qualidade de produtos
base de Trichoderma
18 a 20 de setembro de 2012
Embrapa Meio Ambiente - Jaguarina, SP
metodologias
para
realizar
essas
avaliaes,
com
NDICE
I. METODOLOGIAS PARA CONTROLE DE QUALIDADE DE PRODUTOS
BIOLGICOS BASE DE Trichoderma FORMULADOS EM P-MOLHVEL,
GRNULOS DISPERSVEIS E SUSPENSO CONCENTRADA.
I. I - METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DO NMERO DE CONDIOS
I.II - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONDIOS
PORCENTAGEM DE CONDIOS VIVEIS
I. III - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONDIOS UNIDADE
FORMADORA DE COLNIA
II METODOLOGIAS PARA CONTROLE DE QUALIDADE DE PRODUTOS
BIOLGICOS BASE DE Trichoderma FORMULADOS EM P-DE-ESPORO.
II. I - METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DO NMERO DE CONDIOS
II. II - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONDIOS
PORCENTAGEM DE CONDIOS VIVEIS
II. III - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONDIOS UNIDADE
FORMADORA DE COLNIA
- Autoclave;
- Balana semi analtica com faixa de trabalho de 1 a 2000 g;
- Agitador de tubo de ensaio;
- Banho de ultrassom com aquecimento e frequncia de 40 kHz;
- Agitador orbital para Erlenmeyer;
- Micropipeta de 10 mL e 1000 L;
- Ponteiras esterilizadas para micropipetas de 10 mL e 1000 L;
- Cmara de Neubauer (ou hemacitmetro);
- Microscpio ptico;
- Contador manual;
- Agitador magntico;
- Barra magntica.
5. SOLUES
Soluo salina com Tween 80 (diluente):
Ingredientes:
- NaCl P.A.: 9,0 g;
- gua destilada: 1000 mL;
-Tween 80: 1 mL.
Preparo:
Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 mL de gua destilada e
acrescentar Tween 80. Misturar bem e autoclavar o diluente a 121 C e 1 atm por 20
minutos.
Observao: todas as vidrarias e solues devem ser esterilizadas em autoclave antes
de serem utilizadas.
6. PROCEDIMENTO
6.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas temperatura ambiente por 30 a
40 minutos antes do incio da anlise.
6.2 Pesar 10 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250 mL e completar com 90 g
do diluente (corresponde diluio 10-1). Devem ser realizadas duas pesagens para cada
amostra e uma srie de diluio para cada pesagem. A segunda pesagem deve ser
realizada 10 minutos aps a colocao de gua na primeira amostra para evitar maior
tempo de hidratao.
Campo 1
Campo 2
E1
E2
E3
E4
E5
8. REPETIO
Devem ser feitas duas pesagens do produto, sendo que de cada pesagem deve ser
realizada uma srie de diluio seriada. A diluio selecionada, deve-se colocar na
cmara de Neubauer para contagem.
10
esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA podem ser estocadas em local
escuro e sob refrigerao (2-8 C) por sete dias.
Observao: todas as vidrarias e solues devem ser esterilizadas em autoclave antes
de serem utilizadas.
7. PROCEDIMENTO
7.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas temperatura ambiente por 30 a
40 minutos antes do incio da anlise.
7.2 Pesar 10 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250 mL e completar com 90 g
do diluente (corresponde diluio 10-1). Devem ser realizadas duas pesagens para cada
amostra e uma srie de diluio para cada pesagem (item 8). A segunda pesagem deve
ser realizada 10 minutos aps a colocao de gua na primeira amostra para evitar maior
tempo de hidratao.
7.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspenso em agitador orbital por 60 minutos a 90
rpm.
7.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspenso em banho de ultrassom, por 5 minutos. O
nvel de gua do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspenso contida no
Erlenmeyer.
7.5 Misturar o contedo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e
tirando trs vezes do aparelho quando observar o turbilhonamento da suspenso. Ou
colocar em agitador magntico por 5 minutos.
