Departamento de Bioqumica

Instituto de Qumica USP

Apostila de protocolos

BIOQUMICA EXPERIMENTAL
QBQ 0316N
2013

Professores

Carlos Takeshi Hotta

Guilherme Menegon Arantes

Esta apostila foi desenvolvida originalmente por:

Bayardo B. Torres
Iolanda M, Cuccovia
Maria Tresa Machini Miranda
Pedro Soares de Arajo
Remo Trigoni Jr.
Sandro R. Marana

Prtica 1 Lise de clulas de levedura

Objetivos romper clulas de Saccharomyces cerevisiae.
Reagentes

Materiais

Aparelhos

gua destilada
clulas de levedura (fase log tardia)
etanol (EtOH)
100 mM fluoreto de -fenilmetilsulfonila
(PMSF) em EtOH
hipoclorito de sdio 20 g/l (gua
sanitria)
tampo fosfato 100 mM pH 7,0 com 5
mM EDTA (tampo de lise)

banho de gelo
prolas de vidro 0,5 mm
pipetadores
pipetas
provetas
suporte para tubos
tubos de centrfuga
tubos de ensaio
tubos Falcon

centrfuga
estufa
freezer
vrtice

Procedimento A Fracionamento celular

ATENO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.

Em um tubo de centrfuga com tampa colocar aproximadamente 1 g (peso mido) de clulas de

leveduras crescidas at a fase logartmica tardia
Adicionar 4 ml de tampo de lise
Ressuspender as clulas usando um vrtice
Adicionar 40 L de PMSF (100 mM) em etanol
Homogeneizar em vrtice
Adicionar suspenso 8 ml de prolas de vidro lavadas e secas
Agitar ininterruptamente em vrtice durante 1 min (processo de lise)
Resfriar em banho de gelo por 1 min
Repetir as operaes 7 e 8 por mais 4 vezes
Centrifugar a suspenso de clulas + prolas de vidro a 850g por 2 min
Remover cuidadosamente o sobrenadante evitar coletar o material precipitado passando-o para
um tubo Falcon limpo e identificado como LISADO
Manter o tubo LISADO em banho de gelo
Ressuspender o precipitado + prolas de vidro em 4 ml de tampo de lise
Adicionar 40 L de PMSF (100 mM) em etanol
Homogeneizar em vrtice
Repetir as etapas 10 a 15 por mais 2 vezes, reunindo os sobrenadantes no mesmo tubo LISADO
Usando uma proveta, determinar o volume do LISADO
Dividir o lisado em 3 alquotas de igual volume e transfer-las para tubos Falcon
Identificar os tubos com o nmero do grupo para armazenagem em freezer a 20oC

Procedimento B Lavagem das prolas de vidro (executado pelas tcnicas)

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.

Transferir as prolas de vidro para um erlenmeyer

Adicionar hipoclorito de sdio no erlenmeyer
Agitar algumas vezes durante 15 min
Descartar cuidadosamente o hipoclorito de sdio (2x)
Adicionar gua no erlenmeyer
Lavar as prolas
Descartar cuidadosamente a gua
Repetir as etapas 6 a 8 por mais 5 vezes
Adicionar etanol no erlenmeyer
Colocar o erlenmeyer numa estufa e aguardar a secagem das prolas
2

Prtica 2 Dosagem de protena

Objetivos dosar colorimetricamente protenas no lisado de Saccharomyces cerevisiae.
Reagentes
gua destilada
albumina 0,2 g/l
lisado de leveduras (P1)
reagente de Bradford (cido fosfrico
85%, Coomassie Blue G, metanol)

Materiais
papel de filtro
cubetas para leitura
pipetadores
pipetas
ponteiras
suporte para tubos
tubos de ensaio

Aparelhos
espectrofotmetro
vrtice

Procedimento A Curva-padro de protena

1. Adicionar em cada tubo os volumes de albumina e gua estipulados na Tabela 1
2. Adicionar o reagente de Bradford
3. Homogeneizar em vrtice
4. Aguardar 5 minutos com os tubos em temperatura ambiente
5. Usar o branco para calibrar (zerar) o espectrofotmetro
6. Ler as absorbncias a 595 nm
7. Completar a Tabela 2
8. Construir a curva-padro para deteco de protenas com reagente de Bradford

tubos

Branco
1
2
3
4
5
6
7
8

tubos

Tabela 1
Albumina
gua
0,2 g/l (l)
(l)
0
10
20
30
40
50
60
70
80

100
90
80
70
60
50
40
30
20
Tabela 2
Massa de
protena (mg)

Reagente de
Bradford
(ml)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0

A595

1
2
3
4
5
6
7
8

Procedimento B Dosagem de protenas no lisado de Saccharomyces cerevisiae

OBSERVAO: para esse procedimento necessrio que o lisado seja diludo. Para isso segue o
procedimento para diluio 100x:
1. Transferir 0,1 ml do lisado para um tubo de ensaio grande identificado como L100X
2. Adicionar 9,9 ml de gua destilada.
3. Homogeneizar em vrtice.
1. Adicionar em cada tubo os volumes de gua e amostras do lisado diludo estipulados na Tabela 3
2. Adicionar o reagente de Bradford
3. Homogeneizar em vrtice
4. Aguardar 5 minutos com os tubos em temperatura ambiente
5. Usar o branco para calibrar (zerar) o espectrofotmetro
6. Ler as absorbncias a 595 nm
7. Completar a Tabela 4
OBSERVAO: Caso a absorbncia das amostras experimentais esteja fora dos limites das absorbncias
obtidas na curva-padro, discuta com o professor ou monitor um novo valor de diluio.
Tabela 3
tubos
Branco
A1
A2
A3
A4

