacin del genotipo de los
polimorfismos conocidos mediante la utilizacin de la capacidad de para obtener molculas
de ADN monocatenario de tamao idntico que difieren en un solo base.

Conclusin

La cromatografa lquida desnaturalizante de alto rendimiento provee al investigador una

herramienta de separacin a travs de mtodos fsicos para la evaluacin del material
gentico.
Si bien, este mtodo sigue conservando el fundamento de la cromatografa original, con el
tiempo se ha ido adecuando a las necesidades de los investigadores. As surgiendo la parte
de "desnaturalizante", que ofrece una nueva herramienta al investigador.
Por este mtodo se pueden obtener resultados que por otro tipos de pruebas sera imposible
obtener, o si bien se obtienen, muestran una baja eficiencia.
As queda demostrado que la lquida desnaturalizante de alto rendimiento es y seguir
siendo, hasta que no se encuentren otros mtodos ms eficaces, un mtodo de gran
importancia en el diagnostico biomolecular.

Referencias
Bing Y, S. N. (2006). DNA Mutation Detection Using Denaturing High-Performance
Liquid Chromatography (DHPLC). Human Genetics.
Oefner, W. X. (2001). Denaturing High-Performance Liquid Chromatography: A
Review. Human Mutation.
Victor Cohen, J. S. (2006). Evaluation of Denaturing High-Performance Liquid

Chromatography as a Rapid Detection Method for Identification of Epidermal Growth

Factor Receptor Mutations in Nonsmall-Cell Lung Cancer. Wiley InterScience.