7.6 Transferir 1,0 mL da suspenso contida no Erlenmeyer (10-1), com auxlio de
micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 mL de
diluente (10-2). Descartar a ponteira em seguida.
7.7 Homogenizar o contedo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando trs
vezes do aparelho at ser observado o turbilhonamento da suspenso, em cada uma das
passagens.
7.8 Para obter a diluio 10-3 repetir os itens 7.6 e 7.7 (diluio seriada), utilizando o
tubo da diluio anterior (10-2). Proceder assim repetidamente at alcanar a diluio
apropriada para contagem de condios (Tabela 1). Para cada diluio deve-se trocar a
ponteira da micropipeta.
13
7.13 Avaliar a viabilidade usando microscpio ptico no aumento de pelo menos 400x.
7.14 O condio considerado vivel, quando estiver ativo ou germinado (Figura 2 Glossrio).
7.15 Contar os condios viveis e no viveis nos cinco pontos. Contar pelo menos 100
condios por ponto.
7.16 Se necessrio, fazer nova avaliao na segunda placa, seguindo o item 7.10 a 7.13.
7.17 Calcular a taxa mdia de viabilidade utilizando a frmula:
Viabilidade (%)=(mdia do nmero de condios viveis das pesagens/total de condios) X 100
Deve ser realizado o clculo para cada gota de cada pesagem de cada diluio,
separadamente. Posteriormente, obter a mdia aritmtica de cada pesagem.
Condio germinado
Condio ativo no
germinado
Condio inativo
15
10. LIMPEZA
Antes de realizar e aps o trmino da metodologia, a cmara de fluxo laminar (ou o
local onde ser realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida
em lcool 70 % e depois em hipoclorito 2%.
11. GLOSSRIO
Condio: estrutura no sexual de reproduo de fungos.
Condio ativo ou em processo de germinao: o condio que aumentou de tamanho
em relao ao no germinado, mas que ainda no emitiu tubo germinativo.
16
Condio germinado: o condio apresenta tubo germinativo com pelo menos o mesmo
comprimento que o tamanho do condio.
Condios inativos: condios no viveis.
Condios no germinados: condios que podem ou no estar viveis, porm no
formou tubo germinativo com pelo menos o mesmo comprimento que o tamanho do
condio.
Condios viveis: so os condios ativos e os germinados.
Conidiforo: estrutura do fungo produtora de condios.
Grnulos: tipo de formulao de produto biolgico em forma de grnulos que se
desfazem na presena de gua.
P-molhvel: tipo de formulao de produto biolgico composta pelo ingrediente ativo
e inerte que permita a mistura com gua, formando suspenses dotadas de grande
estabilidade.
Diluir at
10-6
10-7
10-8
10-9
10-10
10-11
10-12
10-13
7.1.9 Riscar com caneta de retroprojetor a base das placas contendo meio BDA,
dividindo-as em 4 quadrantes.
7.1.10 Misturar o contedo do tubo de ensaio com a suspenso apropriada em agitador
de tubo de ensaio colocando e tirando trs vezes. O tubo deve ser retirado quando
ocorrer o turbilhonamento.
20
Figura 1. Placa de Petri com meio de Batata Dextrose e Agar dividida em 4 quadrantes
com trs alquotas de 20L da diluio seriada referente a marcao da placa.
7.1.12 Os tubos com as diluies devem ser guardados sobre refrigerao (2-8 C) por
no mximo 48 horas para serem utilizados no teste de unidade formadora de colnia;
7.1.13 Esperar para que os 20L de cada diluio sejam absorvidos no meio de cultura e
transferir as placas em BOD, por 24 a 48 horas, 25 2 C, no escuro, antes de continuar
o procedimento;
7.1.14 Observar quais as diluies houve o crescimento de colnias de Trichoderma e
selecionar as trs ltimas diluies que apresentaram o crescimento do fungo nas trs
gotas das duas pesagens realizadas para a realizao do teste de unidade formadora de
colnia.
7.2 TESTE DE UNIDADE FORMADORA DE COLNIA (UFC):
7.2.1 Retirar os tubos de cultura com as diluies seriadas da refrigerao por 30 a 40
minutos antes do incio da anlise.