L100x
(l)
0
100
50
30
20

gua
(l)
100
0
50
70
80

Reagente de
Bradford (ml)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0

Tabela 4
tubos

A595

A1
A2
A3
A4

Prtica 3 Determinao da atividade enzimtica

Objetivos determinar a atividade da -glicosidase no lisado de Saccharomyces cerevisiae.
Reagentes
gua destilada
lisado de leveduras (P1)
8 mM p-nitrofenil--glicosdeo (NPGlc)
em gua
tampo fosfato 200 mM (pH 7,0)
tampo carbonato-bicarbonato 250 mM
(pH 11,0)

Materiais
banho de gelo
microplacas de 96 poos
pipetadores
pipetas
ponteiras
suportes para tubos de ensaio
tubos de ensaio

Aparelhos
banho a 30oC
espectrofotmetro de
microplacas
vrtice

Procedimento A diluio do lisado de Saccharomyces cerevisiae

ATENO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO
Abaixo segue o procedimento sugerido para a diluio da preparao do lisado de Saccharomyces
cerevisiae.
1. Transferir 0,2 ml do lisado de Saccharomyces cerevisiae para um tubo identificado como L10X
2. Adicionar 1,8 ml de gua destilada gelada e homogeneizar suavemente
3. Transferir 0,4 ml de L10X para um novo tubo identificado como L50X
4. Adicionar 1,6 ml de gua destilada gelada e homogeneizar suavemente
5. Transferir 0,2 ml de L50X para um novo tubo identificado como L500X
6. Adicionar 1,8 ml de gua destilada gelada e homogeneizar suavemente
7. Manter todos os tubos no gelo

Procedimento B determinao da atividade da -glicosidase

ATENO! Este procedimento deve ser feito para cada uma das diferentes diluies do lisado que foram
preparadas.
Todos estes ensaios podem ser montados simultaneamente, iniciando o procedimento sempre pela adio
do substrato.
Somente quando todos os tubos j tiverem recebido o substrato dever ser iniciada a adio das diferentes
diluies de lisado.
1. Preparar os tubos em banho de gelo
2. Adicionar em cada tubo os volumes de NPGlc estipulados na Tabela 1
3. Adicionar em cada tubo o lisado devidamente diludo
4. Transferir simultaneamente todos os tubos para o banho a 30oC
5. Incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela 1
6. Ao remover cada tubo, interromper a reao enzimtica adicionando 2 ml de tampo carbonatobicarbonato pH 11,0
7. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente
8. Colocar 100 l de cada tubo em trs pocinhos da sua microplaca de 96 poos, no se esquea de anotar
a posio de cada tubo
9. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbncias a 420 nm no leitor de microplacas
10. Completar as Tabelas 2 a 4

Tabela 1
tubos
8 mM
tampo
NPGlc (ml) fosfato pH 7,0
(ml)
1
0,1
0,1
2
0,1
0,1
3
0,1
0,1
4
0,1
0,1
Branco de enzima
Branco de substrato*
0,2
0,2
* preparar somente um tubo
Tabela 2 L10x
tubos
rplica 1
rplica 2
(A420)
(A420)

lisado diludo
(ml)
0,2
0,2
0,2
0,2
0,4
-

tempo de
incubao a
30 oC (min)
5
10
15
20
20
-

rplica 3
(A420)

mdia
(A420)

1
2
3
4
Branco de enzima
Branco de substrato
tubos

rplica 1
(A420)

Tabela 3 L50x
rplica 2
(A420)

rplica 3
(A420)

mdia
(A420)

rplica 1
(A420)

Tabela 4 L500x
rplica 2
(A420)

rplica 3
(A420)

mdia
(A420)

1
2
3
4
Branco de enzima
Branco de substrato
tubos
1
2
3
4
Branco de enzima
Branco de substrato

Curva padro do NPGlc

1.4
1.2

Abs 420 nm

1
0.8
0.6
y = 0.0049x + 0.014
R = 0.9974

0.4
0.2
0
0

50

100

150
200
NPGlc (nmol)

250

300

Prtica 4 Caracterizao da enzima pH timo

Objetivos Determinar o efeito do pH na atividade cataltica da -glicosidase.
Reagentes
gua destilada
lisado de leveduras (P1)
8 mM p-nitrofenil--glicosdeo (NPGlc)
em gua
tampo borato 200 mM (pH 8,0)
tampo borato 200 mM (pH 9,0)
tampo citrato 200 mM (pH 4,0)
tampo citrato 200 mM (pH 5,0)
tampo citrato 200 mM (pH 6,0)
tampo carbonato-bicarbonato 250 mM
(pH 11,0)

Materiais
banho de gelo
microplacas de 96 poos
pipetadores
pipetas
ponteiras
suportes para tubos de ensaio
tubos de ensaio

Aparelhos
banho a 30oC
espectrofotmetro de
microplacas
vrtice

Procedimento A diluio do lisado de Saccharomyces cerevisiae

Deve ser dada preferncia para a diluio que gerou a melhor medida de atividade enzimtica na prtica
anterior.
Caso no seja possvel utiliz-la, abaixo segue o procedimento sugerido para a diluio da preparao do
lisado de Saccharomyces cerevisiae
1. Transferir 0,2 ml do lisado de Saccharomyces cerevisiae para um tubo identificado com L10X
2. Adicionar 1,8 ml de gua destilada gelada e homogeneizar suavemente
3. Transferir 0,1 ml de L10X para um novo tubo identificado com L100X
4. Adicionar 4,9 ml de gua destilada gelada e homogeneizar suavemente
5. Manter no gelo

