UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

INSTITUTO BIOMDICO
MIP - BACTERIOLOGIA

COLORAO DE GRAM

MTODO DE COLORAO DE GRAM

1) Objetivos
a-

Aprender a preparar esfregao de bactrias;

b-

Realizar a tcnica de Colorao de Gram;

c-

Aprender o fundamento do mtodo de colorao de Gram;

d-

Comparar a estrutura da parede celular das bactrias Grampositivas e Gram-negativas;

e-

Permitir a observao da morfologia bacteriana e fornecer

informaes a respeito do

comportamento do seu material

celular diante dos corantes de Gram.

2) Interpretao
O mecanismo da colorao de Gram se refere composio da
parede celular, sendo que as Gram-positivas possuem uma espessa
camada de peptideoglicano e cido teicico, e as Gram-negativas,
uma fina camada de peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma
camada composta por lipoprotenas, fosfolipdeos, protenas e
lipopolissacardeos. Durante o processo de colorao, o tratamento
com lcool-acetona extrai os lipdeos, da resultando uma porosidade

ou permeabilidade aumentada da parede celular das bactrias Gramnegativas.

Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CVI) pode ser retirado e as
bactrias Gram-negativas so descoradas. A parede celular das
bactrias gram-positivas, em virtude de sua composio diferente,
torna-se desidratada durante o tratamento com lcool-acetona, a
porosidade diminui, a permeabilidade reduzida e o complexo CVI
no pode ser extrado.
Outra

explicao

baseia-se

tambm

em

diferenas

de

permeabilidade entre os dois grupos de bactrias. Nas Grampositivas, o complexo CVI retido na parede aps tratamento pelo
lcool-acetona, o que causa, provavelmente, uma diminuio do
dimetro dos poros da camada de glicopeptdeo ou peptideoglicano da
parede celular. A parede das bactrias Gram-negativas permanece
com porosidade suficientemente grande, mesmo depois do tratamento
com lcool acetona, possibilitando a extrao do complexo CV-l.
3) Procedimentos:
a- Preparar esfregaos a partir de culturas puras de Escherichia
coli, Staphylococcus aureus e Serratia marcescens.
b- Corar os esfregaos pelo mtodo de colorao de Gram.
c- Observar ao microscpio ptico, sob imerso e identificar a
morfologia deste microrganismos e sua reao frente ao mtodo de
Gram.
4) Preparo do esfregao:

a- Pegar uma lmina limpa no recipiente, secar e flambar

rapidamente na chama do bico de Bunsen;
b- Identificar o lado da lmina onde ser feito o esfregao;
c- Flambar a ala bacteriolgica deix-la esfriar e colocar na lmina
uma gota de
soluo salina fisiolgica;
d- Flambar a agulha bacteriolgica, deixar esfriar prximo a chama,
abrir a placa com a cultura teste e tocar a colnia escolhida para
retirada da amostra,
e- Esfregar o material com movimentos de rotao da ala
bacteriolgica, para se obter um esfregao de forma oval, bem fino e
uniforme;
f- Deixar secar nas proximidades da chama;

g- Fixar o esfregao passando a lmina (lado oposto ao esfregao) 5

vezes na chama do bico de Bunsen (rapidamente).
5) Mtodo de Colorao de Gram:
1) Cobrir toda a lmina com soluo cristal violeta (corante roxo),
aguardar um minuto;
2) Lavar rapidamente em gua destilada;
3) Cobrir a lmina com soluo de Iugol (mordente) por um minuto;
4) Lavar em gua destilada;
5), Inclinar a lmina e gotejar lcool-acetona ou lcool absoluto (cerca
de 15 segundos). Lavar a lmina rapidamente em gua corrente;
6) Cobrir com fucsina de gram e aguardar 30 segundos;
7) Lavar a lmina em gua destilada e secar (sem esfregar);
8) Colocar uma gota de leo de cedro sobre a lmina e observar em
objetiva de imerso (IOOX).
RESULTADO:

bactrias Gram-positivas: roxo

bactrias Gram-negativas: rosa/vermelho

6) Observaes:

O descoramento para mais ou para menos resultante da incorreta

diferenciao pelo lcool-acetona.
A idade da cultura bacteriana tem Importncia fundamental na colorao
de Gram. Em culturas envelhecidas, clulas. Gram-positivas
freqentemente se tomam Gram-negativas.
Se houver um questionamento acerca da Gram-positividade ou da
Gram-negatividade da cultura, uma colorao de Gram paralela
aconselhvel. Para isto, deve-se usar culturas bacterianas conhecidas
como Gram-positivas, tal como Staphylococcus aureus e Gramnegativas, tal como Escherichia coli, como controles.

7) Resumo
Solues em ordem de
aplicao

Reao do aspecto das Reao do aspecto das

bactrias Grambactrias Grampositivas
negativas

Cristal violeta

Coradas em violeta

Soluo de Iugol

Formao do complexo Formao do complexo

CV-I no interior da clula, CV-I no interior da clula,
que permanece violeta
que permanece violeta

lcool-acetona

Coradas em violeta

Desidratao da parede Extrao dos lipdeos da

celular, diminuio da
parede celular, aumento
porosidade e da
da porosidade; o

permeabilidade; o
complexo CV-I no pode complexo CV-I removido
sair da clula,
da clula
que permanece violeta
Fucsina ou safranina

A clula adquire o
A clula no afetada,
corante, tornando-se
permanece violeta
vermelha

8) Bibliografia
Ribeiro, M. C.; Soares, M. M. S. R.; Microbiologia prtica: roteiro e
manual; Atheneu; 1993;
5-8pp.
Pelczar Jr, M. J.; Chan, E. C. S.; Krieg, N. R.; Microbiology: concepts
and applications; McGrawHill; 1993; 75-76 pp.