7.2.2 Misturar o contedo dos tubos de cultura com as diluies escolhidas em agitador
para tubos de ensaio colocando e tirando trs vezes. O tubo deve ser retirado quando
ocorrer o turbilhonamento;
7.2.3 Transferir de cada diluio apropriada, com uma micropipeta estril, 100L para a
superfcie de cinco placas de Petri com meio de Batata Dextrose Agar com adio de
Triton;
7.2.4 A diluio distribuda uniformemente sobre a superfcie do meio com uma ala
de Drigalski esterilizada, imediatamente aps a transferncia. Para cada grupo de cinco
placas utilizar uma ala de Drigalski.
21
7.2.5 Fazer uma placa controle antes de iniciar o item 7.2.3, espalhando 100L da
soluo salina com Tween em placa com meio de Batata Dextrose Agar com adio de
Triton com ala de Drigalski esterilizada;
7.2.6 Incubar as culturas a 25 2 C, no escuro, de 48 horas a 72 horas, e contar o
nmero de colnias crescidas;
7.2.7 Incubar em BOD a 25 2 C, no escuro, novamente as culturas at 7 dias para
verificar se as colnias formadas so realmente de Trichoderma, por meio da
visualizao da colnia na placa e das estruturas do fungo em microscpio ptico.
7.2.8 Para observar em microscpio ptico as estruturas do fungo, deve-se com colocar
a parte adesiva da fita adesiva transparente sobre a colnia desenvolvida na placa de
Petri com meio de BDA + T e transferir a fita para uma lmina de microscopia, com o
lado adesivo sobre a lmina. Observar a estrutura do fungo (geralmente, conidiforos e
condios) em microscpio ptico em aumento entre 200 a 500X. Para confirmar se a
estrutura observada de Trichoderma utilizar livros ou sites de identificao de fungos,
como: Barnett, H. L. & Hunter, B. B. 1998. Illustrated genera of imperfect fungi. APS
Press, 1998.
8 - REPETIO
Devem ser feitas duas pesagens do produto (item 7.1.2), sendo que de cada pesagem
deve ser realizada uma diluio seriada (item 7.1.6). Das trs diluies selecionadas,
deve-se plaquear no mnimo cinco repeties por diluio (7.2.3).
22
24
Campo 1
Campo 2
E1
E2
E3
E4
E5
8. REPETIO
Devem ser feitas duas pesagens do produto, sendo que de cada pesagem deve ser
realizada uma srie de diluio seriada. A diluio selecionada, deve-se colocar na
cmara de Neubauer para contagem.
29
1. PRINCPIO
Este um mtodo quantitativo onde o resultado expresso em porcentagem de condios
viveis (germinados e ativos). Tem como base a dispensa de alquota da suspenso de
condios de Trichoderma em reas delimitadas da placa de Petri com meio de Batata,
Dextrose e Agar (BDA), incubao em temperatura adequada para a germinao dos
condios e contagem do nmero de condios viveis ao microscpio ptico.
2 APLICAO
Aplicvel aos produtos na formulao p-de-esporo que tem como ingrediente ativo
estruturas do fungo Trichoderma.
3 AMOSTRAGEM
A amostra encaminhada para anlise dever estar em embalagem comercial lacrada,
contendo as seguintes informaes: formulao, concentrao do ingrediente ativo,
nmero do lote, data de fabricao, data de validade, nome do produto, nome da
empresa, responsvel tcnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de
armazenamento. No laboratrio, as amostras podem ser armazenadas a temperatura
ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou cmara fria. As amostras nunca devem
ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princpios microbiolgicos
estabelecidos. Desta forma, as amostras sero representativas do produto a ser
analisado.