Procedimento B Ensaio da atividade enzimtica

1. Realizar os ensaios de atividade enzimtica sobre p-nitrofenil--glicosdeo (NP Glc) em 6 diferentes
valores de pH
2. Preparar em banho de gelo, para todos os tampes diferentes, um conjunto de tubos para os ensaios de
atividade de acordo com a Tabela 1
3. Misturar cuidadosamente
4. Adicionar o lisado (devidamente diludo) de Saccharomyces cerevisiae
5. Agitar manualmente com cuidado
6. Transferir todos os tubos do gelo ao mesmo tempo para um banho a 30oC
7. Incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela 1
8. Ao retirar cada tubo do banho, interromper a reao enzimtica pela adio de 2 ml de tampo
carbonato-bicarbonato
9. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente
10. Colocar 100 l de cada tubo em trs pocinhos da sua microplaca de 96 poos, no se esquea de anotar
a posio de cada tubo
11. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbncias a 420 nm no leitor de microplacas
12. Completar as Tabelas 2, 3 e 4
13. Determinar graficamente o pH timo da -glicosidase

pH = ________________________
Tabela 1
tubos

8 mM NPGlc
(ml)

1
2
3
4

0,1
0,1
0,1
0,1

Tampo _____
pH ____
(ml)
0,1
0,1
0,1
0,1

lisado diludo
(ml)

tempo
(min)

0,2
0,2
0,2
0,2

5
10
15
20

Tabela 2

Tubos

rplica 1
(A420)

pH = 4,0
rplica 2
(A420)

rplica 3
(A420)

Mdia
(A420)

1
2
3
4

Tubos

rplica 1
(A420)

pH = 5,0
rplica 2
(A420)

rplica 3
(A420)

Mdia
(A420)

rplica 1
(A420)

pH = 8,0
rplica 2
(A420)

rplica 3
(A420)

Mdia
(A420)

1
2
3
4

Tabela 3

Tubos

rplica 1
(A420)

pH = 6,0
rplica 2
(A420)

rplica 3
(A420)

Mdia
(A420)

1
2
3
4

Tubos
1
2
3
4

Tabela 4

Tubos

rplica 1
(A420)

pH = 9,0
rplica 2
(A420)

rplica 3
(A420)

Mdia
(A420)

1
2
3
4

Tratamento de dados e anlise dos resultados para o relatrio 1

Prtica 1 Lise de clulas de levedura
Prtica 2 Dosagem de protena
Prtica 3 Determinao da atividade enzimtica
Prtica 4 Caracterizao da enzima pH timo
O relatrio dever conter as seguintes informaes:
1. A concentrao de protenas no lisado (mg/ml) e a quantidade total de protenas obtidas (mg). Para
obter esta informao ser necessrio calcular:
a) Plotar a curva padro da concentrao de protena pela Abs595nm
b) Calcular a equao da reta para o grfico plotado
c) A concentrao de protenas (mg/ml) no L100x
d) A concentrao de protenas (mg/ml) no lisado inicial
2. A concentrao da atividade enzimtica (mU/ml) e no lisado em pH 7,0. Para obter esta informao
ser necessrio calcular:
a) Converter a Abs420nm em concentrao de NPGlc (mM)
b) Plotar um grfico com a concentrao de NPGlc (mM) pelo tempo para cada concentrao de
lisado
c) Calcular a equao da reta para o grfico plotado
d) Utilizar a equao da reta para calcular a atividade enzimtica (mU) de cada concentrao de lisado
e) Calcular a concentrao da atividade enzimtica (mU/ml) do lisado original, no se esquea de
corrigir pela diluio
f) Calcular a atividade especfica do lisado (mU/mg)
3. O grfico com a concentrao a atividade enzimtica (mU/ml) em diversos pH. Para obter esta
informao ser necessrio calcular:
a) Converter a Abs420nm em concentrao de NPGlc para cada pH
b) Plotar o grfico do aumento da concentrao de NPGlc ao longo do tempo para cada pH
c) Calcular a equao da reta para o grfico plotado
d) Utilizar a equao da reta para calcular a atividade enzimtica em cada pH
e) Calcular a atividade enzimtica relativa em cada pH. A atividade enzimtica relativa a
porcentagem da atividade enzimtica em cada pH em relao maior atividade enzimtica
observada (incluir as medidas da P3 em pH 7,0 na anlise)
f) Plotar um grfico com a atividade enzimtica relativa pelo pH do tampo
Alm disso, o relatrio dever conter as respostas das seguintes perguntas:
a) Qual a razo de se manter o lisado em gelo?
b) Por que foi adicionado 100 mM PMSF ao tampo de lise?
c) Qual a razo de se usar um branco ao utilizar o espectrofotmetro?
d) Por que se utiliza NPGlc para medir a atividade enzimtica da -glicosidase?
e) Qual a razo de se utilizar um branco do substrato e um branco da enzima?
f) Em qual pH a atividade da enzima deve ser mxima? Como o pH de um tampo pode influenciar na
atividade enzimtica?