4 EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS
- Erlenmeyer com capacidade para 250 mL;
- Tubos de ensaio de 25 mL;
- Estante para tubos de ensaio;
- Autoclave;
- Balana semi analtica com faixa de trabalho de 1 a 2000 g;
- Agitador de tubo de ensaio;
- Banho de ultrassom com aquecimento e frequncia de 40 kHz;
- Agitador orbital para Erlenmeyer;
- Incubadora operando 25 2 C (BOD);
- Micropipeta de 10 mL, 15 L e 1000 L;
- Ponteiras esterilizadas para micropipeta de 10 mL, 15 L e 1000 L;
- Placas de Petri descartvel esterilizadas;
- Agitador magntico;
31
- Barra magntica.
5 SOLUES
Soluo salina com Tween 80 (diluente):
Ingredientes:
- NaCl P.A.: 9,0 g;
- gua destilada: 1.000 mL;
-Tween 80: 1 mL
Preparo:
Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 mL de gua destilada e
acrescentar Tween 80 (0,1%). Misturar bem e autoclavar o diluente a 121 C e a 1 atm
por 20 minutos.
Azul de Lactofenol
Ingredientes:
- Fenol: 20 g;
- cido ltico: 20 g;
- gua destilada: 20 g;
- Glicerol: 40 g;
- Azul de metila (ou azul de algodo ou azul de Trypan): 0,1 g
Preparo:
Adicionar os ingredientes em um frasco e homogeneizar durante 5 minutos em agitador
magntico dentro de capela de exausto de gases.
6 - MEIO DE CULTURA
Meio de Batata Dextrose Agar (BDA):
Ingredientes:
-Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendao do fabricante;
-gua destilada: 1000 mL;
Preparo:
Em frascos de Erlenmeyer misturar a gua destilada ao meio de Batata Dextrose Agar e
autoclavar a 121 C a 1 atm por 20 minutos. Verter aproximadamente 10 mL do meio
por placa descartvel esterilizada. Depois de solidificado o meio, as placas devem ser
invertidas e incubadas a 25 2 C por uma noite para secar e para avaliar a condio de
esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA podem ser estocadas em local
escuro e sob refrigerao (2-8 C) por sete dias.
32
Deve ser realizado o clculo para cada gota de cada pesagem de cada diluio,
separadamente. Posteriormente, obter a mdia aritmtica de cada pesagem.
Condio germinado
Condio ativo no
germinado
Condio inativo
35
10. LIMPEZA
Antes de realizar e aps o trmino da metodologia, a cmara de fluxo laminar (ou o
local onde ser realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida
em lcool 70 % e depois em hipoclorito 2%.
11. GLOSSRIO
Condio: estrutura no sexual de reproduo de fungos.
Condio ativo ou em processo de germinao: o condio que aumentou de tamanho
em relao ao no germinado, mas que ainda no emitiu tubo germinativo.
36
Condio germinado: o condio apresenta tubo germinativo com pelo menos o mesmo
comprimento que o tamanho do condio.
Condios inativos: condios no viveis.
Condios no germinados: condios que podem ou no estar viveis, porm no
formou tubo germinativo com pelo menos o mesmo comprimento que o tamanho do
condio.
Condios viveis: so os condios ativos e os germinados.
Conidiforo: estrutura do fungo produtora de condios.
Grnulos: tipo de formulao de produto biolgico em forma de grnulos que se
desfazem na presena de gua.
P-molhvel: tipo de formulao de produto biolgico composta pelo ingrediente ativo
e inerte que permita a mistura com gua, formando suspenses dotadas de grande
estabilidade.
Ingredientes:
-Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendao do fabricante;
-gua destilada: 1000 mL;
Preparo:
Em frascos de Erlenmeyer misturar a gua destilada ao meio de Batata Dextrose Agar e
autoclavar a 121 C a 1 atm por 20 minutos. Verter aproximadamente 10 mL do meio
por placa descartvel esterilizada. Depois de solidificado o meio, as placas devem ser
invertidas e incubadas a 25 2 C por uma noite para secar e para avaliar a condio de
esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA podem ser estocadas em local
escuro e sob refrigerao (2-8 C) por sete dias.
Meio de Batata Dextrose Agar com adio de Triton (BDA + T):
Ingredientes:
-Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendao do fabricante;
-gua destilada: 1000 mL;
-Triton X-100: 25 g;
Preparo:
O modo de preparo do meio deve seguir a recomendao do fabricante. Em frascos de
Erlenmeyer misturar a gua destilada e Triton X-100 (redutor de colnia) ao meio de
Batata Dextrose Agar e autoclavar a 121 C a 1 atm por 20 minutos. Verter
aproximadamente 20 mL por placa descartvel esterilizada. Depois de solidificado o
meio, as placas devem ser invertidas e incubadas a 25 2 C por uma noite para secar e
para avaliar a condio de esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA+T
podem ser estocadas em local escuro e sob refrigerao (2-8 C) por sete dias.
Observao: todas as vidrarias e solues devem ser esterilizadas em autoclave antes
de serem utilizadas.
7 PROCEDIMENTO
7.1 TESTE DE MICROGOTAS:
7.1.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas temperatura ambiente por 30
a 40 minutos antes do incio da anlise.
7.1.2 Pesar 0,1 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250mL e completar para
99,9 g com soluo salina com 0,1% (corresponde s diluies 10 -3). Devem ser
realizadas duas pesagens para cada amostra e duas sries de diluies para cada
39
pesagem (item 8). A segunda pesagem deve ser realizada 10 minutos aps a colocao
de gua na primeira amostra para evitar maior tempo de hidratao.
7.1.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspenso em agitador orbital por 60 minutos a 90
rpm.
7.1.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspenso em banho de ultrassom, por 5 minutos. O
nvel de gua do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspenso contida no
Erlenmeyer.
7.1.5 Misturar o contedo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e
tirando trs vezes do aparelho quando observar o turbilhonamento da suspenso. Ou
colocar em agitador magntico por 5 minutos.
7.1.6 Transferir 1,0 mL da suspenso contida no Erlenmeyer (10-3), com auxlio de
micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 mL de
diluente (10-4). Descartar a ponteira em seguida.
7.1.7 Homogenizar o contedo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando trs
vezes do aparelho at ser observado o turbilhonamento da suspenso, em cada uma das
passagens.
7.1.8 Para obter a diluio 10-5 repetir os itens 7.1.6 e 7.1.7 (diluio seriada), utilizando
o tubo da diluio anterior (10-4). Proceder assim repetidamente at alcanar a diluio
apropriada para contagem de condios (Tabela 1). Para cada diluio deve-se trocar a
ponteira da micropipeta.
Tabela 1. Mximo de diluio seriada que deve ser realizado para obteno da diluio
apropriada.
Informao do fabricante
105
106
107
108
109
1010
1011
1012
Diluir at
10-6
10-7
10-8
10-9
10-10
10-11
10-12
10-13
7.1.9 Riscar com caneta de retroprojetor a base das placas contendo meio BDA,
dividindo-as em 4 quadrantes.
40
Figura 1. Placa de Petri com meio de Batata Dextrose e Agar dividida em 4 quadrantes
com trs alquotas de 20L da diluio seriada referente a marcao da placa.
7.1.12 Os tubos com as diluies devem ser guardados sobre refrigerao (2-8 C) por
no mximo 48 horas para serem utilizados no teste de unidade formadora de colnia;
7.1.13 Esperar para que os 20L de cada diluio sejam absorvidos no meio de cultura e
transferir as placas em BOD, por 24 a 48 horas, 25 2 C, no escuro, antes de continuar
o procedimento;
7.1.14 Observar quais as diluies houve o crescimento de colnias de Trichoderma e
selecionar as trs ltimas diluies que apresentaram o crescimento do fungo nas trs
gotas das duas pesagens realizadas para a realizao do teste de unidade formadora de
colnia.
7.2 TESTE DE UNIDADE FORMADORA DE COLNIA (UFC):
7.2.1 Retirar os tubos de cultura com as diluies seriadas da refrigerao por 30 a 40
minutos antes do incio da anlise.