Prtica 5 Purificao de protenas cromatografia de troca inica

Objetivos Isolar a -glicosidase utilizando resina de troca inica.

Procedimento A Hidratao da DEAE-Sephadex (executado pelas tcnicas)

Pesar 0,5 g de DEAE-Sephadex em um bquer
1. Adicionar 100 ml de tampo fosfato 10 mM pH 6,8
2. Misturar bem utilizando um basto de vidro
3. Decantar de um dia para o outro

Procedimento B Montagem da coluna de troca inica (executado pelas

tcnicas)
Montagem da coluna
1. Utilizar o barril de uma seringa (20 ml) como suporte da resina
2. Prender a seringa em um suporte
3. Colocar um pouco de l de vidro no seu interior
4. Compactar a l de vidro na base utilizando um basto de vidro
5. Lavar a coluna com gua destilada para retirar fragmentos de l de vidro
6. Adaptar uma mangueira de aproximadamente 6 cm na sada da pipeta
7. Fechar a mangueira com uma presilha

Processo de empacotamento
8. Fechar a presilha
9. Homogeneizar com um basto de vidro a suspenso contendo a resina (Procedimento A)
10. Adicionar a suspenso at a marca de 1,0 ml
11. Deixar decantar
12. Repetir essa operao at a resina sedimentada ocupar o interior da seringa at 1,0 ml
13. Com a resina empacotada, lav-la com 20 ml de tampo fosfato 10 mM sem NaCl
14. Aps a lavagem, fechar a presilha
15. Deixar 3 mm de tampo acima do topo da resina
16. NUNCA DEIXAR A RESINA SECAR

10

Procedimento C Cromatografia de troca inica

Preparao da amostra
1. Descongelar o lisado, transferir uma alquota de 1,0 ml para um tubo tipo eppendorf e centrifugar a
10.000 g por 13 s. Coletar o sobrenadante para usar nas etapas abaixo.
2. Parte de material (0,4 ml) ser usada na cromatografia abaixo, enquanto que o restante (0,6 ml) dever
ser guardado (congelado) para os prximos passos.

Preparao da coluna
3. Diluir 0,4 ml do sobrenadante do lisado (ver etapa anterior) adicionando 0,6 ml de tampo fosfato 10
mM sem NaCl. muito importante que apenas o sobrenadante do lisado seja usado para evitar
entupimento da coluna.
4. Verificar se a presilha est fechada.
5. Utilizar uma pipeta para transferir toda a amostra (devidamente diluda) homogeneamente para a
coluna.
6. Colocar o tubo 1 na sada da coluna e abrir a presilha.
7. Deixar a amostra escoar pela coluna at cerca de 3 mm acima do topo da resina.
8. Fechar a presilha e transferir o tubo 1 para o gelo.

Eluio das protenas no retidas pela coluna

9. Adicionar cuidadosamente tampo fosfato sem NaCl (2 ml)
10. Colocar o tubo 2 na sada da coluna e abrir a presilha permitindo que o tampo flua pela resina
11. Coletar 1 ml em cada tubo de ensaio
12. Trocar o tubo de ensaio e sempre adicionar mais 1 ml de tampo
13. Fechar a presilha ao final da coleta do tubo 8
14. Adicionar cuidadosamente mais 1,0 ml de tampo. Assim, acima da resina dever haver 2,0 ml de
tampo
15. Coletar mais dois tubos, sem adicionar tampo
16. Ao final da coleta do tubo 10, o tampo dever estar cerca de 3 mm acima do topo da resina

Eluio das protenas retidas pela coluna

17. Adicionar cuidadosamente tampo fosfato com NaCl (2,0 ml)
18. Abrir a presilha e permitir que o tampo flua pela resina
19. Coletar 1,0 ml em cada tubo de ensaio
20. Trocar o tubo de ensaio e sempre adicionar mais 1 ml de tampo
21. Fechar a presilha ao final da coleta do tubo 18
22. Adicionar 1,0 ml de tampo. Assim, acima da resina dever haver 2,0 ml de tampo
23. Coletar mais dois tubos, sem adicionar tampo
24. Fechar a presilha ao final da coleta do tubo 20. No deixar a coluna secar

11

Procedimento D Identificao das fraes que contm a -glicosidase

ATENO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO
1. Preparar um conjunto de tubos numerados de 1 a 20. Adicionar em cada tubo 0,2 ml de 4mM NPGlc
2. Transferir os tubos em banho de gelo
3. Adicionar em cada um destes tubos 0,2 ml das fraes coletadas durante a cromatografia
4. Transferir todos os tubos ao mesmo tempo para um banho de 30oC
5. Incubar os tubos por 10 min
6. Ao remover os tubos, adicionar em cada um 2 ml de tampo carbonato-bicarbonato pH 11,0
7. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente
8. Colocar 100 l de cada tubo em trs pocinhos da sua microplaca de 96 poos
9. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbncias a 420 nm no leitor de microplacas
7. Completar a Tabela 1
8. Construir um grfico Absorbncia versus nmeros dos tubos
9. Uma vez identificados os tubos que contm atividade enzimtica, reunir as fraes (eludas na
cromatografia) correspondentes em um tubo Falcon identificado como MATERIAL DEAE nmero do
grupo
Tabela 1
tubos
A420
tubos
A420
1
11
2
12
3
13
4
14
5
15
6
16
7
17
8
18
9
19
10
20

Procedimento E Determinao da atividade enzimtica do lisado de S.

cerevisiae
ATENO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO
Todos os tubos deste ensaio podem ser montados simultaneamente, iniciando o procedimento sempre
pela adio do substrato. Somente quando todos os tubos j tiverem recebido o substrato dever ser
iniciada a adio do sobrenadante do lisado previamente diludo.
1. Diluir o sobrenadante do lisado (utilizar a diluio escolhida na P3)
2. Adicionar em cada tubo os volumes de NPGlc estipulados na Tabela 2
3. Adicionar em cada tubo o sobrenadante do lisado devidamente diludo
4. Transferir todos os tubos ao mesmo tempo para o banho a 30oC
5. Incubar os tubos pelos intervalos de tempos indicados na Tabela 2
6. Ao remover cada tubo, interromper a reao enzimtica adicionando 2 ml de tampo carbonatobicarbonato pH 11,0
7. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente
8. Colocar 100 l de cada tubo em trs pocinhos da sua microplaca de 96 poos
9. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbncias a 420 nm no leitor de microplacas
10. Completar a Tabela 3
11. Com os dados obtidos determinar a concentrao de atividade enzimtica de -glicosidase(mU/ml)
presente no sobrenadante do lisado.
12

tubos

1
2
3
4
Branco da enzima
Branco do substrato

tubos

4 mM NPGlc
(ml)

Tabela 2
gua destilada
(ml)

lisado diludo
(ml)

0,2
0,2
0,2
0,2
0,2

0,2
0,2

0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
-

rplica 1
(A420)

Tabela 3
rplica 2
(A420)

rplica 3
(A420)

tempo de
incubao a
30 oC (min)
5
10
15
20
20
-

mdia
(A420)

1
2
3
4
Branco da enzima

Procedimento F Determinao da atividade enzimtica no material DEAE

Este procedimento pode ser feito junto com o procedimento E
1. Dilua o material DEAE, transferindo 0,2 ml do material DEAE e 1,8 ml de gua destilada para um tubo
identificado como DEAE-10X. Homogeneizar suavemente e manter no gelo
2. Adicionar em cada tubo de ensaio os volumes de NPGlc e material DEAE (diludo 10x) estipulados na
Tabela 4
3. Transferir todos os tubos ao mesmo tempo para um banho a 30oC e incubar os tubos pelos intervalos de
tempos indicados na Tabela 4
4. Ao remover cada tubo, interromper a reao enzimtica adicionando 2 ml de tampo carbonatobicarbonato pH 11,0
5. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente
6. Colocar 100 l de cada tubo em trs pocinhos da sua microplaca de 96 poos
7. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbncias a 420 nm no leitor de microplacas e completar
a Tabela 5
8. Calcular a atividade da -glicosidade no Material DEAE.
Tabela 4
tubos
4 mM NPGlc
Material DEAE
tempo de
(ml)
(diludo 10x)
incubao a
(ml)
30 oC (min)
1
0,2
0,2
5
2
0,2
0,2
10
3
0,2
0,2
15
4
0,2
0,2
20
Tabela 5
tubos
rplica 1
rplica 2
rplica 3
mdia
(A420)
(A420)
(A420)
(A420)
1
2
3
4

13

Procedimento G Dosagem de protenas do material DEAE

ATENO! O material DEAE usado neste procedimento no deve ser diludo
1. Adicionar em cada tubo os volumes de gua e material DEAE estipulados na Tabela 6
2. Adicionar o reagente de Bradford
3. Homogeneizar em vrtice e aguardar 5 minutos
4. Usar o branco para calibrar (zerar) o espectrofotmetro
5. Ler as absorbncias a 595 nm utilizando cubetas
6. Completar a Tabela 7

Tubos

Material DEAE
(ml)
0,1
0,1
0,1

Branco
1
2
3

Tubos

A595

Tabela 6
gua
(ml)
0,1
-

Tabela 7
Massa de protena
(mg)

Reagente de Bradford
(ml)
1,0
1,0
1,0
1,0

Volume de
amostra (ml)

Concentrao de
protena (mg/ml)

1
2
3

Procedimento H Dosagem de protenas do material DEAE

ATENO! O material DEAE usado neste procedimento no deve ser diludo
Este procedimento pode ser feito junto com o procedimento G
1. Diluir 20x o lisado obtido aps centrifugao. Transferir 0,1 ml do lisado para um tubo e adicionar 1,9 ml
de gua destilada
2. Adicionar em cada tubo os volumes de lisado diludo estipulados na Tabela 8
3. Homogeneizar em vrtice e aguardar 5 minutos
4. Usar o branco para calibrar (zerar) o espectrofotmetro
5. Ler as absorbncias a 595 nm utilizando cubetas
6. Completar a Tabela 9

Tubos

Material DEAE
(ml)
0,1
0,1
0,1

1
2
3

Tubos

A595

Tabela 8
gua
(ml)
-

Tabela 9
Massa de protena
(mg)

Reagente de Bradford
(ml)
1,0
1,0
1,0

Volume de
amostra (ml)

Concentrao de
protena (mg/ml)