7.2.2 Misturar o contedo dos tubos de cultura com as diluies escolhidas em agitador
para tubos de ensaio colocando e tirando trs vezes. O tubo deve ser retirado quando
ocorrer o turbilhonamento;
7.2.3 Transferir de cada diluio apropriada, com uma micropipeta estril, 100L para a
superfcie de cinco placas de Petri com meio de Batata Dextrose Agar com adio de
Triton;
41
7.2.4 A diluio distribuda uniformemente sobre a superfcie do meio com uma ala
de Drigalski esterilizada, imediatamente aps a transferncia. Para cada grupo de cinco
placas utilizar uma ala de Drigalski.
7.2.5 Fazer uma placa controle antes de iniciar o item 7.2.3, espalhando 100L da
soluo salina com Tween em placa com meio de Batata Dextrose Agar com adio de
Triton com ala de Drigalski esterilizada;
7.2.6 Incubar as culturas a 25 2 C, no escuro, de 48 horas a 72 horas, e contar o
nmero de colnias crescidas;
7.2.7 Incubar em BOD a 25 2 C, no escuro, novamente as culturas at 7 dias para
verificar se as colnias formadas so realmente de Trichoderma, por meio da
visualizao da colnia na placa e das estruturas do fungo em microscpio ptico.
7.2.8 Para observar em microscpio ptico as estruturas do fungo, deve-se com colocar
a parte adesiva da fita adesiva transparente sobre a colnia desenvolvida na placa de
Petri com meio de BDA + T e transferir a fita para uma lmina de microscopia, com o
lado adesivo sobre a lmina. Observar a estrutura do fungo (geralmente, conidiforos e
condios) em microscpio ptico em aumento entre 200 a 500X. Para confirmar se a
estrutura observada de Trichoderma utilizar livros ou sites de identificao de fungos,
como: Barnett, H. L. & Hunter, B. B. 1998. Illustrated genera of imperfect fungi. APS
Press, 1998.
8 - REPETIO
Devem ser feitas duas pesagens do produto (item 7.1.2), sendo que de cada pesagem
deve ser realizada uma diluio seriada (item 7.1.6). Das trs diluies selecionadas,
deve-se plaquear no mnimo cinco repeties por diluio (7.2.3).
42
43
11. LIMPEZA
Antes de realizar e aps o trmino da metodologia, a cmara de fluxo laminar (ou o
local onde ser realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida
em lcool 70 % e depois em hipoclorito 2%.
44
Wagner Bettiol
Embrapa Meio Ambiente, Rod. SP 340, km 127,5 Caixa Postal 69, Tanquinho Velho, 13.820-000
Jaguarina, SP. bettiol@cnpma.embrapa.br
Marcelo Augusto Boechat Morandi
Embrapa Meio Ambiente, Rod. SP 340, km 127,5 Caixa Postal 69, Tanquinho Velho, 13.820-000
Jaguarina, SP. mmorandi@cnpma.embrapa.br
Zayame Vegette Pinto
Embrapa Meio Ambiente, Rod. SP 340, km 127,5 Caixa Postal 69, Tanquinho Velho, 13.820-000
Jaguarina, SP. zayame@cnpma.embrapa.br
Rosely Nascimento
Embrapa Meio Ambiente, Rod. SP 340, km 127,5 Caixa Postal 69, Tanquinho Velho, 13.820-000
Jaguarina, SP. rosely@cnpma.embrapa.br
Elen Ribeiro dos Santos Agostini
Embrapa Meio Ambiente, Rod. SP 340, km 127,5 Caixa Postal 69, Tanquinho Velho, 13.820-000
Jaguarina, SP. elen@cnpma.embrapa.br
Cleusa Maria Mantovanello Lucon
Instituto Biolgico de So Paulo,
Av. Conselheiro Rodrigues Alves, 1252,
04014-002, So Paulo, SP. mantova@biologico.sp.gov.br
Ricardo Harakava
Instituto Biolgico de So Paulo,
Av. Conselheiro Rodrigues Alves, 1252,
04014-002, So Paulo, SP. harakava@biologico.sp.gov.br
Patrcia E. Haddad
Instituto Biolgico de So Paulo,
Av. Conselheiro Rodrigues Alves, 1252,
04014-002, So Paulo, SP. patriciaehaddad@yahoo.com.br
45