1
2
3

14

Tratamento de dados e anlise dos resultados para o relatrio 2

Prtica 5 Purificao de protenas cromatografia de troca inica
O relatrio dever conter as seguintes informaes:
1. Um grfico contendo a atividade enzimtica medida na frao eluda pelo nmero do tubo coletado.
Indique o momento em que a coluna foi eluda com NaCl.
2. A atividade enzimtica (mU) total adiciona na coluna de cromatografia. Para obter esta informao,
ser necessrio calcular:
a) a concentrao de atividade enzimtica (mU/ml) de -glicosidase no lisado
3. A atividade especfica da -glicosidase (mU/mg) do lisado. Para obter esta informao, ser necessrio
calcular:
a) a concentrao de protenas (mg/ml) de -glicosidase no lisado
4. A atividade enzimtica (mU) total recuperada aps a passagem pela coluna de cromatografia. Para
obter esta informao, ser necessrio calcular:
b) a concentrao de atividade enzimtica (mU/ml) de -glicosidase no material DEAE
5. A atividade especfica da -glicosidase (mU/mg) do material DEAE. Para obter esta informao, ser
necessrio calcular:
b) a concentrao de protenas (mg/ml) de -glicosidase no material DEAE
6. O clculo da recuperao e o enriquecimento da -glicosidase aps a cromatografia de troca inica
a) A recuperao a proporo da atividade enzimtica total adicionada coluna de cromatografia
que foi recuperada no material DEAE
b) O enriquecimento quantas vezes a atividade especfica da -glicosidase aumentou aps a
passagem pela coluna de cromatografia (atividade especfica do material DEAE dividida pela
atividade especfica do lisado).

15

Prtica 6 Purificao de protenas SDS-PAGE

Objetivos Analisar a composio de protenas do material eludo na cromatografia de troca-inica que
contm atividade de -glicosidase.

Reagentes
tampo de amostra
gua
soluo C
glicerol
100 g/l SDS
5 g/l azul de bromofenol
-mercaptoetanol

3,55 ml
1,25 ml
2,50 ml
2,00 ml
0,20 ml
0,05 ml

soluo de colorao
Coomassie blue R
metanol
cido actico
gua

0,1 g
40 ml
10 ml
50 ml

soluo de descolorao
metanol
cido actico
gua

40 ml
10 ml
50 ml

soluo A
acrilamida
NNbis metilenoacrilamida
gua

29,2 g
0,80 g
100 ml

soluo B
1,5 M Tris
(acertar valor de pH com HCl)

pH 8,8

soluo C
0,5 M Tris
(acertar valor de pH com HCl)

pH 6,8

tampo de corrida
tris
3,03 g
glicina
14,4 g
100 g/l SDS
1,0 g
gua
1L
Obs.: No acertar o pH desta soluo tampo

Procedimento A preparao das amostras

1. Aplicar as seguinte amostras no gel de SDS-PAGE:
a. lisado de Saccharomyces cerevisiae (30 l)
b. fraes eludas na cromatografia de troca-inica e que contm alfa-glicosidase, denominado
Material DEAE (maior volume possvel at 1 ml)

Dilise das amostras

2. Transferir para um microtubo o volume indicado de amostra.
3. Identificar o microtubo com:
a.
Nome da amostra.
b.
Nmero do grupo.
4. Adicionar gua, caso necessrio, at completar 600 l
5. Cobrir o microtubo com um pedao de membrana de dilise
6. Prender a membrana de dilise com um anel de borracha
7. Transferir o microtubo para um suporte de isopor
8. Colocar o suporte dentro de um bquer contendo gua
9. Manter em agitao por pelo menos 16 h
16

Secagem a vcuo (executado pelas tcnicas)

10. Aps a dilise, transferir as amostras para um concentrador a vcuo
11. Secar as amostras
Desnaturao das protenas presentes nas amostras
12. Transferir para cada microtubo 20 l de tampo de amostra
13. Transferir os microtubos para um banho fervente
14. Incubar os microtubos por 5 min
15. Aplicar as amostras no gel de eletroforese com o auxlio de micropipetadores

Procedimento B preparao do gel de SDS-PAGE (feito pelas tcnicas)

Preparao do gel de separao
1. Adicionar em um tubo os volumes estipulados na Tabela 1
2. Homogeneizar rapidamente
3. Transferir a mistura, utilizando uma pipeta Pasteur, para as placas de vidro previamente montadas
4. Aguardar a polimerizao cerca de 60 min
5. Colocar o pente sobre entre as placas de vidro
Preparao do gel de empilhamento
6. Aps a polimerizao do gel de separao, adicionar em outro tubo os volumes estipulados na Tabela 2
7. Homogeneizar rapidamente
8. Transferir a mistura, utilizando uma pipeta Pasteur, para as placas de vidro (com o pente) contendo o
gel de separao polimerizado
9. Aguardar a polimerizao cerca de 40 min
10. Aps a polimerizao do gel de empilhamento, retirar cuidadosamente o pente
11. Adicionar o tampo de corrida
Tabela 1
solues
volume
gua
4,02 ml
100 g/l SDS
100 L
soluo A
3,33 ml
soluo B
2,5 ml
TEMED
5 L
persulfato de amnio
50 L
Tabela 2
solues
volume
gua
3,05 ml
100 g/l SDS
50 L
soluo A
0,65 ml
soluo C
1,25 ml
TEMED
5 L
persulfato de amnio
25 L

17

Procedimento C eletroforese, colorao e descolorao

1. Correr a eletroforese com 100V, durante aproximadamente 40 min
2. Desligar a fonte quando o corante marcador de frente atingir a base do gel
3. Desconectar os cabos
4. Retirar o gel
5. Colocar o gel no frasco contendo a soluo de colorao
6. Corar o gel por 40 min
7. Retirar o gel do frasco de colorao
8. Colocar o gel no frasco contendo a soluo de descolorao
9. Descorar o gel
10. Visualizar as bandas de protenas

Procedimento D desidratao do gel (opcional)

1. Colocar o gel num frasco contendo gua
2. Trocar tantas vezes quanto for necessrio a gua do frasco at a remoo completado cido actico
3. Retirar o gel hidratado do frasco com gua
4. Colocar o gel num frasco contendo soluo de glicerol 50 g/l
5. Molhar com a soluo de glicerol lminas de celofane natural
6. Dispor as folhas de celofane sobre placas limpas de vidro
7. Colocar os gis sobre as lminas de celofane devidamente hidratadas e limpas
8. Colocar outra folha de celofane previamente hidratada sobre o gel, formando assim um sanduche.
9. Retirar delicadamente as bolhas de ar que estiverem aprisionados pelas folhas de celofane
10. Esticar as folhas e prend-las
11. Deixar secar temperatura ambiente

Frmula estruturais e massas molares

18

Prtica 7 Caracterizao da glicosidase: Km e Vmax

Objetivos Caracterizar a -glicosidase de Saccharomyces cerevisiae atravs das determinaes da
afinidade (Km) da enzima pelo substrato (p-nitrofenol--glicosdeo) e da velocidade mxima (Vmax) de
hidrlise do substrato.

Reagentes

Materiais

Aparelhos

gua destilada
lisado de levedura
1,0 mM p-nitrofenil--glicosdeo (NPGlc)
em tampo fosfato 100 mM (pH 7,0)
2,0 mM NPGlc em tampo fosfato 100
mM (pH 7,0)
8,0 mM NPGlc em tampo fosfato 100
mM (pH 7,0)
tampo carbonato-bicarbonato 250 mM
(pH 11,0)
tampo fosfato 100 mM (pH 7,0)

banho de gelo
microplacas de 96 poos
pipetadores
pipetas
ponteiras
suportes para tubos de
ensaio
tubos de ensaio

banho a 30oC
espectrofotmetro de
microplacas
vrtice

Procedimento A Diluio do lisado de Saccharomyces cerevisiae

ATENO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO
Utilize a diluio usada na Prtica 3. O volume total necessrio ser de 5,0 ml
1. Transferir 0,1 ml do lisado de Saccharomyces cerevisiae para um tubo identificado com L10X
2. Adicionar 0,9 ml de gua destilada gelada
3. Homogeneizar SUAVEMENTE
4. Transferir 0,5 ml de L10X para um novo tubo identificado com L100X
5. Adicionar 4,5 ml de gua destilada gelada
6. Homogeneizar SUAVEMENTE

Procedimento B Medidas de velocidade da reao de hidrlise do substrato

ATENO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO
1. Adicionar em cada tubo os volumes de NPGlc estipulados na Tabela 1. ATENO: prestar ateno nas
diferentes concentraes de substrato
2. Preparar os tubos em banho de gelo
3. Adicionar em cada tubo os volume de tampo e lisado (devidamente diludo) estipulados na Tabela 1.
Agitar manualmente com cuidado
4. Transferir todos os tubos do gelo para o banho a 30oC
5. Incubar todos os tubos por 40 min (OU PELO DOBRO DO MAIOR TEMPO USADO NA PRTICA 3)
6. Remover todos os tubos do banho
7. Adicionar 2 ml de tampo carbonato-bicarbonato
8. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente
9. Colocar 100 l de cada tubo em trs pocinhos da sua microplaca de 96 poos
10. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbncias a 420 nm no leitor de microplacas e
completar as Tabelas 2 e3
11. Construir os grficos necessrios para a determinao do Km e Vmax da -glicosidase para o substrato
utilizado
19

Tabela 1
tubos

1 mM NPGlc
(ml)

2 mM NPGlc
(ml)

8 mM NPGlc
(ml)

0,02
0,04
0,08
0,12
0,16
0,20
-

0,16
0,20
-

0,10
0,13
0,15

1
2
6
4
5
6
7
8
9
10
11

Tampo fosfato
100 mM pH 7
(ml)
0,28
0,26
0,22
0,18
0,14
0,10
0,14
0,10
0,20
0,17
0,15

Lisado diludo
(ml)
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10

Tabela 2
tubos

rplica 1
(A420)

rplica 2
(A420)

rplica 3
(A420)

mdia
(A420)

1
2
6
4
5
6
7
8
9
10
11

Tabela 3
tubos

[S] no tubo
de ensaio
(mM)

mdia
(A420)

Produto
(nmols)

Tempo de
reao (min)

Velocidade
(nmol/min)

1
2
6
4
5
6
7
8
9
10
11

20

Prtica 8 Caracterizao da glicosidase: determinao de padro de

inibio por maltose
Objetivos Determinar o padro de inibio de maltose sobre a hidrlise de p-nitrofenil--glicosdeo
(NPGlc) efetuada pela -glicosidase de Saccharomyces cerevisiae

Reagentes

Materiais

Aparelhos

gua destilada
lisado de levedura
1,0 mM p-nitrofenil--glicosdeo (NPGlc)
em tampo fosfato 100 mM (pH 7,0)
2,0 mM NPGlc em tampo fosfato 100
mM (pH 7,0)
8,0 mM NPGlc em tampo fosfato 100
mM (pH 7,0)
0,4 M maltose em tampo fosfato 100 mM
(pH 7,0)
1,2 M maltose em tampo fosfato 100 mM
(pH 7,0)
1,6 M maltose em tampo fosfato 100 mM
(pH 7,0)
tampo carbonato-bicarbonato 250 mM
(pH 11,0) em tampo fosfato 100 mM (pH
7,0)
tampo fosfato 100 mM (pH 7,0)

banho de gelo
microplacas de 96 poos
pipetadores
pipetas
ponteiras
suportes para tubos de ensaio
tubos de ensaio

banho a 30oC
espectrofotmetro
de microplacas
vrtice

Procedimento A Medidas da velocidade de reao de hidrlise do substrato na

presena de inibidor
ATENO! MANTENHA OS TUBOS DE ENSAIO EM GELO
1. Adicionar em cada tubo os volumes de NPGlc e maltose estipulados na Tabela 1. ATENO: prestar
ateno nas diferentes concentraes de substrato e inibidor
2. Adicionar em cada tubo os volume de tampo e lisado (devidamente diludo) estipulados nas Tabelas 1
(grupos pares) e 2 (grupos mpares).
3. . Agitar manualmente com cuidado.
4. Transferir todos os tubos do gelo para o banho a 30oC
5. Incubar todos os tubos pelo dobro do tempo usado na prtica 7
6. Remover todos os tubos do banho.
7. Adicionar 2 ml de tampo carbonato-bicarbonato.
8. Agitar manualmente e deixar os tubos em temperatura ambiente
9. Colocar 100 l de cada tubo em trs pocinhos da sua microplaca de 96 poos
10. Uma vez que a placa esteja preparada, ler as absorbncias a 420 nm no leitor de microplacas e
completar as Tabelas 3 e 4
11. Construir os grficos necessrios para a determinao do padro de inibio da -glicosidase por
maltose.

21

Tabela 1 (grupos pares)

tubos

1A
1B
2A
2B
3A
3B
4A
4B
5A
5B
6A
6B

1 mM
NPGlc
(ml)

2 mM
NPGlc
(ml)

8 mM
NPGlc
(ml)

0,4 M
maltose
(ml)

1,2 M
maltose
(ml)

0,08
0,08
0,20
0,20
-

0,16
0,16
0,20
0,20
-

0,10
0,10
0,15
0,15

0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10

Tampo
fosfato
100 mM
pH 7 (ml)
0,12
0,12
0,04
0,04
0,10
0,10
0,05
0,05

Lisado
diludo
(ml)

Tampo
fosfato
100 mM pH
7
(ml)
0,12
0,12
0,04
0,04
0,10
0,10
0,05
0,05

Lisado
diludo
(ml)

0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10

Tabela 2 (grupos mpares)

tubos

7A
7B
8A
8B
9A
9B
10A
10B
11A
11B
12A
12B

1 mM
NPGlc
(ml)

2 mM
NPGlc
(ml)

8 mM
NPGlc
(ml)

0,4 M
maltose
(ml)

1,2 M
maltose
(ml)

0,08
0,08
0,20
0,20
-

0,16
0,16
0,20
0,20
-

0,10
0,10
0,15
0,15

0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10

0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10
0,10

Tabela 3
tubos

[S] final
(mM)

[I] final
(mM)

rplica 1
(A420)

rplica 2
(A420)

rplica 3
(A420)

mdia
(A420)

1A
1B
2A
2B
3A
3B
4A
4B
5A
5B
6A
6B
22

Tabela 4
tubos

[S] final
(mM)

[I] final
(mM)

rplica 1
(A420)

rplica 2
(A420)

rplica 3
(A420)

mdia
(A420)

7A
7B
8A
8B
9A
9B
10A
10B
11A
11B
12A
12B

23

Tratamento de dados e anlise dos resultados para o relatrio 3

Prtica 6 Purificao de protenas SDS-PAGE
Prtica 7 Caracterizao da glicosidase: Km e Vmax
Prtica 8 Caracterizao da glicosidase: determinao de padro de inibio por maltose
O relatrio dever conter as seguintes informaes:
1. O provvel peso molecular da -glicosidase. Para obter esta informao, ser necessrio:
a) Identificar a banda correspondente -glicosidase no gel de SDS-PAGE.
b) Calcular o provvel peso molecular relativo da enzima atravs dos padres utilizados na
eletroforese.
2. O Km e o Vmax da -glicosidase. Para obter esta informao, ser necessrio:
a) Calcular a velocidade inicial (nmol/min) da reao em todos os tubos da P7
b) Construir um grfico de Michaelis-Menten para a -glicosidase (velocidade inicial pela
concentrao de substrato no tubo de ensaio).
c) Construir um grfico de Lineweaver-Burk (1/V pela 1/[S)]
d) Determinar Km e o Vmax da -glicosidase
3. Padro de inibio da -glicosidase pela maltose. Para obter esta informao, ser necessrio:
a) Calcular a velocidade inicial (nmol/min) da reao em todos os tubos da P8, inclua os dados dos
demais grupos
b) Construir grficos de Lineweaver-Burk na presena de concentraes diferentes de inibidor (1/V
pela 1/[S)]
c) Determine o padro de inibio da -glicosidase pela maltose.
Alm disso, o relatrio dever conter as respostas das seguintes perguntas:
a) Por que necessrio dialisar as amostras antes de correr o gel?
b) Qual a razo de se fazer um gel de empilhamento em cima do gel de separao?
c) Qual o papel do SDS?
d) Como o peso molecular calculado se compara com o peso molecular estimado por outros
trabalhos?
e) Elabore uma hiptese de como a maltose funciona como um inibidor da -glicosidase.

24